芽殖酵母蛋白质的提取和纯化功能研究，交互和翻译后修饰

Summary

高品质的酵母细胞提取物的制备是一个必要的分析单个蛋白质或整个蛋白质组的第一步。在这里，我们描述了一个快速，高效，可靠的同质化协议已被优化，以保持蛋白质的功能，相互作用和翻译后修饰的芽殖酵母细胞。

Abstract

珠跳动的同质化是一个快速和有效的方式来释放DNA，RNA，蛋白质和代谢产物，从芽殖酵母细胞，这是出了名的难以破坏。在这里，我们描述了使用珠磨机，均化器优化，保持的功能，相互作用的蛋白质的翻译后修饰的蛋白质的提取到缓冲区。对数生长期的细胞表达的蛋白质还给出的液体生长介质中生长。生长培养基可以补充试剂诱导蛋白表达诱导型启动子（ 如半乳糖），细胞周期阶段的同步（ 例如，诺考达唑），或抑制蛋白酶体的功能（ 例如，蛋白酶体抑制剂MG132）。细胞再沉淀，再悬浮在适当的缓冲液含有蛋白酶和/或磷酸酶抑制剂，被立即处理，或在液氮中冷冻，以供稍后使用。同质化是通过6个周期的20秒BEA的d的跳动（5.5米/秒），然后在冰上保温一分钟。通过离心分离所得到的匀浆被清除，小颗粒可通过过滤除去。由此产生的清除的全细胞提取物（WCE）沉淀，用20％三氯乙酸的总蛋白，通过SDS-PAGE，然后通过Western印迹法直接分析。提取物也适合用于亲和纯化的特定蛋白质的翻译后修饰，或共同净化蛋白的分析，检测。大多数蛋白质的纯化协议的情况下，可能需要一些酶和蛋白质的独特条件或缓冲液的组合物的纯化和其他规定的条件下可能是不稳定的或不溶性的。在后者的情况下，提出的协议可提供一个有用的起点，凭经验确定最佳的蛋白提取和纯化珠跳动策略。我们显示了提取和纯化的表位标记的SUMO E3连接酶，SIZ1，一个细胞周期调节蛋白变得SUMO化和磷酸化，以及SUMO针对性的泛素连接酶亚基，Slx5。

Introduction

酵母遗传学的令人敬畏的力量是有口皆碑的，但是从芽殖酵母， 酿酒酵母，天然蛋白的制备和分析往往是充满了问题。后者是由于相当大的机械强度和弹性的酵母细胞壁^1。已经描述了不同的手段的酶 ​​，化学，机械，和基于压力的破坏的酵母细胞获得全细胞蛋白提取物^2-6。这些技术有很大的不同，在它们的功效产生代表细胞，天然蛋白质提取物，可用于随后的分析或纯化步骤。例如，可以去除酵母细胞壁溶解酶（ 如酶解酶）和由此产生的spheroblasts会受到剪切，洗涤剂，或渗透裂解，释放蛋白。这种方法已经成功地采用了许多亚细胞分馏的起点，但它需要漫长的孵化与一些蛋白⁷的稳定性是不兼容的。

专有的化学提取的酵母细胞的蛋白质的的酵母裂解试剂（如清洁剂）是市售的，但在蛋白提取这些试剂的功效在随后的蛋白质的生化特性和其效果并不总是很清楚^8。高压均质机，通常被称为法国印刷机，有效突破首先对他们进行高压，然后挤出来通过一个小口压力细胞的酵母细胞。该技术生产出高品质的提取物，但设备是非常昂贵的，可能不适合小批量的细胞或多个样品^9。因此，机械破碎酵母细胞在珠磨机往往是原生酵母蛋白制剂¹⁰给出的方法。这项技术涉及的酵母细胞壁的机械破碎，用酸娃流下的玻璃珠，它可以与各种振动筛，旋涡仪或珠磨机进行。值得注意的是，此方法可用于同时处理多个更小的样品（1毫升或更小的细胞）。许多不同的有孔玻璃珠或珠磨机干扰矩阵现在市售扰乱几乎任何种类的细胞类型在2ml管。考虑到其他的技术和设备，珠磨机具有额外的好处，酵母细胞中的中断发生得非常快，从而有助于保持翻译后修饰，如SUMO化的，尤其是当使用蛋白酶和/或蛋白酶抑制剂与合适的缓冲液提取物的温度控制。

该协议的重点在温和的条件下，其最终目标保持蛋白质的功能，相互作用和翻译后修饰的快速，有效，可靠的内源性和过度表达的蛋白质提取。生长培养基，细胞裂解液组合物，珠磨机设置优化，保持蛋白质相互作用和SUMO化的和泛素化等翻译后修饰。

Protocol

纯化6xHis-tagged蛋白表达在芽殖酵母细胞在天然条件下

1。酵母细胞的生长和诱导蛋白表达

（修改自^2）

可选:使用对数生长的酵母培养物表达感兴趣的蛋白质，而不是下面描述的半乳糖诱导的培养。

1. 转化细胞的半乳糖⁺酵母菌株的质粒编码半乳糖诱导的6xHis标签的蛋白给出。例如，试剂列表。
2. 合适的选择性培养基（ 如 SD-尿嘧啶）在5毫升含2％蔗糖，接种转化体。孵育在30°CO / N，旋转。
3. 使稀释的O / N培养物在600nm处的光密度测量0.3（OD ₆₀₀ = 0.3），33毫升的选择性培养基中，用2％蔗糖。增长在30°C，晃动（Δ150转）。
4. 当培养已达到OD ₆₀₀ = 0.8-1.5，通过加入17毫升的3倍的YEP 6％的半乳糖（配方在表1中），以使最终浓度为1x YEP用2％的半乳糖诱导表达所需蛋白。总培养体积是现在50毫升。孵育，振摇，在30℃下5-6小时。
   注意:培养体积可以变化。在步骤1.3，稀释成所需的最终体积的三分之二的。在步骤1.4中，加入三分之一的最终体积的3倍YEP / 6％的半乳糖。
5. 测量OD ₆₀₀诱导培养物的离心Δ150-200 OD ₆₀₀单位的细胞在4℃下以5,000 rpm 5分钟
6. 重悬细胞沉淀用1 ml冰冷的1X PBS 1X蛋白酶抑制剂和转移到2毫升的螺丝帽筒。
7. 离心细胞在4℃下以15,000 rpm的1分钟倒出上清。
8. 在液氮中速冻细胞沉淀，随后立即细胞裂解或储存于-80℃下，直到进一步使用。

2。同质化的酵母细胞和蛋白质的提取

1. 前一步骤中的冷冻细胞沉淀，加入200μl的酸洗过的玻璃珠，加入500μl冰冷的裂解缓冲液（配方在表1中，或使用细胞裂解缓冲液中给出）。
2. 简言之吸取向上和向下。它不要求完全重悬细胞沉淀。冰在任何时候都保持管。
   注:枪头年底前可能会被切掉上下吹打。
3. 在4℃，地方管（S）与细胞成珠磨机，平衡，锁，并按照生产商的指示机器运行。
4. 运行含珠打浆机管（次），持续20秒，在5.5米/秒，然后放置在泥泞的冰，持续1分钟。总重复6X。
5. 清除所提取的蛋白质通过在15,000 rpm下离心15分钟，在4℃下可选:离心通过一个SpinX过滤去除小颗粒。
6. 准备样品的全细胞Extract（WCE）的感兴趣的蛋白质的Western印迹，以确认存在:
   1. 添加WCE对应的2 OD ₆₀₀单位的单元格（ 例如，5微升清零的提取物，如果200 OD ₆₀₀单位的细胞收获），于800微升20％三氯乙酸（TCA）。旋涡混合。
   2. 在4℃下以15,000 rpm离心2.5分钟倒出上清，但小心保留沉淀。
   3. 添加800微升2％三氯乙酸颗粒与涡管，然后离心2.5分钟，以15,000 rpm于4℃。倒出上清，但小心保留沉淀。
   4. 添加100微升TCA样品缓冲液（配方见表1），涡旋解散颗粒。注:如果样品缓冲液变成酸性（除了沉淀后变成黄色），加等分Δ10微升Tris碱[1M]直到样品再次是蓝色。
   5. 孵育2-5分钟，在100℃加热块。
   6. 涡AG泉充分溶解，如果仍然存在残余颗粒。用这种方法制备的颗粒饲料是出了名的难以充分溶解。这可能需要Δ10分钟涡旋颗粒完全溶解。
   7. 商店样品在-80°C，直到进一步的使用。
7. 急速冷冻，直到进一步利用剩余清除WCE在-80°C的液态氮和存储等分。

3。批量纯化蛋白酵母细胞匀浆

注:此纯化方法进行了优化，CO ^{2 +}金属亲和树脂纯化6xHis-tagged蛋白。

1. 树脂平衡
   1. 清除WCEΔ20-40 OD _600个单位的细胞制备的样品，加50-100μl的亲和树脂离心管。提取从细胞中不表达所需蛋白或一种非特异性的树脂，如直链淀粉，蛋白质可被用作控制S非特异性结合。
   2. 用1ml的洗涤缓冲液洗涤树脂5倍:翻转顶部比底部，直到树脂再悬浮，然后在每分钟5000转旋转1分钟，在4℃下吸出上清液。
      注意:如果在同一天进行提取和纯化，树脂的平衡可以在提取前进行。
2. 亲和纯化的蛋白结合
   1. 加入100-200微升的澄清的裂解液（Δ20-40 OD ₆₀₀单位），以50〜100微升的洗涤过 ​​的有孔玻璃珠，使总体积为1毫升用裂解缓冲液。
   2. 章动或摆动，在4℃孵育2-5小时。
   3. 自旋为1分钟，在5,000 rpm在4℃下
   4. 如果需要的话，除未结合的蛋白，用于随后的分析的样品的剩余的上清液。三氯乙酸沉淀详细在WCE（步骤2.6）以上。
   5. 洗树脂与结合蛋白5倍用1ml的洗涤缓冲液在5,000 rpm，1分钟，然后通过旋4℃下在洗涤过程中保持样品冷。
3. 洗脱结合蛋白
   1. 树脂加入150μl的洗脱缓冲液，章动，在4℃下5分钟，自旋为1分钟，在5,000 rpm在4℃下保存一个新的管中的上层清液。可选:重复2倍和游泳池洗脱。
   2. 准备洗脱样品的Western blot分析:将25μl洗脱的蛋白质，加入25μl的2倍的锂十二烷基硫酸钠（LDS）样品缓冲液中与2μl的β-巯基乙醇（BME），并在100℃的加热块中孵育2分钟。
      注意:也可以使用标准的2X Laemmli样品缓冲液。
   3. 速冻多余洗脱蛋白在液氮。
      可选:带材的剩余树脂的蛋白质与等体积的2×LDS样品缓冲液中于65℃下进行5分钟，取出LDS洗脱的蛋白质，以一个新的管，然后加入2微升的BME的洗脱蛋白，而不是到树脂。此命令是为了防止拆除任何离子或抗体共轭到珠。
   4. 样品储存在-80°C，直到进一步利用。
4. 可视化蛋白质印迹和探针与相应的抗体 。
   1. 装入10-20μl的各样品给出的SDS-PAGE凝胶中的蛋白质入水口和3-10微升（Δ1-3 OD ₆₀₀单位）。常规用于此协议包括4-12％的Bis-Tris和8％Tris-甘氨酸凝胶。
   2. 在200伏50分钟运行凝胶。
   3. 半干转移蛋白质从凝胶转移到PVDF膜上，在19伏特，约20-30分钟（在表1中的配方）。
   4. 1小时RT或O / N挡膜在4％milk/1x的Tris缓冲生理盐水吐温（TBST）在4°C（配方见表1）。
   5. 在4℃下孵育膜与初级抗体的表位标记的感兴趣的蛋白在4％milk/1x，TBST为1-3小时，在室温下或O / N
   6. 各5分钟，用1×TBST洗膜3倍。
   7. 适当的孵育膜次级辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗体为1-3小时，在RT。
   8. 为各15分钟，在一个大的体积为1x TBST洗膜3倍。
   9. ，ECL底和包裹在保鲜膜覆盖膜。
   10. 公开膜膜，并开发可视化蛋白质。

Results

我们的代表性的结果揭示了用于各种下游应用（总结在表2）的蛋白质的制备重现性，所描述的珠跳动和蛋白质提取协议是有用的。然后通过考马斯亮蓝染色的WCEs的SDS-PAGE表明，蛋白质（〜12> 250 kDa）的广泛的可再现性地从酵母细胞中（ 图1A）萃取。分子量在一定范围内的离散频段的优质蛋白质提取物的指标。提取物的质量可以针对特定抗原标记的蛋白质免疫印迹证实。所示的是具有代表性的结果为半乳糖的高表达，V5标签的SUMO连接酶SIZ1在Δ120kDa（ 图1B）迁移。一般来说，部分降解的蛋白质会运行为多个片段低于预期的重量，但这里只观察全长蛋白。此外，高分子量的给定的蛋白质的加合物可能表明翻译后修饰。例如，我们显示半乳糖过量表达的的SUMO化Siz1Δ440全长SIZ1（ 图1C和图1D）。修改也可以被保留于内源性表达的SIZ1（ 图1E）。

我们提供有代表性的结果，两个核浓的...

Discussion

该协议的重点编制完整的，原生的，和翻译后修饰的蛋白质从芽殖酵母细胞为下游应用。然后再尝试该协议，以确定是否可以很容易地在变性条件下¹²制备的蛋白提取物中检测到感兴趣的蛋白质，这是至关重要的。如果不可用多克隆抗体，它可能是有利的，使感兴趣的蛋白质的表位标记的融合蛋白的Western印迹上可检测到。在本协议中，我们标记SIZ1与医管局的6xHis-V5，或myc表位的标签，这一战略使我们能够清楚地识别蛋白质和SUMO化形式在西方墨点法（ 图1）。我们成功检测GFP标记的蛋白质，可能是因为很难得到的高亲和性抗GFP抗体（数据未示出）。另一个关键的问题是关于感兴趣的蛋白质的表达水平。个别水平蛋白质有很大的不同在出芽酵母细胞中，一些蛋白质过度，这样他们可以被检测和/或纯化的。半乳糖诱导的载体可用于感兴趣的²的酵母基因的高水平表达。 SIZ1的情况下，我们能够检测到的全长或截短的蛋白表达时的染色体标记的ORF的强烈诱导半乳糖启动子的控制下表达的质粒（ 图1）。使用截断的结构/功能分析中可能是有用的或全长分子时，难以表达的...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Omni Bead Ruptor 24	Omni International	19-010
酵母 ORF 菌株	ThermoScientific	YSC3869	可用于诱导和提取的 GAL+ 酵母菌株
pYES2.1 TOPO 载体	Life Technologies	K4150-01	GAL+ 酵母菌株，可用于诱导和提取;包含 V5/6xHIS 标签
Halt 蛋白酶抑制剂一次性混合物 （100x）	Thermo Scientific	1860932
2.0 ml 带系系螺帽的裙边管	BioExpress	C-3369-3	确保管子正确安装在珠子破裂器
中 玻璃珠，酸洗，425-600 和微量;m （30-40 美式筛）	Sigma-Aldrich	G8772
康宁 Costar Spin-X 离心管过滤器	Sigma-Aldrich	CLS8161	用于对澄清的裂解物进行额外过滤
TALON 金属亲和树脂	Clontech	635502	用于纯化 6xHIS 标记蛋白
NuPAGE LDS 样品缓冲液 （4x）	Life Technologies	NP0007	在 SDS-PAGE 和蛋白质印迹之前制备和/或洗脱样品
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel	Life Technologies	NP0321BOX	蛋白质印迹前通常用于 SDS-PAGE 的预制凝胶
Simply Blue	Life Technologies	#LC6060	蛋白质凝胶染色
哺乳动物裂解缓冲液	Promega	G9381	替代商业裂解缓冲液
抗 V5 琼脂糖	Sigma	A7345	免疫沉淀方法
ECL	Millipore	WBKL S0 050
PVDF 膜	Millipore	IPVH00010
BIS-TRIS 凝胶	Life Technologies	NP0321BOX
抗 myc 抗体	Covance	mms-150R
二抗	Abcam	ab97040	山羊 pAb 对小鼠 IgG （HRP）