小鼠主动脉窦动脉粥样硬化病变的定量分析与表征

摘要

我们描述了利用主动脉窦和升主动脉的精密切片，结合组织化学和免疫组织化学分析，对小鼠模型中的动脉粥样硬化病变进行定量和表征的实验方法。

摘要

动脉粥样硬化是一种累及大动脉的疾病，是心肌梗死和脑卒中的主要潜在病因。目前已开发出多种不同的小鼠模型，以促进对该疾病分子和细胞病理生理学的研究。本文描述了用于定量和表征小鼠主动脉窦及升主动脉中动脉粥样硬化病变的具体技术。该方法的优势在于能够准确测量病变的横截面积和总体积，从而可用于比较不同处理组之间动脉粥样硬化的进展程度。这一准确性得益于利用瓣膜瓣叶作为解剖学标志，并仔细调整切片角度。我们还介绍了可用于初步表征动脉粥样硬化进展的基本染色方法。这些方法可进一步修改，以研究研究者特别关注的特定抗原。所描述的技术通常适用于多种现有及新建立的饮食诱导和基因诱导动脉粥样硬化模型。

引言

在过去的二十年中，通过饮食和/或遗传操作建立并使用易发动脉粥样硬化的鼠类模型，极大地加深了我们对动脉粥样硬化病变发生过程中所涉及的分子和细胞机制的理解^1-3。我们目前对动脉粥样硬化发生机制的大量知识和认识主要来源于载脂蛋白（Apo）-E 缺陷⁴ 小鼠的研究，这类小鼠可自发形成动脉粥样硬化病变 ，以及低密度脂蛋白受体（LDLR）缺陷⁵ 小鼠的研究，后者的动脉粥样硬化由饮食诱导产生。这些模型的一个重要优势在于，可以在严格控制的饮食和环境条件下，研究大量遗传背景明确的动物。此外，某些小鼠品系中形成的晚期动脉粥样硬化病变与人类患者中观察到的病变非常相似，均包含富含脂质的坏死核心和纤维帽。在这些小鼠模型中，动脉粥样硬化发展迅速，使得从脂肪条纹到晚期斑块的整个病变发展过程可在数周内完成研究。此外，已知的人类心血管疾病危险因素，包括糖尿病⁶、血脂异常⁷、肥胖⁸、高血压⁹、吸烟¹⁰以及久坐不动的生活方式¹¹，均已被证实可进一步加速病变的发展。

在大多数（如果不是全部）易患动脉粥样硬化的鼠类模型中，病变的最初出现部位通常为主动脉窦。病变发生的时间取决于小鼠品系和饮食。随着病变体积增大，其倾向于沿升主动脉向上扩展。在 ApoE-/- 和 LDLR-/- 小鼠中，随后可在主动脉弓的主动脉分叉处、降主动脉及其他较大动脉中检测到病变发展^12-14贝弗利·佩根博士及其同事不仅开发了最早的饮食诱导动脉粥样硬化模型之一，还建立了一种用于定量主动脉窦动脉粥样硬化病变的检测方法，该方法已成为小鼠模型中病变测量的标准。¹⁵多年来，该技术已得到不断完善，并被详细描述。¹⁶. 本文介绍了一种改良版本的 "佩根法" 用于小鼠动脉粥样硬化病变的定量与表征。对特定血管区域的主动脉连续横切面进行分析 并且在确定且固定的方位下，有助于精确的数据采集，并允许准确检测不同处理组间病变发展的差异。本文所述方法在先前技术的基础上建立，具体描述了如何通过连续切片的组织化学与免疫组织化学联合检测，对病变的面积、体积、坏死程度及细胞含量等特征进行表征。

方案

麦克马斯特大学动物研究伦理委员会已预先批准本文所述的所有操作程序。

1. 心脏和主动脉的采集

1. 麻醉小鼠，并小心打开胸腔以暴露心脏和近端主动脉。
   1. 通过直接穿刺心脏右心室提取小鼠血液。
      注意：血液可储存并用于血浆脂质及其他血液携带因子的分析。
2. 通过颈椎脱位处死小鼠。
3. 用 5 ml 生理盐水冲洗血管系统。
   注意：通过左心室穿刺进行重力灌注完成冲洗。为便于引流，需在右心房做一小切口。冲洗血管系统后，可采集肝脏、肌肉和脂肪组织等组织样本，液氮速冻后于 -80 ºC 保存，以备后续分析。
4. 通过左心室重力灌注 10% 中性缓冲福尔马林固定血管系统。
   注意：开始灌注后，将 10% 中性缓冲福尔马林调节为缓慢滴流，使整个过程持续 1–2 分钟。经灌注固定的器官和组织可用于通过免疫荧光或组织化学方法研究蛋白表达，但通常不能用于 Western blot 或基因表达研究。
5. 小心从尸体中取出心脏及约 2 mm 的近端主动脉。其他组织（包括降主动脉）也可采集并储存，用于后续分析。
   注意：降主动脉（至髂总动脉分叉处）也可用于动脉粥样硬化研究。
6. 用手术刀在离体心脏上做一横向切口，切口方向垂直于升主动脉。
   注意：使用解剖显微镜有助于操作，可沿左右心房下端尖点的连线直线切割完成（图 1）。
7. 将心尖（上方）部分放入包埋盒中，并浸入中性缓冲福尔马林中以备处理。

2. 主动脉的制备

1. 将含有已解剖组织的包埋盒放入组织处理机中。
2. 处理组织样本。
   注意：通常情况下，由于组织处理过程耗时较长且涉及多种试剂溶液，组织处理机被设定为在夜间自动运行。样品的处理遵循既定的实验方案：
   1. 42℃下用10%中性缓冲福尔马林固定1小时 ºC.
   2. 42℃下用10%中性缓冲福尔马林固定1小时 ºC.
   3. 70% 乙醇，40℃ 下处理 30 分钟 ºC.
   4. 85% 乙醇，40℃ 下 30 分钟 ºC.
   5. 100% 乙醇，45 分钟 40 ºC.
   6. 100% 乙醇  40℃下持续45分钟 ºC.
   7. 40℃下用100%乙醇处理45分钟 ºC.
   8. 二甲苯，40℃，1 小时 ºC.
   9. 二甲苯，40℃，1 小时 ºC.
   10. 二甲苯，40℃，1 小时 ºC.
   11. 石蜡浸泡 45 分钟 63 ºC.
   12. 63℃ 石蜡蜡浴 45 分钟 ºC.
   13. 63℃ 石蜡处理 45 分钟 ºC.
   14. 石蜡浸泡 45 分钟 在63处 ºC.
3. 在62℃下过夜熔化石蜡 ºC (图1D-E根据填充组织学模具所需的石蜡克数以及待制备的组织块数量，估算所需石蜡的总量。
   注意：与浅型组织学模具相比，更推荐使用深型组织学模具，因其在切片时可提供更大的旋转角度。一个深型组织学模具需要 11 g 石蜡。
4. 将每份处理好的组织放入深部组织学模具中，然后倒入熔化的石蜡，完全充满模具（图1F）。用带有标签的塑料盒盖住模具（图1G).
5. 将注满的模具置于冰上或冷表面上冷却，图1H)，以形成固体块并将其从模具中分离（图1I-J).
   注意：将解剖后的心脏放入模具时，应确保心脏的内面与模具底部接触，然后向模具中注入熔化的石蜡。在石蜡凝固前，用带有标签的塑料包埋盒覆盖模具，以便为包埋块提供可操作的基底。待冷却后，取下模具，石蜡包埋块可在室温下长期保存。

3. 主动脉切片

1. 将带有心脏的组织块置于切片机的样本架中，使其能够从心脏内侧向顶部方向进行切片（图2）
2. 调节切片机，使其切片厚度为 10 µm，并开始对心脏进行切片。
3. 将切片收集到载玻片上，并在光学显微镜下观察，以确定切片的位置和方向。
4. 当主动脉窦的一个或两个瓣膜开始明显可见时，根据需要调整组织块的角度（图3A）。
   注意：主动脉窦应呈现为三个具有两部分结构的瓣膜基底，并附有瓣叶。若仅观察到一个或两个瓣叶，则应相应调整切片角度。
5. 调节切片机，使其切片厚度为 4–5 µm，并将切片收集到涂覆过的载玻片上。
   注意：尽管该操作流程可作调整，但仍建议采用系统性方法，即从主动脉窦开始沿升主动脉向上连续切片，前10个切片收集到标记好的载玻片的上部区域（载玻片标记为1–10）。后续切片按相同模式收集：#11–20、#21–30、#31–40，直至不再观察到动脉粥样硬化病变为止（图3B）。通过这种方式，可在升主动脉的精确位置上对动脉粥样硬化病变进行观察和表征。例如，1号载玻片上包含第1、11、21、31、41和51号切片，代表从主动脉窦沿升主动脉分布的动脉粥样硬化病变。如果病变范围较大，可额外增加标记为11–20的载玻片，以按相同模式收集更远端的切片。
6. 持续收集切片，直至不再观察到动脉粥样硬化病变。
   注意：载玻片可在室温下保存数月，再进行后续分析。

4. 动脉粥样硬化病变的染色与定量分析

动脉粥样硬化病变可通过多种技术和方法进行分析。最基本的分析是测定病变的横截面积。为了准确比较病变面积，重要的是在各样本之间保持病变测量起始点的一致性。这可通过利用瓣膜小叶进行定位来实现。为了准确识别和定量病变区域，选择特定的横切面用苏木精和伊红染色。该过程包括将切片浸入一系列溶液中并保持指定时间，以完成脱蜡和组织染色。

苏木精-伊红染色方案：

1. 将载玻片放入空气干燥器中8分钟，然后通过洗涤4次进行脱蜡处理× 在二甲苯中，每次洗涤3分钟。
2. 用100%乙醇清洗载玻片3次× 每次3分钟。
3. 洗涤 3 次× 在70%乙醇中各孵育3分钟，然后2× 在50%乙醇中各处理3分钟。
4. 用蒸馏水冲洗，然后浸入 Mayer 苏木精染液中 15 分钟。
5. 用自来水冲洗5分钟，然后用蒸馏水冲洗5分钟。
6. 浸入伊红Y染液1-5分钟。
7. 用蒸馏水洗涤3次× 每次5分钟，用50%乙醇洗涤2次× 每次2分钟，然后70%乙醇3× 每次2分钟。
8. 用100%乙醇洗涤3次× 每次2分钟，然后在二甲苯中洗涤4次× 每次2分钟。
9. 使用基于二甲苯的封片剂封片，并在光学显微镜上安装数字相机采集图像。
10. 使用影像分析软件识别并量化病灶区域。
    注意：可在距主动脉窦 40–50 处的特定距离确定病变区域 μm 间隔（取决于每张切片的厚度）。将这些面积测量值与距离作图，可得到动脉粥样硬化病变的轮廓图。图4曲线下面积代表动脉粥样硬化病变总体积的估计值。对病变的进一步表征可包括坏死区域的测定。进展期病变的坏死核心（nc）由凋亡的泡沫细胞形成。经过训练后，可通过观察苏木精-伊红染色切片中的无细胞区域来确定坏死核心图 4A早期病变通常坏死区域极少，而较晚期病变的坏死区域增大，可能促进斑块不稳定。应检查同一主动脉的连续切片，以确认坏死区域的存在。

5. 动脉粥样硬化病变的进一步表征

通过使用针对特定细胞类型或标志物的抗体进行染色，可以确定动脉粥样硬化发展各阶段的具体细节。对石蜡切片进行免疫组织化学染色是一种标准技术，用于在未染色组织背景下识别特定的细胞类型或标志物。抗原检测通常采用辣根过氧化物酶底物来实现。

免疫荧光染色技术利用荧光素标记的抗体，需要荧光显微镜和相应的滤光片进行检测。该技术可实现两种（或多种）抗原的同时染色。

免疫组织化学染色通用方案：

1. 将载玻片放入空气干燥器中干燥8分钟。
2. 用二甲苯脱蜡，共4次，每次3分钟 每个。
3. 用100%乙醇洗涤3次× 每次3分钟，以去除二甲苯。
4. 洗涤 3 次× 在70%乙醇中各浸泡3分钟，然后2× 在50%乙醇中各处理3分钟。
5. 用蒸馏水洗涤，每次5分钟，然后洗涤3次× 在 PBS 中每次洗涤 5 分钟。
6. 进行抗原修复。可使用微波高压锅法结合抗原修复液（10 mM 枸橼酸缓冲液，pH 6.0）进行热诱导表位修复（HIER）。
   注意：甲醛固定过程可能会掩盖目标抗原。根据我们的经验，热诱导表位修复（HIER）可显著提高某些抗体的检测效果，但并非所有抗体均需此步骤。此外，抗原修复的HIER方法尚有其他可选替代方案。
7. 当压力锅冷却后，将玻片放入PBS中孵育15分钟。
8. 在正常血清（与二抗来源相同的物种）中孵育切片，孵育时间为30分钟。 切勿清洗载玻片——吸干血清。
9. 在室温下用正常封闭血清稀释的一抗孵育2小时，或在4℃过夜 °C.
10. 用 PBS 洗涤 3 次× 每次5分钟。
11. 在室温下用已用 PBS 稀释的生物素化二抗孵育切片 1 小时。
12. 将载玻片与辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素孵育 30 分钟，然后用 PBS 洗涤 3 次× 每次5分钟。
13. 显色反应——将切片置于新鲜的DAB（3,3'-二氨基联苯胺）中孵育5-30分钟。此反应应使用显微镜进行监测。通过将切片在自来水中洗涤以终止反应。
14. 用苏木精复染1分钟，用自来水冲洗5分钟，然后用蒸馏水洗涤3次× 每次5分钟。
15. 重复步骤 4.7–4.9 以完成载玻片的封片。

6. 免疫荧光染色通用实验方案

可采用类似的方案，稍作修改后用于免疫荧光染色。

1. 将切片置于空气干燥器中8分钟，然后在四次更换的二甲苯中脱蜡，每次3分钟。
2. 用100%乙醇洗涤3次× 每次3分钟，以去除二甲苯。
3. 洗涤 3 次× 在70%乙醇中各浸泡3分钟，然后2× 在50%乙醇中各浸泡3分钟。
4. 用蒸馏水洗涤各5分钟，然后用PBS洗涤3次× 每次5分钟。
5. 进行抗原修复。可采用微波高压锅法结合抗原修复液（10 mM 枸橼酸缓冲液，pH 6.0）进行热诱导表位修复（HIER）。
   注意：甲醛固定过程可能会掩盖目标抗原。根据我们的经验，热诱导表位修复（HIER）可显著提高某些抗体的检测效果，但并非所有抗体均需此步骤。此外，抗原修复的HIER方法之外，尚有其他可选的替代方法。
6. 压力锅冷却后，将载玻片放入PBS中孵育15分钟。
7. 在正常血清（与二抗来源相同的物种）中孵育切片，孵育时间为30分钟。 切勿清洗载玻片——吸干血清。
8. 在室温下用正常封闭血清稀释的一抗孵育2小时，或在4℃孵育过夜 °C.
9. 用 PBS 洗涤 3 次× 每次5分钟。
10. 加入用正常封闭血清（或PBS）稀释的荧光标记二抗，在室温下孵育1.5小时。
11. 用 PBS 洗涤 3 次× 每次5分钟。
12. 用 DAPI 复染。
13. 用 PBS 洗涤 3 次× 每次5分钟。
14. 使用抗荧光淬灭封片剂封片。

结果

五周龄的LDLR-/-小鼠分别喂食标准饮食或高脂饮食，持续十周。随后处死小鼠，并按上述方法用福尔马林灌注。制备主动脉窦的横切片，用苏木精和伊红染色，以确定病变区域和体积（图4）。当小鼠喂食标准饲料时，动脉粥样硬化的进展非常有限，在15周龄时可能无法检测到。高脂饮食在此模型中显著加速动脉粥样形成，并诱导产生含有无细胞坏死核心和纤维帽的大型晚期病变。

可通过染色检测特定细胞类型和影响斑块发展阶段的因素，进一步表征动脉粥样硬化病变。单核细胞浸润内膜是动脉粥样硬化发生的早期事件之一。内膜中的单核细胞分化为巨噬细胞，吞噬细胞碎片和脂质。富含脂质的巨噬细胞被称为泡沫细胞，在动脉壁内形成“脂质条纹”。

通过使用针对特定巨噬细胞标志物（包括 F4/80¹⁷、CD68¹⁸、Mac-3 (CD107)¹⁹ 和 MOMA-2²⁰ ）的抗体进行染色，可在病变发展的各个阶段检测到巨噬细胞/泡沫细胞（图5

讨论

动脉粥样硬化是一种累及大中肌性动脉的复杂慢性疾病，是心肌梗死和脑卒中的主要潜在病因。疾病进展涉及动脉壁内多种不同类型细胞之间，以及循环血细胞、脂蛋白颗粒和其他血液来源因子之间的相互作用，这些相互作用机制我们才刚刚开始了解。目前关于动脉粥样硬化发生与进展的大部分知识，均来源于专门设计的易发动脉粥样硬化的小鼠模型系统的研究。

需要牢记的是，动脉粥样硬化的小鼠模型存在一些显著的局限性。显然，与人类相比，小鼠在血管尺寸和表面积、血流、脉搏率、血压以及剪切应力等方面均存在显著差异。在大多数易发生动脉粥样硬化的小鼠模型中，并未观察到病灶破裂和动脉血栓形成——而这正是人类大多数心肌梗死的直接原因。此外，这些品系普遍缺乏遗传多样性，虽然降低了实验结果的变异性，但也对疾病病理过程引入了难以解释的人为限制。因此，在将这些小鼠模型所得数据用于解释和推断人类心血管疾病时，必须谨慎对待。尽管存在这些局限性，但得益于Cre-lox系统及其他遗传学策略推动的模型优化，以及小动物成像系统持续不断的技术进步，小鼠模型在未来多年内仍可能继续处于心血管疾病细胞与分子机制研究的前沿。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
LDLR缺陷型小鼠 (D2.129S7(B6)-Ldlrtm1Her/J)	杰克逊实验室	货号 #002207
福尔马林	西格玛-奥德里奇	HT5011
组织学模具	Ted Pella 公司	27195
石蜡	Paramat	19286-10
包被载玻片	费舍尔	12-550-15
溶剂容器	Tissue Tek II	4457
切片机	徕卡	RM22S5
水浴锅	VWR	80086-982
显微镜	奥林巴斯	BX41TF
相机	奥林巴斯	DP72
ImageJ	美国国立卫生研究院（NIH）	www.rsbweb.nih.gov/ij/
组织处理仪	Sakura Finetek	VIP6-A1
组织处理盒	VWR	18000-134
压力 cooker	Nordic Ware
盖玻片	费舍尔	12-545-M
PBS	西格玛-奥德里奇	P3813
切片机刀片	赛默飞世尔科技	30-518-35
抗荧光淬灭封片剂	西格玛-奥德里奇	F-4680
二甲苯封片剂	西格玛-奥德里奇	44581
水性封片剂	西格玛-奥德里奇	I1161
Mac-3 抗体	BD Pharmingen	553322
DAPI	西格玛-奥德里奇	D9542
F4/80 抗体	Abcam	Ab6640
α-肌动蛋白抗体	Santa Cruz Biotechnology	SC-32251
Mayer’s 苏木精	西格玛-奥德里奇	E4382
伊红 Y	西格玛-奥德里奇	MHS16
DAB（3,3'-二氨基联苯胺）	Dako	K3468