用于研究功能、相互作用及翻译后修饰的芽殖酵母蛋白质提取与纯化

摘要

制备高质量的酵母细胞提取物是分析单个蛋白质或整个蛋白质组的必要第一步。本文介绍一种快速、高效且可靠的酿酒酵母细胞匀浆方案，该方案经过优化，可有效保持蛋白质功能、相互作用以及翻译后修饰。

摘要

通过珠磨法均质化是一种快速高效的方法，可从出芽酵母细胞中释放DNA、RNA、蛋白质和代谢物，而这类细胞以难以破碎著称。本文描述了使用珠磨均质器将蛋白质提取到优化缓冲液中的方法，这些缓冲液可维持蛋白质的功能、相互作用及其翻译后修饰。表达目标蛋白的对数生长期细胞在选定的液体培养基中培养。培养基中可添加试剂以诱导可诱导启动子（例如半乳糖）驱动的蛋白表达、同步细胞周期阶段（例如诺考达唑）或抑制蛋白酶体功能（例如 MG132）。随后将细胞离心成团，并重悬于含有蛋白酶和/或磷酸酶抑制剂的适当缓冲液中，可立即处理，或在液氮中速冻后保存以备后续使用。均质化过程通过六轮每轮20秒 的珠磨（5.5 m/sec）完成，每轮后在冰上孵育1分钟。所得均质液经离心澄清，小颗粒可通过过滤去除。得到的澄清全细胞提取物（WCE）使用20%三氯乙酸（TCA）沉淀，以便通过SDS-PAGE电泳结合Western印迹法直接分析总蛋白。该提取物也适用于特定蛋白的亲和纯化、翻译后修饰的检测或共纯化蛋白的分析。与大多数蛋白纯化方案一样，某些酶或蛋白可能需要独特的条件或缓冲液组成才能有效纯化，而另一些蛋白可能在所述条件下不稳定或不溶。在后一种情况下，本方案可作为经验性确定最佳珠磨策略以进行蛋白提取与纯化的有用起点。我们展示了表位标签标记的SUMO E3连接酶Siz1（一种受细胞周期调控、可发生SUMO化和磷酸化的蛋白）以及SUMO靶向泛素连接酶亚基Slx5的提取与纯化过程。

引言

酵母遗传学的强大功能堪称传奇，但从酿酒酵母中分离和分析天然蛋白质的方法却 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） 常常伴随着诸多问题。后者是由于酵母细胞壁具有较强的机械强度和弹性所致¹已报道多种用于裂解酵母细胞以获取全细胞蛋白提取物的方法，包括酶法、化学法、机械法和基于压力的裂解方法。 ^2-6这些技术在获取具有细胞代表性且保持天然状态的蛋白质提取物方面的效率差异很大，而这些提取物可用于后续的分析或纯化步骤。例如，可以使用溶菌酶去除酵母细胞壁例如 zymolyase）处理后形成原生质球，可通过剪切力、去垢剂或渗透裂解等方式破碎，从而释放蛋白质。该方法已被成功用作多种亚细胞组分分离的起始步骤，但其需要较长的孵育时间，可能与某些蛋白质的稳定性不相容。⁷.

用于化学提取酵母细胞蛋白质的专有酵母裂解试剂（如去污剂）可从商业途径获得，但这些试剂在蛋白质提取中的效率及其对后续蛋白质生化表征的影响并不总是明确⁸。高压均质器（常被称为法式压榨器）通过先将细胞置于高压下，再将其从压力室的小孔中挤出，从而有效破碎酵母细胞。该方法可获得高质量的提取物，但设备价格昂贵，且可能不适用于少量细胞或多个样品的处理⁹。因此，使用珠磨机进行机械破碎通常是制备天然状态酵母蛋白的首选方法¹⁰。该技术利用经酸洗的玻璃珠机械破坏酵母....

方案

在天然条件下纯化芽殖酵母细胞中表达的6xHIS标签蛋白

1. 酵母细胞的培养与蛋白表达的诱导

（改编自²）

可选：使用表达目标蛋白的对数生长期酵母培养物，替代下文所述的半乳糖诱导培养物。

1. 将 Gal⁺ 酵母菌株的细胞转化至含有编码目标 6xHIS 标签蛋白的质粒中，该蛋白由半乳糖诱导表达。例如，参见试剂列表。
2. 在含有 2% 蔗糖的 5 ml 适当选择性培养基（例如 SD-尿嘧啶）中接种转化子。30 °C 恒温振荡培养过夜（O/N）。
3. 将过夜培养物稀释至 33 ml 含 2% 蔗糖的选择性培养基中，使 600 nm 处的光密度值为 0.3（OD₆₀₀ = 0.3）。30 °C 振荡培养（Δ150 rpm）。
4. 当培养物 OD₆₀₀ 达到 0.8–1.5 时，加入 17 ml 含 6% 半乳糖的 3x YEP 培养基（配方见表 1），以诱导目标蛋白表达，最终浓度为含 2% 半乳糖的 1x YEP。此时总体积为 50 ml。30 °C 继续振荡培养 5–6 小时。
   注意：培养体积可调整。在步骤 1.3 中，将过夜培养物稀释至最终体积的三分之二；在步骤 1.4 中，加入最终体积三分之一的 ....

结果

我们的代表性结果表明，所述的珠击破碎和蛋白质提取方案可用于多种下游应用的蛋白质可重复制备（总结见表2）。对全细胞提取物（WCE）进行SDS-PAGE电泳并经考马斯亮蓝染色后显示，可从酵母细胞中稳定地提取出分子量范围广泛（约12至>250 kDa）的多种蛋白质（图1A）。在不同分子量范围内出现清晰条带，表明所获得的蛋白质提取物质量较高。可通过针对特定表位标签蛋白的免疫印迹（western blotting）进一步验证提取物的质量。图中展示了一个代表性结果：在半乳糖诱导下过表达的、带有V5标签的SUMO连接酶Siz1，其迁移位置约为120 kDa（图1B）。通常情况下，部分降解的蛋白质会在预期分子量下方出现多个片段条带，但在此仅观察到全长蛋白。此外，特定蛋白质出现的高分子量加合物可能提示存在翻译后修饰。例如，我们展示了在半乳糖诱导下过表达的SUMO化修饰的Siz1Δ440以及全长Siz1（图1C和图1D）。此类修饰同样可在内源性表达的Siz1上得以保留（图1.......

讨论

本实验方案重点介绍如何从芽殖酵母细胞中制备完整、天然且经过翻译后修饰的蛋白质，用于后续应用。在实施本方案之前，至关重要的是需先确定目标蛋白是否可在变性条件下制备的蛋白提取物中被 readily 检测到¹²。若无法获得针对目标蛋白的多克隆抗体，则可考虑对目标蛋白进行表位标签（epitope tag）修饰，以便在Western印迹中检测该融合蛋白。在本方案中，我们将SIZ1分别标记了HA、6xHIS-V5或myc表位标签，该策略使我们能够在Western印迹中清晰地识别目标蛋白及其SUMO化修饰形式（图 1）。相比之下，我们检测GFP标签蛋白的效果较差，可能是因为高亲和力的抗GFP抗体难以获得（数据未显示）。另一个关键问题是目标蛋白的表达水平。在芽殖酵母细胞中，不同蛋白的表达水平差异较大⁴，某些蛋白需要过表达才能被检测或纯化。目前已有可用于高水平表达酵母目标基因的半乳糖诱导型载体²。以Siz1为例，当其通过染色体标记的ORF表达，或由质粒上的强诱导型半乳糖启动子驱动表达时，我们均能检测到全长或截短形式的蛋白（

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Omni Bead Ruptor 24	Omni International	19-010
BG1805 中的酵母 ORF 菌株	ThermoScientific	YSC3869	可用于诱导和蛋白提取的 GAL+ 酵母菌株
pYES2.1 TOPO 载体	Life Technologies	K4150-01	可用于诱导和蛋白提取的 GAL+ 酵母菌株；含有 V5/6xHIS 标签
Halt 蛋白酶抑制剂单次使用混合液 (100x)	Thermo Scientific	1860932
2.0 ml 带裙边管及连接式螺口盖	BioExpress	C-3369-3	确保该管能正确适配珠击破碎仪
玻璃珠，酸洗，425-600 µm（30-40 美国标准筛）	Sigma-Aldrich	G8772
Corning Costar Spin-X 离心过滤管	Sigma-Aldrich	CLS8161	用于澄清裂解液的进一步过滤
TALON 金属亲和树脂	Clontech	635502	用于纯化 6xHIS 标签蛋白
NuPAGE LDS 样品缓冲液 (4x)	Life Technologies	NP0007	在 SDS-PAGE 和 Western 印迹前用于样品的制备和/或洗脱
NuPAGE 4-12% Bis-Tris 凝胶	Life Technologies	NP0321BOX	Western 印迹前常用于 SDS-PAGE 的预铸凝胶
Simply Blue	Life Technologies	#LC6060	蛋白凝胶染色剂
哺乳动物裂解缓冲液	Promega	G9381	可选的商用裂解缓冲液
抗-V5 琼脂糖	Sigma	A7345	免疫沉淀方法
ECL	Millipore	WBKL S0 050
PVDF 膜	Millipore	IPVH00010
BIS-TRIS 凝胶	Life Technologies	NP0321BOX
抗-myc 抗体	Covance	mms-150R
二抗	Abcam	ab97040	山羊多克隆抗体抗小鼠 IgG（HRP 标记）