小鼠主动脉窦动脉粥样硬化病变的定量分析与表征

摘要

我们描述了利用主动脉窦和升主动脉的精密切片，结合组织化学和免疫组织化学分析，对小鼠模型中的动脉粥样硬化病变进行定量和表征的实验方法。

摘要

动脉粥样硬化是一种累及大动脉的疾病，是心肌梗死和脑卒中的主要潜在病因。目前已开发出多种不同的小鼠模型，以促进对该疾病分子和细胞病理生理学的研究。本文描述了用于定量和表征小鼠主动脉窦及升主动脉中动脉粥样硬化病变的具体技术。该方法的优势在于能够准确测量病变的横截面积和总体积，从而可用于比较不同处理组之间动脉粥样硬化的进展程度。这一准确性得益于利用瓣膜瓣叶作为解剖学标志，并仔细调整切片角度。我们还介绍了可用于初步表征动脉粥样硬化进展的基本染色方法。这些方法可进一步修改，以研究研究者特别关注的特定抗原。所描述的技术通常适用于多种现有及新建立的饮食诱导和基因诱导动脉粥样硬化模型。

引言

在过去的二十年中，通过饮食和/或遗传操作建立并使用易发动脉粥样硬化的鼠类模型，极大地加深了我们对动脉粥样硬化病变发生过程中所涉及的分子和细胞机制的理解^1-3。我们目前对动脉粥样硬化发生机制的大量知识和认识主要来源于载脂蛋白（Apo）-E 缺陷⁴ 小鼠的研究，这类小鼠可自发形成动脉粥样硬化病变 ，以及低密度脂蛋白受体（LDLR）缺陷⁵ 小鼠的研究，后者的动脉粥样硬化由饮食诱导产生。这些模型的一个重要优势在于，可以在严格控制的饮食和环境条件下，研究大量遗传背景明确的动物。此外，某些小鼠品系中形成的晚期动脉粥样硬化病变与人类患者中观察到的病变非常相似，均包含富含脂质的坏死核心和纤维帽。在这些小鼠模型中，动脉粥样硬化发展迅速，使得从脂肪条纹到晚期斑块的整个病变发展过程可在数周内完成研究。此外，已知的人类心血管疾病危险因素，包括糖尿病⁶、血脂异常⁷、肥胖⁸、高血压⁹、吸烟¹⁰以及久坐不动的生活方式¹¹，均已被证实可进一步加速病变的发展。

在大多数（如果不是全部）易患动脉粥样硬....

方案

麦克马斯特大学动物研究伦理委员会已预先批准本文所述的所有操作程序。

1. 心脏和主动脉的采集

1. 麻醉小鼠，并小心打开胸腔以暴露心脏和近端主动脉。
   1. 通过直接穿刺心脏右心室提取小鼠血液。
      注意：血液可储存并用于血浆脂质及其他血液携带因子的分析。
2. 通过颈椎脱位处死小鼠。
3. 用 5 ml 生理盐水冲洗血管系统。
   注意：通过左心室穿刺进行重力灌注完成冲洗。为便于引流，需在右心房做一小切口。冲洗血管系统后，可采集肝脏、肌肉和脂肪组织等组织样本，液氮速冻后于 -80 ºC 保存，以备后续分析。
4. 通过左心室重力灌注 10% 中性缓冲福尔马林固定血管系统。
   注意：开始灌注后，将 10% 中性缓冲福尔马林调节为缓慢滴流，使整个过程持续 1–2 分钟。经灌注固定的器官和组织可用于通过免疫荧光或组织化学方法研究蛋白表达，但通常不能用于 Western blot 或基因表达研究。
5. 小心从尸体中取出心脏及约 2 mm 的近端主动脉。其他组织（包括降主动脉）也可采集并储存，用于后续分析。
   注意：降主动脉（至髂总动脉分叉处）也可用于动脉粥样硬化研究。
6. 用手术刀在离体心脏上做一横向切口，切口方向垂直于升主动脉。
   注意：使用解剖显微镜有助于操作，可沿左右心房下端尖点的连线....

结果

五周龄的LDLR-/-小鼠分别喂食标准饮食或高脂饮食，持续十周。随后处死小鼠，并按上述方法用福尔马林灌注。制备主动脉窦的横切片，用苏木精和伊红染色，以确定病变区域和体积（图4）。当小鼠喂食标准饲料时，动脉粥样硬化的进展非常有限，在15周龄时可能无法检测到。高脂饮食在此模型中显著加速动脉粥样形成，并诱导产生含有无细胞坏死核心和纤维帽的大型晚期病变。

可通过染色检测特定细胞类型和影响斑块发展阶段的因素，进一步表征动脉粥样硬化病变。单核细胞浸润内膜是动脉粥样硬化发生的早期事件之一。内膜中的单核细胞分化为巨噬细胞，吞噬细胞碎片和脂质。富含脂质的巨噬细胞被称为泡沫细胞，在动脉壁内形成“脂质条纹”。

通过使用针对特定巨噬细胞标志物（包括 F4/80¹⁷、CD68¹⁸、Mac-3 (CD107)¹⁹ 和 MOMA-2²⁰ ）的抗体进行染色，可在病变发展的各个阶段检测到巨噬细胞/泡沫细胞（图5

讨论

动脉粥样硬化是一种累及大中肌性动脉的复杂慢性疾病，是心肌梗死和脑卒中的主要潜在病因。疾病进展涉及动脉壁内多种不同类型细胞之间，以及循环血细胞、脂蛋白颗粒和其他血液来源因子之间的相互作用，这些相互作用机制我们才刚刚开始了解。目前关于动脉粥样硬化发生与进展的大部分知识，均来源于专门设计的易发动脉粥样硬化的小鼠模型系统的研究。

需要牢记的是，动脉粥样硬化的小鼠模型存在一些显著的局限性。显然，与人类相比，小鼠在血管尺寸和表面积、血流、脉搏率、血压以及剪切应力等方面均存在显著差异。在大多数易发生动脉粥样硬化的小鼠模型中，并未观察到病灶破裂和动脉血栓形成——而这正是人类大多数心肌梗死的直接原因。此外，这些品系普遍缺乏遗传多样性，虽然降低了实验结果的变异性，但也对疾病病理过程引入了难以解释的人为限制。因此，在将这些小鼠模型所得数据用于解释和推断人类心血管疾病时，必须谨慎对待。尽管存在这些局限性，但得益于Cre-lox系统及其他遗传学策略推动的模型优化，以及小动物成像系统持续不断的技术进步，小鼠模型在未来多年内仍可能继续处于心血管疾病细胞与分子机制研究的前沿。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
LDLR缺陷型小鼠 (D2.129S7(B6)-Ldlrtm1Her/J)	杰克逊实验室	货号 #002207
福尔马林	西格玛-奥德里奇	HT5011
组织学模具	Ted Pella 公司	27195
石蜡	Paramat	19286-10
包被载玻片	费舍尔	12-550-15
溶剂容器	Tissue Tek II	4457
切片机	徕卡	RM22S5
水浴锅	VWR	80086-982
显微镜	奥林巴斯	BX41TF
相机	奥林巴斯	DP72
ImageJ	美国国立卫生研究院（NIH）	www.rsbweb.nih.gov/ij/
组织处理仪	Sakura Finetek	VIP6-A1
组织处理盒	VWR	18000-134
压力 cooker	Nordic Ware
盖玻片	费舍尔	12-545-M
PBS	西格玛-奥德里奇	P3813
切片机刀片	赛默飞世尔科技	30-518-35
抗荧光淬灭封片剂	西格玛-奥德里奇	F-4680
二甲苯封片剂	西格玛-奥德里奇	44581
水性封片剂	西格玛-奥德里奇	I1161
Mac-3 抗体	BD Pharmingen	553322
DAPI	西格玛-奥德里奇	D9542
F4/80 抗体	Abcam	Ab6640
α-肌动蛋白抗体	Santa Cruz Biotechnology	SC-32251
Mayer’s 苏木精	西格玛-奥德里奇	E4382
伊红 Y	西格玛-奥德里奇	MHS16
DAB（3,3'-二氨基联苯胺）	Dako	K3468