观察与定量成纤维细胞介导的纤维蛋白凝胶收缩

摘要

采用延时显微镜和图像处理技术，在环境可控的生物反应器中对成纤维细胞介导的凝胶收缩及纤维蛋白纤维重排进行为期48小时的观察与分析 时期。

摘要

嵌入胶原蛋白和纤维蛋白凝胶中的细胞会附着于凝胶纤维并对其施加牵引力。这些力可导致凝胶微结构的局部和整体重组与重新排列。该过程以一种复杂的方式进行，部分取决于细胞的位置、凝胶的几何形状以及对凝胶施加的力学约束之间的相互作用。为了更好地理解这些变量如何产生整体纤维排列模式，我们采用延时微分干涉差（DIC）显微镜结合环境可控的生物反应器，观察几何排布的外植体（成纤维细胞簇）之间的收缩过程。随后利用定制的图像处理算法分析图像，获得应变分布图。通过该技术获取的信息可用于探究多种细胞-基质相互作用的力学生物学特性，这对于理解伤口愈合、疾病发展以及组织工程应用中的相关过程具有重要意义。

引言

研究细胞-基质相互作用的重要工具之一是细胞接种的胶原凝胶^1,2。该凝胶提供了一种三维环境，相较于传统的二维培养，更接近组织的体内特性，更有利于理解细胞行为³。早期研究发现，当成纤维细胞均匀分布于胶原凝胶中时，细胞会迅速聚集胶原纤维并使凝胶收缩致密^4,5。在自由漂浮的凝胶中，收缩性成纤维细胞在凝胶完全收缩后很快进入静息状态^1,6,7。而在边界受限的凝胶中，成纤维细胞则保持在活跃的合成状态⁸ ，并根据凝胶几何形状和外部约束条件产生纤维定向排列^5,9。细胞活性的差异似乎源于细胞通过整合素对凝胶内胶原纤维施加牵引力时所产生的内部张力（或张力缺失）。

该技术的一种变体涉及将成纤维细胞外植块（i.e. 细胞团）以一定间距置于胶原凝胶中，观察细胞-基质相互作用以及外植块之间纤维逐渐定向排列的现象（有时称为类韧带样条带）^10-12。外植体系统的主要优势在于，它可将细胞排列成简单的几何图案，从而更易于观察和探究细胞驱动纤维重排的潜在机制。这些排列模式——主要取决于细胞牵引力、细胞空间分布、凝胶几何形状以及凝胶所受机械约束之间的相互作用——对于理解组织的全局结构、力学功能及局部力学微环境具有核心意义¹³。

在组织....

方案

1. 模板制备

在Parafilm上制备一个模板，用于确定每个外植体的位置，按照所需的几何形状排列（图1A和1B）。每个外植体之间间隔约1-2 mm。此距离对应于在外植体之间形成纤维定向排列的理想间距。用胶带将模板固定在盖玻片上待制备样品区域的下方。

2. 灭菌

实验前，使用70%乙醇彻底清洁生物反应器的所有组件，并在紫外光下灭菌2-3小时。若使用其他容器替代生物反应器，则应采用适当的灭菌技术。有关使用玻璃底培养皿的说明，请参见步骤4.12。

3. 纤维蛋白凝胶制备

在生物反应器各组件灭菌后，于盖玻片表面浇铸一层薄薄的纤维蛋白凝胶。制备用于生成 6.6 mg/ml 纤维蛋白凝胶的纤维蛋白原和凝血酶储备溶液的详细步骤见 Sander et al.¹³ 。Ye et al.¹⁹ 提出的制备 3.3 mg/ml 纤维蛋白凝胶的类似方案也可在 JoVE 网站上查阅。

1. 在离心管中将 0.017 ml 的荧光微珠原液与 0.149 ml DMEM 混合，配制....

结果

组织重塑是一个复杂的过程，部分由细胞与周围基质之间的相互物理作用所驱动。细胞会重新排列周围的纤维，并在纤维网络中产生张力。纤维的取向和力学环境反过来又调控细胞行为，从而使细胞和基质共同发生全局性重排，形成重塑后的组织。在本实验中，最初呈圆形形态的外植块细胞开始向凝胶内延伸，并黏附于纤维蛋白纤维上（图 3）。细胞施加的牵引力通过凝胶传播，诱导纤维沿外植块之间的轴线方向平行排列。数小时内，“带状”结构变得可见（图 3A）。应变测量结果也表明，最大应变出现在垂直于外植游戏副本轴线的方向上（图 3D 和 图 3E）。该区域的应变最高，是因为此区域的纤维可自由地向轴线方向移动。

本方案为研究细胞诱导的基质重塑以及纤维取向对细胞行为的影响提供了一个简便的模型。利用细胞外植体可简便地控制细胞簇的空间分布即 外植体）。外植体还能集中细胞产生的作用力，从而在较小区域内快速形成纤维排列，便于成像观察。随后利用对外植体及其周围区域拍摄的高分辨率拼接图像.......

讨论

本方案旨在观察和量化细胞介导的细胞外基质（ECM）重塑过程中所涉及的力学机制。此类过程是多种生物学现象的基础，并在组织工程^2,22、减少瘢痕形成^1,23以及理解病理性组织重塑^12,24等方面具有重要意义。使用延时微分干涉差（DIC）显微镜技术，可解析并量化由细胞牵引力引起的纤维蛋白纤维的位移与排列情况。此处观察到的重组现象是重塑过程的第一阶段，其组织模式与胶原蛋白中观察到的模式一致¹¹。重组之后，将伴随发生纤维蛋白降解与细胞外基质合成的共同作用。重塑过程中的重组阶段通常持续数小时至数天，而合成阶段则需要数周时间才能完成¹³。本文所描述的系统可连续运行数周，因此可被调整用于监测这些后期事件。

对该技术的可能改进包括改变外植体的位置、数量和大小，以创建不同的几何形状并观察排列模式的差异。外植体也可通过将其置于纤维蛋白层之间，而非表面，包埋于凝胶内部。其他改进方法可能涉及使用其他可形成纤维的凝胶替代纤维蛋白，例如胶原蛋白，或添加其他细胞外基质蛋白，如纤连蛋白或透明质酸。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Sigma-Aldrich	F8630
Sigma-Aldrich	T4648
Gibco	11965-092
Gibco	15140-122
Sigma-Aldrich	A2942
Sigma-Aldrich	H0887
Sigma-Aldrich	223506
Gibco	25200-056
Invitrogen	3000
Lonza	DE14-701F
Molecular Probes	F8858
GIBCO	A10483-01
GIBCO	11430-030
Fisher-Scientific	SS264-1
Sigma-Aldrich	A3428-25MG
Biotense Bioreactor	ADMET
Ti-Eclipe 显微镜	Nikon
#0 35 mm 玻璃底培养皿	MatTek	P35G-0-20-C
#0 35 mm 玻璃顶培养皿	MatTek	P35GTOP-0-20-C
塑料鲁尔接头，带鲁尔端的PVC管	Cole-Parmer	30600-65