改进方法对血脑屏障的人体细胞为主，接触模型的制备

摘要

成立血脑屏障（BBB）人体模型的受益研究与BBB级故障相关的大脑条件。我们在这里描述的改进的技术，用于制备接触BBB模型，它允许在多孔膜的相对侧上的人星形胶质细胞和脑血管内皮细胞的共培养的。

摘要

血 - 脑屏障（BBB）包括不可渗透的，但适应性脑毛细血管紧紧控制大脑环境。血脑屏障的破坏已经隐含在许多脑病变的病因，这就需要对人类的发展在体外 BBB模型，以协助临床相关研究。之间迄今所描述的众多BBB模型，静态（无流量），与血脑屏障模型，其中星形胶质细胞和脑血管内皮细胞（的BEC）的共培养在多孔膜的相对侧上，成为一种简单但真实的系统来模拟BBB与高通量筛选能力。然而这种模式的产生提出了一些技术上的挑战。在这里，我们描述了一个协议，用于制备一种利用一种新型的初级人类的BEC和永生化星形胶质细胞的组合接触人体血脑屏障模型。具体来说，我们为细节上的倒插入细胞播种一种创新的方法以及指定插入背板T染色技术和体现我们如何使用我们的模型为BBB-的相关研究。

引言

血脑屏障是末梢血液循环和中枢神经系统中，关键的是负责大脑止血的维护之间的专用接口。它包括不同的脑微血管内皮细胞（的BEC）这是由几个细胞和非细胞成分（见下文）在功能上的影响，以形成一个紧凑的和动态的网关到大脑。在生理条件下是BBB限制血细胞，血浆成分和有害物质，所有潜在的神经毒性的通道，进入大脑。平行地，血脑屏障选择性交换密钥离子和营养物（葡萄糖和氨基酸）和代谢废物的大脑和循环之间精确地保持大脑环境^1,2。近年来它是日益明显的是，血脑屏障的破坏发生在各种慢性脑病变，如神经变性或炎症有关的疾病（ 如阿尔茨海默氏病和含多处Ë硬化，分 ​​别^）3，以及在像缺血性中风急性⁴条件。

脑内皮细胞（的BEC）的独特属性血脑屏障通过脑环境⁵在很大程度上引起，特别是由星形胶质细胞^6,7。有越来越多的了解，其它细胞类型，例如周细胞^8，神经元和神经胶质细胞^的1,3，以及基底膜^9，支持的BEC和一起形成一个功能单元被称为"神经血管单元"（NVU），它同时夫妻神经元代谢需要它们的供应毛细血管^10。

血脑屏障在病理情况下参与的基础无数次尝试开发体外 BBB模型，以协助BBB相关的研究^11,12。这些模型的目标是模仿尽可能接近体内血脑屏障的特性根据NVU原理。 体外 的BBB模型通常依赖于紧密连接形成的BEC的单层（主要从牛^13，人¹⁴大鼠^15，鼠标器^16，和猪^17,18起点），在多孔膜上培养连同支持星形胶质细胞（广泛由德利等人，2005年¹¹审阅）。

星形胶质细胞可在非接触条件下生长的组织培养孔的底部，通过用的BEC通过可溶性因子¹⁶的培养基还从通信的BEC（栽培在膜的上表面）分离。在更先进的模型的更好类似于血脑屏障的体内的解剖结构，星形胶质细胞被保持在接触的条件和直接邻近的BEC ^13,15,17（ 图1）在膜的另一侧进行培养。这种配置使建筑物能源效益守则和星形胶质细胞之间的身体接触，成立时星形胶质细胞项目通过多孔膜的工序。重要的是，对于发生的真实接触的孔隙应≥1μm的直径，由于星形细胞的最终尺不能穿过较小的孔径（ 即 0.4微米^）14,15。值得注意的是，接触BBB系统中演示了一些研究要优于他们对他们的跨内皮细胞电阻（TEER）和各种示踪剂^13,17,18的内皮通透性值非接触的同行。媒体流的另外一个维度在一些体外 BBB模型剪力适用于内皮细胞为脑血管^12,19的接近模拟最近添 ​​加。

一个技术障碍产生接触BBB模型时，克服星形胶质细胞是克服重力在多孔膜的腔外表面的播种。上一页协议^13,20，其中星形胶质细胞被简单地播种在媒体上的顶部下降verted插入，只允许短的播种时间（ 即 10分钟^，13或2小时^20）被发现在我们的手中是不够正常细胞附着。使用这种基本的方法，较长的星形胶质细胞实习期间需要不断的监测插件被频繁打开培养箱的（导致温度，pH值和湿度的波动），也容易出现不均匀的细胞种植由于通过小孔漏的媒体，尤其是如果毛孔大于1μm就业。

在这里，我们描述了一个通用协议，用于制备接触血脑屏障模型。我们的程序包括用于在反相插入，即解决了上面提到的限制细胞接种另一种方法。该方法允许星形胶质细胞的原状附着到腔外表面的膜，在平衡培养箱，对于延长的时间周期。作为一个结果，星形细胞的均匀播种实现这增加屏障质量并最大限度地减少刀片之间的基底透气性的变化。

由于使用人类细胞是人类有关的研究²¹重要的是，我们另外在这篇文章中展示出一种新颖的首要人权的BEC相结合的具体运用和永生化人星形胶质细胞的建立接触人体血脑屏障模型的高通量筛选能力。由于观察细胞在多孔膜是很困难的，我们也详细的染色技术，可协助合流的决心和细胞形态的多孔膜。最后，我们举例说明如何我们人类血脑屏障模型可以被用来研究组织型纤溶酶原激活剂（T-PA）的影响 - 一个血块破坏酶可作为急性缺血性中风的唯一的治疗选择 - 对血脑屏障。

方案

1。细胞培养（3-7天之前至BBB大会）

1.1。小学的人脑微血管内皮细胞（建筑物能源效益守则）

建筑物能源效益守则分别购得。细胞通过正常人类脑皮质组织的分散酶分解所产生并提供冻结在通道3（<12个群体倍增）。

1. 基质 :大衣组织培养器皿"附件因子"按照制造商的说明。
2. 电池保养 :保持在含血清的完全培养基的BEC。对于实验，文化的BEC完全无血清培养基。维持细胞在湿润的5％CO _{2，21％O 2}的培养箱中在37℃下
   注意 :作为一个替代专门的试剂，0.1％（重量/体积）明胶溶液可以作为包衣试剂而DMEM/F-12补充有15mM的HEPES，10％（V / V）胎牛血清（FCS）， 2mM的L-谷氨酰胺，50微克/毫升庆大霉素，20微克/毫升肝素和20μg/ ml的内皮细胞生长添加物，可用于BEC维修。
3. 子培养进行试验 :分流汇合的BEC在1:3至1:6的比例，根据期望的时间为下一次使用（3-7天）。改变维持培养基每3天。使用的BEC多达15代。

1.2。 SVG胎儿星形胶质细胞细胞系

SVG人胎星形胶质细胞²²最初来源于人胎脑转化与复制缺陷型猿猴病毒40的原代培养。

1. 维护 :文化SVG细胞在含Earle的补充有20％（V / V）FCS（用于维持其亲代原代细胞²²相同血清百分比），2mM的L-谷氨酰胺，50单位/ ml青霉素和平衡盐溶液中的最小必需培养基50微克/毫升链霉素。维持细胞在湿润的5％CO _{2，21％O 2}的培养箱中在37℃下
2. 子培养进行试验 :分流汇合SVGs以1:5至1:10的比例，根据期望的时间为下一次使用（3-7天）。除去胰蛋白酶的是不是由于血清的培养基中的高含量必需的。改变培养基每3天。使用SVGs多达20次传代。

2。大会在人类体外血脑屏障模型和共培养（第0天）

评论 : 在体外接触血脑屏障模型的人是根据发布的协议^13,23编制，修改。

2.1。刀片的涂层

1. 把组织培养插入物（直径6.5毫米与聚酯的多孔膜，3微米孔径）在所提供的24孔板的孔中。刀片的外套腔面 隔夜在湿润的37℃培养箱与大鼠Ⅰ型胶原（20微克/厘米^2; 50微升的132微克/毫升胶原蛋白I在0.02％乙酸的Milli-Q水（MQH ₂ O））。 （无论是从近腔和腔侧）与MQH _{2 O}洗一次插入物以除去残余的酸。
   注:脑毛细血管基底膜不包含I型胶原，但主要是层粘连蛋白，Ⅳ型胶原亚型，nidogens和硫酸乙酰肝素蛋白多糖^9。出于这个原因，一些研究人员利用涂层剂，如Ⅳ型胶原，纤连蛋白^13，或基质胶（BD公司^）16一个更真实的BBB级建模。

2.2。在底部（近腔）膜表面播种SVGs

1. 反转插入，轻轻地适应周围的多孔膜一小段弹性硅胶管的边缘（"外管";〜10mm长8毫米的直径，1.6 mm管壁），创建本质上是一种新的，远高于近腔面（ 图2A）。
2. 插入东东的底部DS被密封，以避免介质的泄漏。首先，准备由硅管（称为"内部管道";〜8mm长，3.2毫米的直径，1.6毫米壁; 图2B）的插头（ 图2A和图2B），在其一端带有一个塑料密封锥面密封（〜3mm的长;制备切割的0.2毫升聚合酶链反应（PCR）管的底部; 图2B）。此锥体不仅密封该内部管道腔，也扩大了它的边缘紧密配合到插入。接着，用无菌镊子，将硅酮插头插入腔腔并将其推进，直到它到达向上到约1-2毫米的膜（ 图2A）。
3. 接着，播种4×10 ⁴个细胞的SVG在200μl的SVG维持培养基（SECTION 1.2.2以上）直接进入硅氧烷以及上面的腔外表面的膜（ 图2A）。允许SVGs附着在培养箱中在至少4个小时。
   注意:为了保持无菌输送组装的插入在2 6孔板（1板倒置在其他; 图2C）之间，以在手术过程中尽量减少暴露在未过滤的空气。硅胶管塞和洗涤的乙醇和高压灭菌后使用。
   注意:使用插头（第2.2.2节）只适用于刀片，膜孔径大于1μm。与膜孔直径≤1微米很少泄漏，需要外部硅胶管（2.2.1节），只有配件。此外，一些比其他胶原蛋白涂层剂I（见附注2.1节）可能会阻止泄漏甚至到3微米的小孔。凭经验确定这一点。
4. 为了监视你的星形胶质细胞的粘附状态，在种子成平行的星形胶质细胞的细胞悬浮液的一个标准的96孔相同的体积。该井具有相同的表面面积为6.5 mm插入（0.33 ^平方厘米），并且允许细胞的相差显微镜易于可视化比插入膜。当你观察在控制星形胶质细胞有足够的坚持96孔，星形胶质细胞已充分也坚持到插入膜。
5. 当星形胶质细胞已充分地附着在控制96孔，转让插入组件到组织培养罩（见上文附注），并轻轻地取下外部硅胶管和插头。返回插入到正常（ 即竖直）方向到含有800微升/孔的BEC维持液（上述第1.1.2节）所提供的水井。

2.3。播种建筑物能源效益守则进入管腔室上方的星形胶质细胞

种2×10 ⁴的BEC在200μl到胶原包被的腔表面和返回的樱雪RTS进入孵化器。

2.4。共培养

实验前，共培养了SVG / BEC种子镶在BEC介质3天没有媒体的变化。

3。实验与人体血脑屏障模型（3天）

1. 通过分别与600μL和100μL无血清的BEC介质，取代近腔和管腔媒体刺激体外血脑屏障先洗细胞。
2. 再次吸出管腔介质，并替换为100μl的无血清培养基中以刺激剂。
   注意:如果近腔室的刺激是必要的（从星形胶质细胞车厢激活体外 BBB），吸近腔中，替换600微升无血清培养基与刺激剂。
3. 测试各实验组的一式三份（因此，如果进行管腔的刺激，这需要3×100微升，我们建议稀释重剂到它们的最终浓度在350微升无血清培养基中的每个组，以减少井之间移液误差）。
4. （对于后者我们用异硫氰酸荧光素（FITC）偶联的白蛋白）和/或TEER ^13,16,25的测定如先前所述进行标准的细胞旁和/或标记的示踪剂^16,24的跨细胞通透性测定。

考虑到在基线渗透性波动的实验之间，分析，以不含细胞的涂层刀片（其用作用于最大导磁率的参考），并利用公式载体治疗组的变化相对导磁率:导磁率（最大值的％）=（媒介物组的平均渗透率值）×100 - 车辆组）/（透过性的插入件坯件的值的平均渗透率值 - 试验刀片的渗透率值。

4。多孔膜细胞可视化

NT"> 注释 :未染色的细胞上插入膜是难以相衬或微分干涉对比（DIC）显微镜观察，因为膜是相当不透明的干扰光传输为了解决这个问题，我们开发了细胞的各种染色程序上。插入件，从而大大提高细胞的外观上的膜，通常，染色膜的插入而仍然附着在插入，在该孔中。该膜应该只在用于安装目的的染色过程结束时被删除。

4.1。苏木素染色

1. 固定刀片用冰冷的4％（重量/体积）的多聚甲醛（PFA）在磷酸盐缓冲盐水（PBS; 130 mM氯化钠，10毫米的Na ₂ HPO _4，10mM的的NaH ₂ PO _4，pH 7.2）中20分钟。在PBS洗一次。
2. 淹没在插入2分钟，0.1％Mayer氏苏木素液。
3. 轻轻地用自来水冲洗刀片（浸没的插件ERT在一个烧杯中含有自来水轻轻吹打多余的水出来）。插入转移到斯科特的自来水溶液（2 g / L的碳酸氢钠_3，20 g / L的硫酸镁_4）〜20秒，直到所需的蓝色发展。用自来水（4.1.3节）洗一遍插入。一个可选的伊红染色可以在这里介绍通过浸渍在插入10秒后自来水冲洗1％曙红溶液。
4. 空气干燥插入膜。使用手术刀（割开膜边缘）去除膜和将其安装在明场成像的载玻片
   注:拆卸和安装膜前用100％乙醇随后二甲苯如果二-N-butylphthalateinxylene（DPX）安装介质是利用清洗刀片。

4.2。扫描电子显微镜（SEM）

1. 固定刀片用冰冷的4％（重量/体积）的PFA的PBS 20分钟。在PBS中洗涤3次。
2. 后固定在膜中的1％30分钟（w / v的在MQH ₂ O），四氧化锇
3. 于水（4.1.3节）洗净刀片和脱水在不断升级的乙醇梯度（50％，70％，90％，每次5分钟，然后用3倍100％乙醇为每间隔10分钟）。
4. 治疗脱水刀片与六甲基二硅氮烷（HMDS）的混合物:乙醇（1:2，然后5分钟，2:1）。
5. 治疗插入物具有100％的HMDS 5分钟，干燥的条件下空气干燥和存储。
6. 使用手术刀（割开膜边缘）取下膜。用扫描电子显微镜检查膜。

4.3。免疫荧光

1. 固定刀片用冰冷的4％（重量/体积）的PFA的PBS中20分钟，洗一次，在Tris-缓冲盐水（TBS;的50mM的Tris-HCl pH值为7.6，154 mM氯化钠，0.22微米过滤的）。
2. 如先前所述²⁶上的插入膜进行细胞的免疫染色。
3. 使用手术刀（割开膜边缘）取下膜将其安装在AG姑娘幻灯片荧光封固剂。通过荧光显微镜检查膜。

结果

为了建立一个人，接触BBB模型，我们不得不培养于多孔膜SVGs和的BEC具有3微米的孔隙大小，显示允许的星形胶质细胞的最终英尺通道，用于与内皮细胞^14,15,27,28接触。完整的接触模型的示意图如图1（左图）。通过接触系统呈现的主要技术挑战是需要的种子的星形胶质细胞对抗重力在膜腔外表面。我们已通过主要产生一个可移动的硅氧烷以及在近腔膜表面的顶部上，同时防止介质泄漏带有附加硅氧烷插头插入腔腔体（ 图2）成功地完成这一任务。该方法允许SVGs的一个最佳的，不间断的播种期间（至少4小时），这反过来又成为牢固地附着到具有最小的细胞损失的多孔表​​面。事实上，3天播种后，双方SVGs和建筑物能源效益守则的应用耳融合和覆盖膜均匀，因为从苏木染插入图像判断（见4.1节， 图3A，左图）。此外，这两种类型的细胞保持在多孔膜的细胞特异性标志物（胶质纤维酸性蛋白在SVGs ²²弥漫染色模式和血管性血友病因子在Wiebel-Palade小体和细胞质泡在建筑物能源效益守则的表达; 图3A，

讨论

医学研究脑病变遭受多大的平移难度。在急性缺血性中风的区域，例如，许多药物，在动物模型中表现出极大的承诺未能在诊所^38,39。的原因，这些令人失望的结果是多种多样的，包括临床前测试系统的不忠的人中风的情况，并从动物研究²¹获得的结果夸大。一个策略，以提高临床前研究结果的预测价值临床阶段的额外开发基于人体细胞的体外模型，这些可以提供强有力的和符合成本效益的工具，用于筛选新的药物和机制，以便更好地专注于临床相关途径^21。在这方面，我们详细介绍了这里在我们的实验室建立，利用一种新的人类永生天文组合人类接触BBB模型进行的过程核细胞（SVGs）和人的BEC初级考试中风有关的现象。

在静态条件下（无流量），与血脑屏障模型（ 图1）类似最好在体内的解剖结构，并证明是优于在其阻隔性能^13,17,18。重要的是，能源效益守则和星形胶质细胞之间的真正接触只发生在膜具有较大的孔径（≥1微米），其允许的星形胶质细胞末...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
附着因子	Cell-Systems Corporation	4Z0-210
脑微血管内皮细胞 （BEC），原代，人	Cell-Systems Corporation	ACBRI 376
完全培养基	Cell-Systems Corporation	4Z0-500	补充有 CSC JetFuel
完全无血清培养基	Cell-Systems Corporation	SF-4Z0-500	补充 CSC RocketFue
DMEM/F-12 和 15 mM HEPES	Life Technologies	11330-032
内皮细胞生长补充剂（来自牛来源）	Sigma-Aldrich	E2759-15MG
外部硅胶管	Watson-Marlow	913.A080.016	Pumpsil 品牌，8 mm 内径，1.6 mm 壁
胎牛血清	Lonza	14-501F
硫酸庆大霉素	Life Technologies	15750-060
肝素钠	辉瑞		1,000 U/ml
六甲基二硅氮烷 （HMDS）	Sigma-Aldrich	H4875
人脑微血管内皮细胞	Cell-Systems Corporation	ACBRI 376
内部硅胶管	Watson-Marlow	913.A032.016	Pumpsil 品牌，3.2 mm 内径，1.6 mm 壁
L-谷氨酰胺	Life Technologies	25030
Mayer's 苏木精溶液	Amber Scientific	MH
含 Earle' 的最低必需培养基s 平衡盐溶液	HyClone Laboratories	SH30244.01
青霉素/链霉素	Life Technologies	15140
大鼠胶原蛋白 I	Trevigen	3440-100-01	Cultrex 品牌
组织培养插入物	康宁生命科学	3472	Transwell 品牌，直径 6.5 毫米，带聚酯多孔膜，3 µm 孔径