改进的人源细胞接触共培养血脑屏障模型的制备方法

摘要

建立人源血脑屏障（BBB）模型有助于研究与BBB功能障碍相关脑部疾病。本文介绍一种改良的接触式BBB模型制备技术，可在多孔膜的两侧分别共培养人源星形胶质细胞和脑微血管内皮细胞。

摘要

血脑屏障（BBB）由具有选择性通透性但可适应性调节的脑毛细血管组成，可严格调控脑内环境。BBB功能障碍已被认为与多种脑部疾病的发病机制相关，因此迫切需要开发人类 体外 用于辅助临床相关研究的血脑屏障模型。在目前已报道的多种血脑屏障模型中，一种静态（无流动）接触型血脑屏障模型脱颖而出，该模型将星形胶质细胞与脑微血管内皮细胞（BECs）共培养于多孔膜的两侧，具有简化且真实模拟血脑屏障的特点，并具备高通量筛选能力。然而，此类模型的构建仍存在若干技术难点。本文中，我们描述了一种利用原代人脑微血管内皮细胞与永生化人星形胶质细胞新型组合构建接触型人血脑屏障模型的实验方案。具体而言，我们详细介绍了一种创新性的倒置小室细胞接种方法，并说明了小室染色技术，同时举例展示了本模型在血脑屏障相关研究中的应用。

引言

血脑屏障（BBB）是外周血液循环与中枢神经系统之间的一种特化界面，在维持脑内环境稳态中起着至关重要的作用。它主要由独特的大脑微血管内皮细胞（BECs）构成，这些细胞在多种细胞和非细胞成分（见下文）的功能性影响下，形成进入大脑的紧密而动态的门户。在生理条件下，血脑屏障可限制血液细胞、血浆成分以及可能具有神经毒性的有害物质进入脑组织。同时，血脑屏障在脑组织与血液循环之间选择性地交换关键离子和营养物质（如葡萄糖和氨基酸）以及代谢废物，从而精确维持脑内环境的稳定^1,2。近年来，越来越多的研究表明，血脑屏障功能障碍出现在多种慢性脑部疾病中，例如神经退行性疾病或与炎症相关的疾病（如阿尔茨海默病和多发性硬化症）³，也见于缺血性脑卒中等急性病症⁴。

脑内皮细胞（BECs）独特的血脑屏障（BBB）特性主要由其脑内环境⁵诱导形成，尤其是星形胶质细胞的作用^6,7。目前逐渐认识到，其他细胞类型，如周细胞⁸、神经元和小胶质细胞^1,3，以及基底膜⁹，也支持BECs，并共同构成一个称为"神经血管单元"（NVU）的功能性结构，该结构可同时将神经元的代谢需求与其供血毛细血管相偶联¹⁰。

血脑屏障在病理情况中的作用机制促使了大量相关研究尝试 体外 用于协助血脑屏障相关研究的血脑屏障模型^11,12这些模型旨在尽可能地模拟 体内 根据NVU原则的血脑屏障特征 体外 血脑屏障模型通常依赖于形成紧密连接的脑微血管内皮细胞单层（主要来源于牛）¹³，人类¹⁴，大鼠¹⁵，小鼠¹⁶，以及猪的^17,18 起源），在多孔膜上与支持性星形胶质细胞共同培养（由Deli extensively reviewed） 等 2005¹¹).

星形胶质细胞可在非接触条件下培养于组织培养板孔的底部，与培养在膜上表面的脑微血管内皮细胞（BECs）通过培养基分隔，但可通过可溶性因子与BECs进行通讯¹⁶在更先进的、更接近血脑屏障解剖结构的模型中 体内，星形胶质细胞保持在接触条件下，并直接培养在膜的对侧，紧邻脑微血管内皮细胞（BECs）^13,15,17 (图1）。这种结构允许BECs与星形胶质细胞之间发生物理接触，当星形胶质细胞的突起穿过孔径膜时即形成接触。重要的是，为实现真正的接触，膜孔直径应≥1µm，因为星形胶质细胞的终足无法通过更小的孔径。即 0.4 µm^14,15值得注意的是，一些研究表明，接触式血脑屏障模型在跨内皮电阻（TEER）以及多种示踪剂的内皮通透性数值方面优于非接触式模型。^13,17,18. 最近，许多系统中新增了一个培养基流动的维度 体外 用于对内皮施加剪切力以更接近模拟脑血管系统的血脑屏障模型^12,19.

构建接触式血脑屏障（BBB）模型时需要克服的一个技术难题，是在多孔膜的血管外表面逆重力方向接种星形胶质细胞。以往的实验方案^13,20中，仅将星形胶质细胞以少量培养基液滴的形式接种于倒置的插入式培养小室顶部，这种方法允许的接种时间较短（即 10分钟¹³或2小时²⁰），而我们在实践中发现该时间不足以实现细胞的充分贴附。采用这种基本方法时，若要延长星形胶质细胞的贴附时间，就必须频繁打开培养箱以持续监测培养小室，从而导致温度、pH值和湿度的波动；此外，由于培养基会通过膜孔渗漏，尤其当使用孔径大于1 µm的膜时，容易造成细胞接种不均匀。

本文介绍了一种构建接触式血脑屏障（BBB）模型的通用方案。该实验流程包含一种在倒置的插入式培养小室上接种细胞的替代方法，可克服上述局限性。该方法允许星形胶质细胞在平衡的培养箱中长时间不受干扰地贴附于基底膜表面，从而实现星形胶质细胞的均匀接种，提高屏障质量，并最大限度减少不同插入小室之间的基础通透性差异。

由于人类细胞在与人类相关的研究中具有重要意义²¹，本文进一步展示了将原代人脑微血管内皮细胞（BECs）与永生化人星形胶质细胞相结合的新方法，用于构建具有高通量筛选能力的接触型人血脑屏障（BBB）模型。由于在多孔膜上观察细胞较为困难，本文还详细描述了染色技术，以辅助判断细胞在多孔膜上的汇合度及细胞形态。最后，本文举例说明了如何利用该人源性BBB模型研究组织型纤溶酶原激活物（t-PA）——即目前治疗急性缺血性脑卒中的唯一溶栓药物——对血脑屏障的影响。

方案

1. 细胞培养（在血脑屏障组装前3-7天）

1.1. 原代人脑微血管内皮细胞（BECs）

BEC细胞为商业获取。这些细胞通过中性蛋白酶消化正常人脑皮层组织获得，并以第3代冻存形式提供（<12次群体倍增）。

1. 基质：按照生产商说明书，用"Attachment Factor"包被组织培养器皿。
2. 细胞培养：在含血清的完全培养基中维持脑微血管内皮细胞（BECs）。用于实验时，则在无血清完全培养基中培养BECs。将细胞置于37 °C、5% CO₂、21% O₂的湿润培养箱中培养。
   注意：作为专用试剂的替代方案，可使用0.1%（w/v）明胶溶液作为包被试剂；同时可使用DMEM/F-12培养基，添加15 mM HEPES、10%（v/v）胎牛血清（FCS）、2 mM L-谷氨酰胺、50 µg/ml庆大霉素、20 µg/ml肝素和20 µg/ml内皮细胞生长补充物，用于BECs的维持培养。
3. 实验用细胞传代：根据下次使用时间（3–7天），将汇合的BECs按1:3至1:6的比例进行传代。每3天更换一次维持培养基。BECs使用代数不超过15代。

1.2. SVG 人胎儿星形胶质细胞系

SVG人胎儿星形胶质细胞²²最初来源于经复制缺陷型猴病毒40（simian virus 40）转化的人胎儿脑组织原代培养细胞。

1. 维持培养：在最低必需培养基中培养 SVG 细胞，该培养基添加 Earle's 平衡盐溶液，并补充 20% (v/v) 胎牛血清（FCS）（与其亲代原代细胞维持所用血清浓度相同²²）、2 mM L-谷氨酰胺、50 U/ml 青霉素和 50 µg/ml 链霉素。将细胞置于含 5% CO₂、21% O₂ 的湿润培养箱中，于 37 °C 下培养。
2. 实验用细胞传代：根据下次使用时间（3–7 天）将汇合的 SVG 细胞按 1:5 至 1:10 的比例进行传代。由于培养基中血清含量较高，无需去除胰蛋白酶。每 3 天更换一次培养基。SVG 细胞可使用至第 20 代。

2. 人类细胞的组装与共培养 体外 血脑屏障模型（第0天）

评论人类 体外 根据已发表的方案制备接触型血脑屏障模型 ^13,23，加以修改。

2.1. 插入物的包被

1. 将组织培养小室（直径 6.5 mm，聚酯多孔膜，孔径 3 µm）放入提供的 24 孔板各孔中。对小室的管腔面进行包被 在含大鼠 I 型胶原蛋白（20 µg/cm²）的湿润化 37 °C 培养箱中孵育过夜²；50 µl 含 132 µg/ml I 型胶原蛋白的溶液，溶于 0.02% 乙酸的 Milli-Q 水（MQH）中₂O）用MQH从基底侧和管腔侧各清洗一次插入物。₂O 以去除残留的酸。
   注意： 脑毛细血管基底膜不含胶原蛋白I，主要由层粘连蛋白、IV型胶原蛋白亚型、nidogen和硫酸肝素蛋白聚糖组成⁹因此，一些研究人员使用胶原蛋白IV、纤连蛋白等包被试剂¹³，或 Matrigel（BD biosciences）¹⁶ 以实现更真实的血脑屏障建模。

2.2. 在血管外膜（远腔面）膜表面接种 SVG

1. 将插入物倒置，并在多孔膜边缘轻轻套上一段短的弹性硅胶管"外部管路"；长约10 mm，内径8 mm，壁厚1.6 mm），在管腔外表面之上形成一个实质上的新孔腔（图2A).
2. 插入物的底部需要密封，以避免培养基泄漏。首先，准备一个塞子（图2A 和 2B）由硅胶管（称为 "内部管路"；长约 8 mm，内径 3.2 mm，壁厚 1.6 mm； 图 2B），一端密封 末端接一个塑料密封锥（长约3 mm；通过截取0.2 ml聚合酶链式反应（PCR）管底部制备）； 图2B). 该锥形结构不仅可封闭内部导管管腔，还可使其边缘扩大，以便更紧密地嵌入插入物中。接下来，使用无菌镊子将硅胶塞插入管腔内，并向前推进，直至其到达距膜约1-2 mm处。图2A).
3. 接下来，接种 4 x 10⁴ 将SVG细胞以200 µl SVG维持培养基（见上文第1.2.2节）直接接种至覆盖在血管外膜表面的硅胶小室中（图2A）。将SVGs放入培养箱中孵育至少4小时以使其贴壁。
   注意： 为保持无菌，将组装好的插入物夹在两块6孔板之间转运（一块6孔板倒扣在另一块上）； 图2C) 以尽量减少操作过程中暴露于未过滤空气中的风险。硅胶管和硅胶塞用乙醇清洗后高压灭菌，以备后续使用。
   注意： 仅对膜孔径大于1 µm的插入件使用插头（第2.2.2节）。孔径≤1 µm的膜极少发生泄漏，只需安装外部硅胶管（第2.2.1节）即可。此外，某些除I型胶原以外的包被试剂（参见第2.1节注释）甚至可防止通过3 µm孔径的泄漏。此情况需通过实验确定。
4. 为监测星形胶质细胞的贴壁状态，需将相同体积的星形胶质细胞悬液平行接种至标准96孔板中。该孔的表面积与6.5 mm插入式培养小室相同（0.33 cm²）。²）相比插入膜更便于通过相差显微镜观察细胞。当您在对照96孔板中观察到星形胶质细胞已充分贴壁时，表明星形胶质细胞在插入膜上也已充分贴附。
5. 当星形胶质细胞在对照96孔板中充分贴壁后，将插入式培养组件转移至组织培养超净台（见上述注释），轻柔移除外侧硅胶管和塞子。将插入式培养组件放回正常的（即 将细胞以直立方向接种至预置的孔中，每孔含800 µl BEC维持培养基（见上文第1.1.2节）。

2.3. 将脑微血管内皮细胞接种至星形胶质细胞上方的管腔室

在胶原蛋白包被的管腔表面接种 2×10⁴ 个 BEC，加入 200 μl 培养液，然后将插入板放回培养箱中。

2.4. 共培养

在实验前，将接种了SVG/BEC的插入式培养皿在BEC培养基中共同培养3天，期间不更换培养基。

3. 人血脑屏障模型的实验操作（第3天）

1. 为了刺激 体外 BBB 首次洗涤细胞时，分别用 600 µl 和 100 µl 无血清 BECs 培养基替换脉管外侧和管腔侧的培养基。
2. 再次吸出管腔内的培养基，并更换为含有刺激剂的100 µl无血清培养基。
   注意： 如果需要刺激管腔外室（以激活） 体外 从星形胶质细胞区室中取出脑微血管内皮细胞培养板，吸除基底外侧培养基，并替换为600 μl含刺激因子的无血清培养基。
3. 每个实验组设三个复孔（因此，若进行管腔刺激，需要 3 × 100 µl，我们建议将试剂在无血清培养基中稀释至每组 350 µl 的终浓度，以尽量减少各孔之间的移液误差）。
4. 进行标记示踪剂的标准旁细胞和/或跨细胞通透性检测 ^16,24 （对于后者，我们使用异硫氰酸荧光素（FITC）标记的白蛋白）和/或跨上皮电阻（TEER）的测量 ^13,16,25 如先前所述。

为了校正不同实验间基础通透性的波动，需使用以下公式，将实验组的通透性变化相对于无细胞的包被插入物（作为空白对照，代表最大通透性）以及溶剂处理组进行分析：通透性（%最大值）=（实验组插入物的通透性值 - 溶剂处理组的平均通透性值）/（空白插入物的通透性值 - 溶剂处理组的平均通透性值）× 100。

4. 多孔膜上细胞的观察

注释：由于插入膜不透光，会干扰光线透过，因此通过相差显微镜或微分干涉差（DIC）显微镜观察插入膜上的未染色细胞较为困难。为解决此问题，我们开发了多种针对插入膜上细胞的染色方法，可显著改善细胞在膜上的可视性。通常应在插入膜仍固定于插入装置并置于孔板中时进行染色。仅在染色步骤结束后，为封片需要时才将膜取出。

4.1. 苏木精染色

1. 用预冷的4%（w/v）多聚甲醛（PFA）磷酸盐缓冲液（PBS；130 mM NaCl，10 mM Na₂HPO₄，10 mM NaH₂PO₄，pH 7.2）固定插件20分钟。用PBS洗涤一次。
2. 将插件浸入0.1% Mayer's苏木精溶液中2分钟。
3. 用自来水轻轻洗涤插件（将插件浸入盛有自来水的烧杯中，并轻轻吸出多余水分）。将插件转移至Scott's自来水溶液（2 g/L NaHCO₃，20 g/L MgSO₄）中约20秒，直至出现理想的蓝色。再次用自来水洗涤插件（见第4.1.3节）。可选步骤：可在此处加入伊红染色，将插件浸入1%伊红溶液10秒，随后用自来水洗涤。
4. 将插件膜自然晾干。使用解剖刀（沿膜边缘切割）取下膜，并将其置于载玻片上用于明场成像
   注意：若使用二正丁基邻苯二甲酸盐在二甲苯中的封片剂（DPX），则在取下和封片膜之前，需先用100%乙醇洗涤插件，再用二甲苯洗涤。

4.2. 扫描电子显微镜（SEM）

1. 用预冷的4% (w/v) PFA PBS溶液固定插入物20分钟，然后用PBS洗涤三次。
2. 用1%（w/v）四氧化锇的MQ水溶液对膜进行固定后处理，持续30分钟₂O.
3. 用清水洗涤插入物（第4.1.3节），然后依次用递增浓度的乙醇梯度脱水（50%、70%、90%乙醇各5分钟，随后100%乙醇处理3次，每次10分钟）。
4. 用六甲基二硅氮烷（HMDS）与乙醇的混合液处理脱水的包埋块（1:2，然后2:1，各5分钟）。
5. 用100% HMDS处理插入片5分钟，空气干燥后置于干燥条件下保存。
6. 使用解剖刀将膜取出（沿膜边缘切割），并通过扫描电子显微镜观察膜结构。

4.3. 免疫荧光

1. 用预冷的4%（w/v）PBS多聚甲醛固定插入膜20分钟，然后在Tris缓冲盐水（TBS；50 mM Tris-HCl pH 7.6，154 mM NaCl，0.22 µm滤膜过滤）中洗涤一次。
2. 按照先前描述的方法²⁶对插入膜上的细胞进行免疫染色。
3. 使用解剖刀切除膜（沿膜边缘切割），并将膜置于载玻片上，用荧光封片介质封片。通过荧光显微镜观察膜。

结果

为了建立一种人类接触性血脑屏障模型，我们需要在多孔膜上共培养SVG细胞和BEC细胞 3 µm 孔径大小，已证实可允许星形胶质细胞终足通过并与内皮细胞接触^14,15,27,28完整的接触模型示意图如图所示 图1 （左图示意图）。接触系统面临的主要技术难题在于需要在膜的非腔面（abluminal surface）上逆重力接种星形胶质细胞。我们通过在非腔面膜表面顶部构建一个可移除的硅胶小室，并将额外的硅胶塞插入腔内空间以防止培养基泄漏，成功解决了这一问题。图2）。该方法使SVG细胞获得了最佳且连续的接种时间（至少4小时），从而使其能够牢固地附着于多孔表面，同时细胞损失最小。事实上，接种后第3天，SVG细胞和BEC细胞均呈现融合状态，并均匀覆盖在膜表面，这一点通过苏木精染色的插入物图像判断（见第4.1节； 图3A，左侧面板）。此外，两种细胞类型在多孔膜上均维持了其细胞特异性标志物（SVG细胞中胶质纤维酸性蛋白呈弥散性染色模式）²² 以及血管性血友病因子在 BECs 的 Weibel-Palade 小体...

讨论

脑部病理的医学研究面临诸多转化难题。例如，在急性缺血性卒中领域，许多在动物模型中显示巨大前景的药物在临床试验中均告失败^38,39。这些令人失望的结果原因多样，包括临床前测试系统对人类卒中情况的模拟不充分，以及对动物实验结果的过度解读²¹。提高临床前研究结果向临床阶段转化预测价值的一种策略是进一步开发基于人源细胞的体外（in vitro）模型；这类模型可为筛选新药和新机制提供高效且经济的工具，并有助于更聚焦于具有临床相关性的研究方向²¹。在此背景下，本文详细描述了我们实验室建立一种人源接触性血脑屏障（BBB）模型的全过程，该模型采用新型组合方式，即利用永生化人源星形胶质细胞（SVGs）与人源原代脑微血管内皮细胞（BECs）共同构建，用于研究与卒中相关现象。

在静态条件（无流动）下，接触型血脑屏障（BBB）模型（图1）最接近in vivo的解剖结构，并且其屏障特性已被证明优于其他模型^13,17,18

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
黏附因子	Cell-Systems Corporation	4Z0-210
脑微血管内皮细胞（BECs），原代，人源	Cell-Systems Corporation	ACBRI 376
完全培养基	Cell-Systems Corporation	4Z0-500	添加 CSC JetFuel
完全无血清培养基	Cell-Systems Corporation	SF-4Z0-500	添加 CSC RocketFue
含 15 mM HEPES 的 DMEM/F-12 培养基	Life Technologies	11330-032
内皮细胞生长补充剂（牛源）	Sigma-Aldrich	E2759-15MG
外层硅胶管	Watson-Marlow	913.A080.016	Pumpsil 品牌，内径 8 mm，壁厚 1.6 mm
胎牛血清	Lonza	14-501F
硫酸庆大霉素	Life Technologies	15750-060
肝素钠	Pfizer		1,000 U/ml
六甲基二硅氮烷（HMDS）	Sigma-Aldrich	H4875
人脑微血管内皮细胞	Cell-Systems Corporation	ACBRI 376
内层硅胶管	Watson-Marlow	913.A032.016	Pumpsil 品牌，内径 3.2 mm，壁厚 1.6 mm
L-谷氨酰胺	Life Technologies	25030
Mayer’s 苏木精溶液	Amber Scientific	MH
含 Earle’s 平衡盐溶液的最低必需培养基	HyClone Laboratories	SH30244.01
青霉素/链霉素	Life Technologies	15140
大鼠 I 型胶原	Trevigen	3440-100-01	Cultrex 品牌
组织培养小室	Corning Life Sciences	3472	Transwell 品牌，直径 6.5 mm，聚酯多孔膜，孔径 3 µm