我们开发了一种 体外 模拟尿路致病性感染期间膀胱急性炎症反应重要组分的模型 大肠杆菌跨尿路上皮中性粒细胞迁移实验可用于定量评估人中性粒细胞在细菌感染或趋化物质刺激下，穿过置于可渗透支持物上培养的膀胱上皮细胞的迁移能力。
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摘要
摘要
将免疫细胞从外周募集到炎症部位是任何黏膜表面先天免疫反应的关键步骤。在膀胱感染过程中，多形核白细胞（PMN；中性粒细胞）从血液中迁移并穿越膀胱上皮。若缺乏中性粒细胞反应，则无法清除感染，这表明PMN在膀胱防御中的重要性。为促进在膀胱上皮的定植，尿路致病性 大肠杆菌 尿路致病性大肠杆菌（UPEC）是大多数尿路感染（UTIs）的致病菌，其通过多种尚未完全明确的机制抑制急性炎症反应。为进一步研究宿主与细菌病原体之间的相互作用，我们建立了一种 体外 该模型用于研究先天免疫应答中针对尿路致病性大肠杆菌（UPEC）的这一方面。在经尿路上皮中性粒细胞迁移实验中，采用改良的Boyden小室法，将培养的膀胱上皮细胞生长于可渗透支持物的底侧直至形成融合单层。从中性粒细胞（PMN）自人静脉血中分离后，接种于膀胱上皮细胞层的基底外侧。通过血细胞计数板计数PMN向顶侧迁移的数量，以反映在细菌感染或趋化因子分子刺激下生理相关的基底外侧至顶侧迁移方向。该模型可用于研究UPEC与真核细胞之间的相互作用，并探究PMN穿越膀胱上皮过程中的分子需求。经尿路上皮中性粒细胞迁移模型将有助于进一步理解膀胱中针对UPEC的初始炎症反应。
引言
细胞在体内通常需要长距离迁移，以实现生长发育、伤口愈合以及免疫应答。细胞迁移是一个复杂的过程，需要多种不同机制的协调，包括信号级联反应和细胞骨架组分的重排。细胞可以进行随机运动（趋化运动），也可以沿着特定的化学梯度方向移动（趋化性）。目前已开发出多种技术用于体外研究细胞迁移。in vitro 最古老且最常用的技术是Boyden小室法，该方法采用垂直的双室系统，将趋化因子置于下室，待研究的细胞置于上室1。通过监测细胞穿过分隔两室的多孔通透性滤膜（孔径大小固定）的迁移情况来评估迁移能力。此外，还发展了其他研究细胞迁移的技术，包括Zigmond小室2和Dunn小室3。这些方法 collectively 为理解多种不同类型细胞的运动机制提供了重要见解。
除了研究趋化运动和化学趋向性的基本原理外，双室实验还促进了细胞通过细胞外基质成分以及内皮和上皮细胞层迁移的研究。相较于其他技术，双室系统的一个优势在于其多孔膜可包被胶原或纤维蛋白原等蛋白质，从而可评估细胞穿越类似细胞外基质屏障的迁移能力。此外，可在通透性支持物上培养并分化细胞系。为研究细胞穿越内皮屏障的运动，可将培养的内皮细胞接种并生长于通透性支持物的上室。然后将运动性细胞（如免疫细胞）加入上室，观察其穿越内皮屏障向生理性的顶-基底外侧方向迁移至下室的过程。该模型在理解免疫细胞从血液循环中渗出（extravasation）方面具有重要价值。与跨内皮迁移不同，细胞穿越上皮屏障的运动通常以基底外侧-顶侧方向进行。为模拟这些事件 体外研究人员将培养的上皮细胞接种并生长在可渗透支持物的下表面，运动性细胞则被添加到上方储液室中，监测细胞跨越上皮屏障的迁移过程，即代表从基底侧到顶侧的方向。这类跨上皮迁移模型极大地促进了我们对黏膜表面（尤其是肺部和肠道）炎症反应的理解。4,5.
相比之下，免疫细胞通过尿路上皮的迁移过程受到的关注要少得多。为进一步了解尿路致病菌感染期间尿路中先天免疫应答的机制 大肠杆菌 （尿路致病性大肠杆菌，UPEC），我们开发了一种 体外 检测方法、跨尿路上皮中性粒细胞迁移检测，可用于研究多形核白细胞（PMN；中性粒细胞）穿过膀胱上皮屏障的迁移运动 6-8与其他双室跨上皮迁移模型类似，将培养的人膀胱上皮细胞生长于可渗透支持物的底侧，形成融合的上皮层。从静脉血中分离的人中性粒细胞被施加于上皮层的基底外侧，随后在感染不同菌株的情况下，定量分析中性粒细胞在生理相关的基底外侧至顶端方向上跨上皮迁移的情况 E. coli 或趋化分子的存在。以往大量研究集中在不存在其他细胞类型时中性粒细胞的运动行为，包括化学趋向性（chemokinesis）和趋化性（chemotaxis）。跨尿路上皮中性粒细胞迁移实验的优势在于，它能够考虑感染过程中膀胱上皮细胞与免疫细胞之间的复杂相互作用。该实验体系具有可操作性 体外 该模型有望促进对尿道上皮表面免疫反应的深入研究。
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方案
1. 培养5637膀胱上皮细胞
在经过紫外线照射并用70%乙醇擦拭的超净工作台中进行以下步骤。
- 配制含有10%胎牛血清（FBS）的RPMI-1640培养基（称为RPMI+），使用0.22 µm孔径滤器过滤除菌，并在37 °C水浴中预热。
- 在37 °C水浴中解冻一管5637细胞（美国模式培养物集存库HTB-9；源自膀胱癌），迅速将解冻后的细胞转移至含有20 ml RPMI+的75 cm2组织培养瓶中。
- 将培养瓶置于37 °C、含5% CO2的湿润环境中培养，直至细胞融合度达到约95%（每瓶约6 × 106个细胞），大约需要4天。
- 传代培养5637细胞的操作如下：
- 移除培养瓶中的培养基，用10 ml室温的Dulbecco磷酸盐缓冲液（DPBS）洗涤细胞。
- 向培养瓶中加入6 ml预热（37 °C）的0.05%胰蛋白酶和0.02% EDTA溶液，在37 °C、含5% CO2条件下孵育15分钟。
- 将细胞转移至15 ml锥形管中，在300 × g离心5分钟形成细胞沉淀，弃去胰蛋白酶/EDTA溶液。
- 用6 ml RPMI+重悬细胞（细胞浓度为106个/ml），取1 ml（含106个细胞）接种至新的含有20 ml RPMI+的75 cm2培养瓶中。
- 每4天或当细胞融合度达到95%时，重复步骤1.4进行细胞传代。
2. 在可渗透支持物上接种并培养 5637 细胞
使用无菌技术在组织培养罩内进行以下步骤。为获得最佳结果，请使用传代次数少于10代的5637细胞。
- 使用无菌镊子将可渗透支持物倒置放入无菌的25 mm深组织培养皿中。
- 按照步骤1.4.1–1.4.3，对一个95%融合度的75 cm2培养瓶中的5637细胞进行胰蛋白酶消化处理。
- 使用1,000 µl移液器，用约2 ml RPMI+培养基轻柔重悬细胞，调整细胞浓度至3 × 106 cells/ml，该浓度通过血细胞计数板计数确定。
- 取50 µl细胞悬液（含1.5 × 105个细胞）加入每个可渗透支持物上，注意勿接触膜表面。盖上培养皿盖，小心将其置于37 °C、5% CO2培养箱中，培养时间不超过16小时。
- 使用无菌镊子将可渗透支持物正置放入24孔板中，每孔含0.6 ml RPMI+培养基。向每个可渗透支持物的上室加入0.1 ml RPMI+培养基。于37 °C、5% CO2条件下孵育。
- 每2天更换一次培养基。首先吸除上室的培养基，再吸除下室的培养基，然后按相反顺序加入新鲜RPMI+培养基：先加入下室（0.6 ml），再加入上室（0.1 ml）。
- 在将5637细胞接种至可渗透支持物7天后，评估细胞融合度。向上室加入RPMI+培养基（约0.35 ml）。当培养基无法在上室与下室之间平衡时，表明细胞已达到足够融合度。
3. 细菌接种物的制备
- 采用无菌技术，将 20 ml 适当的培养液加入带有瓶盖的 250 ml 三角瓶中。大肠杆菌（E. coli）培养使用 LB（Luria-Bertani）培养液，并根据需要在培养液中添加抗生素。
- 使用无菌接种环，从甘油保存菌种或划线平板中接种细菌至培养液中。对于尿路致病性大肠杆菌（UPEC）菌株，将细菌培养物在 37 °C 下孵育约 16 小时，不振荡（以促进 I 型菌毛的产生）。
- 将细菌培养物转移至离心管中，在 8,000 × g 条件下离心 10 分钟，使细菌沉淀。
- 弃去上清液，用 PBS 重悬细菌，调节 OD600 至 1.000，相当于约 ~109 CFU/ml。
- 为制备热灭活细菌刺激物，取重悬细菌的一部分（例如 约 150 µl 中含 1.5 × 108 CFU）于 55 °C 孵育 30 分钟。取部分热灭活菌悬液进行平板培养，以确认细菌已完全灭活。
- 使用前立即在微量离心管中用预热的无血清 RPMI 培养基（称为 RPMI-）将重悬的细菌（活菌或热灭活菌）稀释 10 倍，至终浓度为 108 CFU/ml。
4. 从外周血中分离人中性粒细胞
采集成人志愿者的血液样本前，必须经过机构审查委员会的预先审查和批准。应穿戴适当的个人防护装备，并妥善处理危险材料，以避免接触人血。
- 应由经过静脉采血培训的工作人员，将约 25 ml 健康成年志愿者的静脉血采集至 3 支无菌含肝素钠的采血管中。
- 将橡胶止血带紧紧缠绕在上臂肘部上方。
- 使用无菌 70% 酒精棉片消毒穿刺部位，即肘前窝区域。
- 将塑料试管 holder 连接至带翼蝴蝶针系统。
- 将针头以 30° 或更小的角度刺入肘前静脉，针尖斜面朝上。当塑料导管中出现血液喷射时，表明针头已刺入静脉。
- 将采血管插入塑料试管 holder 中。当第一支采血管充满后，更换为第二支采血管，随后重复操作第三支。
- 当第三支采血管约半满时，松开并移除止血带。
- 用无菌棉球覆盖穿刺点，并缓慢将针头从静脉中拔出。将针头保护套滑过针头，随后将针头放入生物危害锐器容器中。
- 对穿刺点施加压力，并用胶带绷带覆盖穿刺点和棉球。
- 轻柔地倒置采血管数次，以充分混匀肝素。
使用无菌技术，在组织培养罩内进行以下步骤。
- 使用 10 ml 移液管，将血液轻柔转移至新的无菌 50 ml 锥形管中。加入等体积的 3% (w/v) 右旋糖酐溶液（溶于 0.9% NaCl），通过倒置混匀。将管子直立，室温孵育 20 分钟。
- 避免扰动下层，小心吸走上层液体，并转移至新的 50 ml 锥形管中。在 300 × g 条件下离心 10 分钟，沉淀细胞。弃去上清液。
- 用与起始血液体积相等的 0.9% NaCl 重悬细胞沉淀。
- 在细胞悬液下方小心加入 10 ml 密度梯度离心液，保持两相之间的界面清晰。在无刹车条件下，400 × g 离心 30 分钟。弃去上清液。
- 为裂解残留的红细胞，将细胞沉淀重悬于 10 ml 冷的 0.2% NaCl 溶液中。孵育 30 秒后，立即加入 10 ml 冷的 1.6% NaCl 溶液以恢复等渗状态。
- 在 300 × g 条件下离心 6 分钟，沉淀细胞。弃去上清液。
- 重复步骤 4.6–4.7，直至细胞沉淀中基本无红细胞，通常需进行 3 轮裂解。
- 使用 1,000 µl 移液管，将主要为中性粒细胞（PMN）的细胞沉淀重悬于预热（37 °C）的 RPMI 培养基中，调整细胞浓度至 107 个细胞/ml（通过血细胞计数板计数确定）。将细胞置于 37 °C 环境中待用。通常，通过台盼蓝排斥法和染色后核形态观察评估，PMN 的存活率和纯度均>99%。
5. 跨尿道上皮中性粒细胞迁移实验
在超净工作台中使用无菌技术进行以下步骤。仅使用经步骤2.7确定已形成融合单层的5637细胞的通透性支持膜。含有RPMI的24孔板可预先准备，并在37 °C、5% CO2条件下保存至使用。
- 在24孔板中每孔加入1 ml温热的RPMI-培养基；每个可渗透支持膜准备3个孔。
- 吸除可渗透支持膜上室和下室中的培养基。
- 使用无菌镊子将可渗透支持膜转移至步骤5.1中准备好的24孔板中。通过将支持膜在各孔之间依次转移，清洗支持膜三次。
- 若使用细菌接种物，将可渗透支持膜倒置放入无菌的25 mm深组织培养皿中。若使用趋化因子（例如，N-甲酰-甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸（fMLF）或IL-8），则继续进行步骤5.6。
- 对于使用活菌或灭活细菌刺激的实验，向每个可渗透支持膜的顶端侧加入60 µl RPMI-（模拟感染）或步骤3.5中制备的细菌接种物（6 × 106 CFU）。盖上培养皿盖，于37 °C、5% CO2条件下孵育1小时。
- 在24孔低吸附培养板中每孔加入0.6 ml RPMI-；每个可渗透支持膜准备1个孔。另准备3个孔，每孔含0.5 ml RPMI-，用于计数输入的中性粒细胞（PMN）。
- 若使用趋化因子代替细菌，则将趋化因子加入步骤5.6中准备的24孔板的0.6 ml RPMI-中。
- 将可渗透支持膜正置放入24孔低吸附培养板中。
- 向每个可渗透支持膜的上室（基底外侧）加入0.1 ml在步骤4.9中制备的PMN（106个PMN）。向含有500 µl RPMI-的各孔中直接加入100 µl PMN。于37 °C、5% CO2条件下孵育1小时。
- 使用无菌镊子，轻轻将可渗透支持膜的膜面在孔边缘刮擦，以去除顶端侧残留的额外PMN，随后弃去支持膜。
- 用1,000 µl移液枪头轻轻刮取每孔底部，收集PMN，并将PMN悬液转移至微量离心管中。
- 使用血细胞计数板对PMN进行计数。
- 为计算下室中PMN的总数，将1 mm2（100 nl）内的PMN数量乘以6,000。数据可表示为输入PMN的百分比，或标准化为每106 输入PMN的PMN数量。
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结果
跨尿路上皮中性粒细胞迁移实验可用于定量评估人多形核中性粒细胞（PMN）在不同刺激因素作用下穿过培养的膀胱上皮细胞层的迁移能力（图1B）。尽管该实验方案较为简单，但仍存在多个可能影响PMN迁移并进而影响实验重复性的变量。在制备可渗透支持膜和PMN时，应采取措施以减少技术重复和生物学重复之间的变异性。例如，实验中仅应使用含有充分汇合的5637细胞层的可渗透支持膜。5637细胞的汇合程度通过检测液体通透性的功能实验进行评估：若加入上室的培养基迅速穿过可渗透支持膜达到平衡，则表明5637细胞尚未充分汇合，不适合用于实验；若上室液体体积保持稳定，则该可渗透支持膜可用于PMN迁移实验。我们曾在此系统中检测跨上皮电阻，细胞汇合后电阻值会略有升高；若采用此方法，需注意避免污染原本无菌的实验体系。接种后第7天5637细胞的汇合程度可能受多种因素影响，包括细胞传代次数以及接种到可渗透支持膜上的细胞数量。此外，接种过程中5637细胞在倒置位置的可渗透支持膜上孵育的时间不应超过16小时（图1A）。为获得最佳的实验重复性，应严格遵循本实验方案。最后，含有汇合5637细胞层的可渗透支持膜应在1-2...
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讨论
使用培养的膀胱上皮细胞系和新鲜分离的人中性粒细胞（PMN），我们建立了一种 体外 尿路上皮中性粒细胞迁移模型。该模型在解析尿路感染（UTI）期间先天免疫反应复杂性方面发挥了重要作用，尿路感染是一种极为常见的细菌感染，通常由尿路致病性大肠杆菌（UPEC）引起。9在膀胱感染（即膀胱炎）过程中，中性粒细胞（PMN）向膀胱腔的募集对于清除细菌至关重要10为了在炎症反应中建立立足点，尿路致病性大肠杆菌（UPEC）会延迟中性粒细胞（PMN）向膀胱的募集，从而延长了在无免疫压力条件下UPEC侵入膀胱上皮的时间窗口。6,11 该表型，即尿路致病性大肠杆菌（UPEC）在早期时间点抑制中性粒细胞（PMN）迁移的现象，在我们的实验中被观察到 体外 跨尿路上皮中性粒细胞迁移模型。感染非致病性 E. coli MG1655 引起的中性粒细胞迁移显著多于尿路致病性菌株感染 E. coli UTI89 (图 2A）；与MG1655和UTI89共感染可产生尿路致病表型（即 ...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作获得了美国国立卫生研究院（NIH）基金R01-DK080752和P50-DK064540的资助。我们感谢J. Loughman在建立该检测方法过程中所做的努力。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Transwell 小室即 可渗透支持物 | 康宁 | 3472 | 6.5 mm，3 μ微孔，聚酯膜小室 |
| BD Vacutainer 血液采集管 | Becton, Dickinson and Company (BD) | 366480 | 含肝素钠的16 mm × 100 mm × 10 ml绿色盖管 |
| BD Safety-Lok 血液采集与输注套装 | Becton, Dickinson and Company (BD) | 367281 | 21 G × 0.75 英寸针头 × 12 英寸导管 |
| BD Vacutainer 一次性非叠放式采血针持有器 | Becton, Dickinson and Company (BD) | 364815 | |
| 葡聚糖 | Sigma-Aldrich | D4876 | 从 Leuconostoc mesenteroides |
| Ficoll-Paque PLUS 密度梯度离心液 | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| 超低吸附培养板 | Corning | 3473 | 24孔，透明平底 |
| N-甲酰基-甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸（fMLF） | Sigma-Aldrich | F3506 | 用DMSO重悬至10 mM |
| 重组人 CXCL8/IL-8 | R&D Systems | 208-IL | 在 PBS 中重悬至 100 μg/ml |
参考文献
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