用于研究功能、相互作用及翻译后修饰的芽殖酵母蛋白质提取与纯化

摘要

制备高质量的酵母细胞提取物是分析单个蛋白质或整个蛋白质组的必要第一步。本文介绍一种快速、高效且可靠的酿酒酵母细胞匀浆方案，该方案经过优化，可有效保持蛋白质功能、相互作用以及翻译后修饰。

摘要

通过珠磨法均质化是一种快速高效的方法，可从出芽酵母细胞中释放DNA、RNA、蛋白质和代谢物，而这类细胞以难以破碎著称。本文描述了使用珠磨均质器将蛋白质提取到优化缓冲液中的方法，这些缓冲液可维持蛋白质的功能、相互作用及其翻译后修饰。表达目标蛋白的对数生长期细胞在选定的液体培养基中培养。培养基中可添加试剂以诱导可诱导启动子（例如半乳糖）驱动的蛋白表达、同步细胞周期阶段（例如诺考达唑）或抑制蛋白酶体功能（例如 MG132）。随后将细胞离心成团，并重悬于含有蛋白酶和/或磷酸酶抑制剂的适当缓冲液中，可立即处理，或在液氮中速冻后保存以备后续使用。均质化过程通过六轮每轮20秒 的珠磨（5.5 m/sec）完成，每轮后在冰上孵育1分钟。所得均质液经离心澄清，小颗粒可通过过滤去除。得到的澄清全细胞提取物（WCE）使用20%三氯乙酸（TCA）沉淀，以便通过SDS-PAGE电泳结合Western印迹法直接分析总蛋白。该提取物也适用于特定蛋白的亲和纯化、翻译后修饰的检测或共纯化蛋白的分析。与大多数蛋白纯化方案一样，某些酶或蛋白可能需要独特的条件或缓冲液组成才能有效纯化，而另一些蛋白可能在所述条件下不稳定或不溶。在后一种情况下，本方案可作为经验性确定最佳珠磨策略以进行蛋白提取与纯化的有用起点。我们展示了表位标签标记的SUMO E3连接酶Siz1（一种受细胞周期调控、可发生SUMO化和磷酸化的蛋白）以及SUMO靶向泛素连接酶亚基Slx5的提取与纯化过程。

引言

酵母遗传学的强大功能堪称传奇，但从酿酒酵母中分离和分析天然蛋白质的方法却 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） 常常伴随着诸多问题。后者是由于酵母细胞壁具有较强的机械强度和弹性所致¹已报道多种用于裂解酵母细胞以获取全细胞蛋白提取物的方法，包括酶法、化学法、机械法和基于压力的裂解方法。 ^2-6这些技术在获取具有细胞代表性且保持天然状态的蛋白质提取物方面的效率差异很大，而这些提取物可用于后续的分析或纯化步骤。例如，可以使用溶菌酶去除酵母细胞壁例如 zymolyase）处理后形成原生质球，可通过剪切力、去垢剂或渗透裂解等方式破碎，从而释放蛋白质。该方法已被成功用作多种亚细胞组分分离的起始步骤，但其需要较长的孵育时间，可能与某些蛋白质的稳定性不相容。⁷.

用于化学提取酵母细胞蛋白质的专有酵母裂解试剂（如去污剂）可从商业途径获得，但这些试剂在蛋白质提取中的效率及其对后续蛋白质生化表征的影响并不总是明确⁸。高压均质器（常被称为法式压榨器）通过先将细胞置于高压下，再将其从压力室的小孔中挤出，从而有效破碎酵母细胞。该方法可获得高质量的提取物，但设备价格昂贵，且可能不适用于少量细胞或多个样品的处理⁹。因此，使用珠磨机进行机械破碎通常是制备天然状态酵母蛋白的首选方法¹⁰。该技术利用经酸洗的玻璃珠机械破坏酵母细胞壁，可通过多种摇床、涡旋振荡器或珠磨机完成。值得注意的是，该方法可同时处理多个较小样品（1 ml 或更少细胞量）。目前市场上已有多种不同的珠粒或珠磨破碎基质，可在 2 ml 离心管中破碎几乎任何类型的细胞。与其他技术和设备相比，珠磨法的额外优势在于酵母细胞破碎速度极快，这有助于保留翻译后修饰（如SUMO化修饰），尤其是在使用含有蛋白酶和/或蛋白酶体抑制剂的适当缓冲液并严格控制提取物温度的情况下。

本方案旨在温和条件下快速、高效且可靠地提取内源性和过表达蛋白，最终目标是保持蛋白质功能、相互作用以及翻译后修饰。通过优化培养基、细胞裂解缓冲液成分和珠磨机参数，以维持蛋白质相互作用以及类泛素化修饰（sumoylation）和泛素化修饰（ubiquitylation）等翻译后修饰状态。

方案

在天然条件下纯化芽殖酵母细胞中表达的6xHIS标签蛋白

1. 酵母细胞的培养与蛋白表达的诱导

（改编自²）

可选：使用表达目标蛋白的对数生长期酵母培养物，替代下文所述的半乳糖诱导培养物。

1. 将 Gal⁺ 酵母菌株的细胞转化至含有编码目标 6xHIS 标签蛋白的质粒中，该蛋白由半乳糖诱导表达。例如，参见试剂列表。
2. 在含有 2% 蔗糖的 5 ml 适当选择性培养基（例如 SD-尿嘧啶）中接种转化子。30 °C 恒温振荡培养过夜（O/N）。
3. 将过夜培养物稀释至 33 ml 含 2% 蔗糖的选择性培养基中，使 600 nm 处的光密度值为 0.3（OD₆₀₀ = 0.3）。30 °C 振荡培养（Δ150 rpm）。
4. 当培养物 OD₆₀₀ 达到 0.8–1.5 时，加入 17 ml 含 6% 半乳糖的 3x YEP 培养基（配方见表 1），以诱导目标蛋白表达，最终浓度为含 2% 半乳糖的 1x YEP。此时总体积为 50 ml。30 °C 继续振荡培养 5–6 小时。
   注意：培养体积可调整。在步骤 1.3 中，将过夜培养物稀释至最终体积的三分之二；在步骤 1.4 中，加入最终体积三分之一的 3x YEP/6% 半乳糖溶液。
5. 测定诱导后培养物的 OD₆₀₀，取相当于 Δ150–200 OD₆₀₀ 单位的细胞，在 4 °C 下以 5,000 rpm 离心 5 分钟。
6. 用 1 ml 冰冷的含 1x 蛋白酶抑制剂混合液的 1x PBS 重悬细胞沉淀，并转移至 2 ml 螺口管中。
7. 在 4 °C 下以 15,000 rpm 离心 1 分钟，弃上清液。
8. 将细胞沉淀在液氮中速冻，随后立即进行细胞裂解，或于 -80 °C 保存待用。

2. 酵母细胞的匀浆及蛋白质提取

1. 向上一步得到的冷冻细胞沉淀中加入200 µl经酸洗处理的玻璃珠和500 µl预冷的裂解缓冲液（配方见 表1 或使用所选的细胞裂解缓冲液。
2. 轻轻吹打混匀即可，无需完全重悬细胞沉淀。始终将离心管置于冰上。
   注意：在吹打混匀前，可将移液器吸头末端剪去。
3. 在 4 °C 条件下，将含有细胞的离心管放入珠磨机中，平衡后锁定，并按照制造商的说明运行仪器。
4. 将装有试管的珠磨机以 5.5 m/sec 的速度运行 20 秒，然后置于冰浴中 1 分钟。重复 6 次 总共。
5. 在 4 °C 条件下以 15,000 rpm 离心 15 分钟，去除提取的蛋白质中的杂质。可选：通过 SpinX 滤器离心以去除微小颗粒。
6. 制备全细胞提取物（WCE）样品，通过Western Blot检测目标蛋白的存在：
   1. 加入对应 2 OD 的 WCE₆₀₀ 细胞单位（例如 200 OD 时取 5 µl 上清提取物₆₀₀ 将细胞单位加入800 µl 20%三氯乙酸（TCA）中，涡旋混匀。
   2. 在 4 °C 条件下以 15,000 rpm 离心 2.5 分钟。小心倾去上清液，注意保留沉淀。
   3. 向沉淀中加入800 µl 2%三氯乙酸，涡旋混匀，于4 °C、15,000 rpm离心2.5分钟。小心倾去上清液，注意保留沉淀。
   4. 加入100 µl TCA样品缓冲液（配方见 表1），涡旋振荡以溶解沉淀。注意：如果样品缓冲液在加入沉淀后变为酸性（变黄），则逐次加入 Δ10 µl Tris 碱 [1M]，直至样品再次变为蓝色。
   5. 在100 °C金属浴中孵育2-5分钟。
   6. 再次涡旋震荡，以彻底溶解残留的沉淀物。采用此方法制备的沉淀物 notoriously 难以完全溶解，可能需要 Δ10 分钟的涡旋震荡才能完全溶解。
   7. 将样品在 -80 °C 下保存，直至进一步使用。
7. 将剩余的澄清WCE分装后在液氮中速冻，并于-80 °C保存，以备后续使用。

3. 从酵母细胞匀浆中批量纯化蛋白质

注意：该纯化方法针对在 Co²⁺ 金属亲和树脂上纯化 6xHIS 标签蛋白进行了优化。

1. 树脂平衡
   1. 对于由Δ20-40 OD₆₀₀单位细胞制备的澄清WCE样品，在微量离心管中加入50–100 µl亲和树脂。可使用未表达目标蛋白的细胞提取物或非特异性树脂（如淀粉树脂）作为非特异性结合的对照。
   2. 用1 ml洗涤缓冲液洗涤树脂5次：上下颠倒混匀直至树脂重悬，然后在4 °C下以5,000 rpm离心1分钟，吸除上清液。
      注意：若在同一天进行提取和纯化操作，可在提取前完成树脂平衡。
2. 亲和纯化中的蛋白结合
   1. 将100–200 µl澄清裂解液（Δ20–40 OD₆₀₀单位）加入50–100 µl已洗涤的树脂珠中，并用裂解缓冲液补足总体积至1 ml。
   2. 在4 °C下以轻微振荡或摇动方式孵育2–5小时。
   3. 在4 °C下以5,000 rpm离心1分钟。
   4. 如需要，可保留部分上清液用于后续未结合蛋白的分析。参照前述WCE样品处理方法（步骤2.6）进行三氯乙酸（TCA）沉淀。
   5. 用1 ml洗涤缓冲液洗涤结合了蛋白的树脂5次，每次洗涤后在4 °C下以5,000 rpm离心1分钟。洗涤过程中保持样品低温。
3. 结合蛋白的洗脱
   1. 向树脂中加入150 µl洗脱缓冲液，在4 °C下轻轻振荡5分钟，然后在4 °C下以5,000 rpm离心1分钟，将上清液收集至新管中。可选：重复此步骤两次，并合并洗脱液。
   2. 准备用于Western blot的洗脱样品：取25 µl洗脱蛋白，加入25 µl 2x十二烷基硫酸锂（LDS）样品缓冲液和2 µl β-巯基乙醇（BME），在100 °C金属浴中孵育2分钟。
      注：也可使用标准2X Laemmli样品缓冲液。
   3. 将多余的洗脱蛋白在液氮中迅速冷冻。
      可选：用等体积的2x LDS样品缓冲液在65 °C处理树脂5分钟以剥离残留蛋白，将LDS洗脱的蛋白转移至新管，然后向洗脱蛋白中加入2 µl BME，切勿直接加入树脂中。此顺序可防止去除与树脂珠共价结合的离子或抗体。
   4. 将样品储存于-80 °C，待后续使用。
4. Western blot并使用特异性抗体检测目标蛋白
   1. 在所选SDS-PAGE凝胶中每泳道上样10–20 µl（Δ1–3 OD₆₀₀单位）样品及3–10 µl蛋白分子量标记物。本实验常规使用的凝胶包括4–12% Bis-Tris和8% Tris-甘氨酸凝胶。
   2. 以200 V电压电泳50分钟。
   3. 采用半干转法在19 V条件下将蛋白从凝胶转移至PVDF膜，时间为20–30分钟（配方见表1）。
   4. 用含4%脱脂奶粉的1x Tris缓冲盐水-Tween（TBST）溶液在室温封闭1小时，或在4 °C过夜（配方见表1）。
   5. 将膜与针对目标表位标签蛋白的一抗在含4%脱脂奶粉的1x TBST溶液中孵育，室温1–3小时或4 °C过夜。
   6. 用1x TBST溶液洗涤膜3次，每次5分钟。
   7. 将膜与相应的辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗在室温孵育1–3小时。
   8. 用大量1x TBST溶液洗涤膜3次，每次15分钟。
   9. 将膜覆盖ECL底物后用保鲜膜包裹。
   10. 将膜曝光于X光片并显影以观察蛋白条带。

结果

我们的代表性结果表明，所述的珠击破碎和蛋白质提取方案可用于多种下游应用的蛋白质可重复制备（总结见表2）。对全细胞提取物（WCE）进行SDS-PAGE电泳并经考马斯亮蓝染色后显示，可从酵母细胞中稳定地提取出分子量范围广泛（约12至>250 kDa）的多种蛋白质（图1A）。在不同分子量范围内出现清晰条带，表明所获得的蛋白质提取物质量较高。可通过针对特定表位标签蛋白的免疫印迹（western blotting）进一步验证提取物的质量。图中展示了一个代表性结果：在半乳糖诱导下过表达的、带有V5标签的SUMO连接酶Siz1，其迁移位置约为120 kDa（图1B）。通常情况下，部分降解的蛋白质会在预期分子量下方出现多个片段条带，但在此仅观察到全长蛋白。此外，特定蛋白质出现的高分子量加合物可能提示存在翻译后修饰。例如，我们展示了在半乳糖诱导下过表达的SUMO化修饰的Siz1Δ440以及全长Siz1（图1C和图1D）。此类修饰同样可在内源性表达的Siz1上得以保留（图1...

讨论

本实验方案重点介绍如何从芽殖酵母细胞中制备完整、天然且经过翻译后修饰的蛋白质，用于后续应用。在实施本方案之前，至关重要的是需先确定目标蛋白是否可在变性条件下制备的蛋白提取物中被 readily 检测到¹²。若无法获得针对目标蛋白的多克隆抗体，则可考虑对目标蛋白进行表位标签（epitope tag）修饰，以便在Western印迹中检测该融合蛋白。在本方案中，我们将SIZ1分别标记了HA、6xHIS-V5或myc表位标签，该策略使我们能够在Western印迹中清晰地识别目标蛋白及其SUMO化修饰形式（图 1）。相比之下，我们检测GFP标签蛋白的效果较差，可能是因为高亲和力的抗GFP抗体难以获得（数据未显示）。另一个关键问题是目标蛋白的表达水平。在芽殖酵母细胞中，不同蛋白的表达水平差异较大⁴，某些蛋白需要过表达才能被检测或纯化。目前已有可用于高水平表达酵母目标基因的半乳糖诱导型载体²。以Siz1为例，当其通过染色体标记的ORF表达，或由质粒上的强诱导型半乳糖启动子驱动表达时，我们均能检测到全长或截短形式的蛋白（

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Omni Bead Ruptor 24	Omni International	19-010
BG1805 中的酵母 ORF 菌株	ThermoScientific	YSC3869	可用于诱导和蛋白提取的 GAL+ 酵母菌株
pYES2.1 TOPO 载体	Life Technologies	K4150-01	可用于诱导和蛋白提取的 GAL+ 酵母菌株；含有 V5/6xHIS 标签
Halt 蛋白酶抑制剂单次使用混合液 (100x)	Thermo Scientific	1860932
2.0 ml 带裙边管及连接式螺口盖	BioExpress	C-3369-3	确保该管能正确适配珠击破碎仪
玻璃珠，酸洗，425-600 µm（30-40 美国标准筛）	Sigma-Aldrich	G8772
Corning Costar Spin-X 离心过滤管	Sigma-Aldrich	CLS8161	用于澄清裂解液的进一步过滤
TALON 金属亲和树脂	Clontech	635502	用于纯化 6xHIS 标签蛋白
NuPAGE LDS 样品缓冲液 (4x)	Life Technologies	NP0007	在 SDS-PAGE 和 Western 印迹前用于样品的制备和/或洗脱
NuPAGE 4-12% Bis-Tris 凝胶	Life Technologies	NP0321BOX	Western 印迹前常用于 SDS-PAGE 的预铸凝胶
Simply Blue	Life Technologies	#LC6060	蛋白凝胶染色剂
哺乳动物裂解缓冲液	Promega	G9381	可选的商用裂解缓冲液
抗-V5 琼脂糖	Sigma	A7345	免疫沉淀方法
ECL	Millipore	WBKL S0 050
PVDF 膜	Millipore	IPVH00010
BIS-TRIS 凝胶	Life Technologies	NP0321BOX
抗-myc 抗体	Covance	mms-150R
二抗	Abcam	ab97040	山羊多克隆抗体抗小鼠 IgG（HRP 标记）