高通量流式细胞术细胞检测法用于检测人血清中抗N-甲基-D-天冬氨酸受体或抗多巴胺-2受体抗体

摘要

近年来，基于活细胞的检测方法已成功用于检测针对细胞表面和构象性抗原的抗体。本文介绍了一种利用高通量流式细胞术的方法，可实现对大规模患者队列的分析。新抗体的发现将有助于改善免疫介导性疾病的确诊与治疗。

摘要

近年来，在儿童和成人自身免疫性中枢神经系统疾病中，已检测到针对神经传递相关表面蛋白和构象蛋白的抗体。这些抗体已被用于指导疾病的诊断和治疗。基于细胞的检测方法提高了患者血清中抗体的检出率。该方法基于真核细胞表面表达脑部抗原，随后与稀释的患者血清孵育，再加入荧光染料标记的二抗。洗涤后，通过流式细胞术分析二抗的结合情况。本研究团队已开发出一种高通量流式细胞术活细胞检测方法，可可靠地检测针对特定神经递质受体的抗体。该流式细胞术方法操作简便、定量准确、高效，并且借助高通量进样系统，可在短时间内轻松检测大量患者样本。此外，这种基于细胞的检测方法可轻松改造，用于检测针对中枢神经系统及外周多种不同抗原靶点的抗体。发现更多新型抗体生物标志物将有助于实现免疫介导疾病的快速而准确的诊断，并改善治疗效果。

引言

近年来，已发现多种中枢神经系统（CNS）的自身免疫性疾病。研究表明，这些疾病与自身抗体的存在密切相关，并由此定义。这些抗体可结合于参与神经传递的神经元受体或突触蛋白^1,2。目前已发现多种不同的抗原，包括N-甲基-D-天冬氨酸受体（NMDAR）^3-5、γ-氨基丁酸B型受体（GABA_B受体）⁶、α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异噁唑丙酸（AMPA）受体⁷、电压门控钾通道（VGKC）相关蛋白：富含亮氨酸的胶质瘤失活1蛋白（LGI1）和接触蛋白相关蛋白2（Caspr2）^8,9、谷氨酸受体^5,10以及多巴胺-2受体（D2R）¹¹。过去，这些自身免疫性中枢神经系统疾病（主要称为脑炎）常被漏诊或未予治疗。这些新发现的抗体生物标志物，例如抗NMDAR抗体或多巴胺-2受体抗体，显著提高了临床诊断率和认知度，并为患者提供了新的治疗选择。事实上，早期采用免疫治疗可显著改善患者预后^11,12。

检测抗体的传统方法，如酶联免疫吸附试验（ELISA）和蛋白质印迹法（western blot），已被用于血清中抗体的检测。然而，这些方法难以有效识别细胞外或细胞表面的表位，反而可能检测到针对细胞内表位的免疫反应性。此外，结合于参与神经传递的重要蛋白质胞外结构域的抗体很可能具有致病性^2,3,7,13,14。因此，开发准确且敏感的检测方法以发现患者体内相关的细胞表面或细胞外抗体靶点至关重要。该领域的金标准方法是基于使用活细胞的“基于细胞的检测法”（cell-based assays）。该方法通过转染含有目标抗原完整cDNA序列的载体，使抗原以其天然构象表达于哺乳动物细胞（最常用的是人胚胎肾293（HEK293）细胞）表面。随后将未通透处理的活细胞与稀释后的患者血清孵育，再加入荧光染料标记的抗人免疫球蛋白（Ig）二抗。通过检测荧光强度或水平，反映自身抗体的结合程度。该技术具有高度特异性，因为细胞中仅过表达一种抗原。目前最广泛采用的“读出”方式是在免疫细胞化学染色后进行共聚焦显微镜分析^4,5,8-10。然而，基于流式细胞术的细胞检测法也已成功用于检测脱髓鞘疾病患者的抗体^15-17。特别是Waters et al.¹⁵比较了包括基于细胞的检测法结合显微镜或流式细胞术分析在内的多种抗体检测技术，结果表明基于流式细胞术的细胞检测法是最敏感、准确且可靠的方法。因此，基于流式细胞术的细胞检测法具有显著优势：它可实现定量分析，结果不依赖于操作者主观判断，且无需使用放射性物质。此外，该方法操作便捷，可在短时间内完成对大量患者样本的检测。

最近，我们优化了一种高通量流式细胞术细胞实验方法，用于检测自身免疫性中枢神经系统疾病患者体内的NMDAR抗体和D2R抗体¹¹。我们课题组近期采用流式细胞术细胞实验检测了患者血清中的NMDAR抗体，这些NMDAR抗体阳性的血清此前通过共聚焦显微镜分析也已被确认为阳性¹¹。本方案描述了一种利用自动化高通量进样器，通过流式细胞术细胞实验检测患者血清中构象敏感性中枢神经系统抗体的方法。

方案

1. 构建编码D2R或NMDAR的pIRES2-EGFP载体的亚克隆策略

1. 获取人源 D2R 或 NMDAR 亚基 1（NR1）的全长 cDNA 克隆。
2. 选择一种表达载体，例如 pIRES2-EGFP，该载体适用于跨膜蛋白的表达，并在内部核糖体进入位点（IRES）控制下携带增强型绿色荧光蛋白（GFP）报告基因，从而可在细胞中分别共表达目标抗原与 GFP。
3. 将人源 cDNA 亚克隆至 pIRES2-EGFP 载体中。
   1. 进行亚克隆时，使用适当的限制性内切酶（例如，人源 D2R cDNA 可使用 NheI 和 XhoI）。
   2. 将酶切后的 cDNA 片段连接至经相同酶切的 pIRES2-EGFP 载体中。
   3. 对连接后的 pIRES2-EGFP D2R 或 NMDAR 载体进行测序，以确认载体中含有正确的序列。
   4. 纯化并扩增 pIRES2-EGFP D2R 或 NMDAR 载体，用于后续转染实验。

2. 表达神经元抗原的HEK293细胞转染

1. 在组织培养瓶中使用新鲜的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（1x）（DMEM），该培养基含有 4.5 g/L D-葡萄糖、L-谷氨酰胺和 110 mg/L 丙酮酸钠，并添加 10% 胎牛血清（FBS）、2 mM GlutaMAX 和 50 μg/ml 庆大霉素，培养 HEK293 细胞。
2. 使用胰蛋白酶消化并脱离 HEK293 细胞，转移至锥形管中。
   1. 以 250 × g 离心 6 分钟洗涤细胞，弃上清，将细胞沉淀重悬于新鲜的完全 DMEM 培养基中。
3. 计数细胞，并将细胞以约 8 × 10⁵ 个/孔的密度接种于 6 孔板中，每孔加入 2 ml DMEM，在 37 °C、5% CO₂ 的培养箱中过夜培养。
4. 当细胞融合度达到约 70% 时，按以下步骤用 pIRES2-EGFP NR1（HEK293^NMDAR+ 细胞）、pIRES2-EGFP D2R（HEK293^D2R+ 细胞）和 pIRES2-EGFP（HEK293^CTL 细胞；空载体对照）质粒转染 HEK293 细胞。保留部分未转染的 HEK293 细胞用于后续补偿设置。
   1. 配制转染混合物，每孔包括 2.5 μg DNA、200 μl 0.9% 氯化钠溶液和 4 μg/ml 聚乙烯亚胺（PEI），溶于 2 ml 新鲜完全 DMEM 中。
   2. 立即涡旋混合物 10 秒，室温（RT）孵育 10 分钟，然后将转染混合物加入相应孔中。
   3. 盖上培养板，用 Parafilm 封边，于 280 × g 离心 5 分钟以促进细胞转染。
   4. 移除 Parafilm，将培养板放入培养箱中，在 37 °C 继续培养。
   5. 18 小时后更换为新鲜的完全 DMEM 培养基，继续培养 72 小时。
   6. 可选步骤：转染 72 小时后，可通过在完全 DMEM 培养基中添加 250 μg/ml 遗传霉素（Geneticin）进行筛选，以获得多克隆稳定转染细胞系。

3. 用于检测抗神经元表面抗体的流式细胞术细胞实验

1. 将 HEK293^NMDAR+、HEK293^D2R+ 和 HEK293^CTL 细胞用每孔 500 μl 的 Versene 在 37 °C 下孵育约 5 分钟，使其脱离。
   1. 用每孔 2 ml 含 2% FBS 的 PBS (-Ca²⁺/-Mg²⁺)（即 PBS/FBS）重悬细胞，并转移至 15 ml 或 50 ml 锥形管中。
   2. 以 250 × g 离心 6 分钟洗涤细胞，将细胞沉淀重悬于 15–50 ml PBS/FBS 中。重复洗涤两次。
   3. 计数细胞后，将其以 1 × 10⁶ 个细胞/ml 的浓度重悬于 PBS/FBS 中。
2. 设计用于流式细胞术检测的 96 孔板模板，需考虑 HEK293^D2R+ 或 HEK293^NMDAR+ 细胞以及 HEK293^CTL 细胞均需与每份患者样本或一抗共同孵育。
3. 根据流式细胞术检测模板，将细胞以每孔 50,000 个细胞的密度接种至 V 型底 96 孔板中。
4. 将 96 孔板以 450 × g 离心 5 分钟使细胞沉淀，使用电子或多通道手动移液器小心吸除上清液，倾斜板子并注意避免吸走细胞沉淀。
5. 在室温避光条件下孵育 HEK293^D2R+、HEK293^NMDAR+ 和 HEK293^CTL 细胞 1 小时，孵育体系包含：
   1. 一抗的系列稀释液，用于评估抗原表面表达水平。
   2. 患者样本，用于检测抗体。
6. 使用适当的流式细胞术补偿对照，例如 未染色的未转染 HEK293 细胞、GFP⁺ HEK293 细胞（AF647^-）以及未转染的 AF647⁺ HEK293 细胞（GFP）。
7. 以 450 × g 离心 5 分钟洗涤细胞，将细胞沉淀重悬于 170 μl PBS/FBS 中。重复洗涤步骤两次。
8. 在室温避光条件下，加入 1:100 稀释的 AF647 标记的二抗（针对患者血清使用抗人 IgG，针对抗 NR1 或抗 D2R 一抗使用抗小鼠 IgG），孵育细胞 1 小时。
9. 按照步骤 3.7 的方法洗涤细胞三次，最后将细胞重悬于 35 μl PBS/FBS 中，用于流式细胞术检测。
10. 在流式细胞仪（BDLSRII）上设置高通量进样器（HTS）。
11. 根据流式细胞术检测模板，每孔采集 10,000 个事件。
12. 导出数据并使用流式细胞术分析软件（如 FlowJo v7.5）进行分析：
    1. 首先根据前向散射（细胞大小）和侧向散射（细胞粒度）对活的 HEK293 细胞设门。
    2. 进一步根据高 GFP 阳性信号对活的 HEK293 细胞设门，仅分析转染成功的细胞。
    3. 测定活的 GFP 阳性细胞中 AF647 通道的平均荧光强度（MFI）。
    4. 将数据导出至 Excel 或 Prism 进行分析：
       1. 绘制一抗（抗 NMDAR 或抗 D2R 抗体）浓度与其孵育后细胞所得 MFI 的关系曲线。
       2. 对每位患者及对照样本，通过从 HEK293^D2R+ 或 HEK293^NMDAR+ 细胞的 MFI 中减去 HEK293^CTL 细胞的 MFI，计算 ΔMFI。
       3. 通过将对照组 ΔMFI 均值加上三个标准差，计算抗体阳性的阈值。
       4. 将各样本按血清类型分组绘图，并以一条线表示该阈值。

结果

使用高通量进样器在流式细胞仪上获取活的 HEK293^D2R+ 和 HEK293^CTL 细胞。分析过程中，根据前向散射（大小）和侧向散射（颗粒度）参数对细胞进行设门（图 1A 和 1D）。转染的 HEK293 细胞在细胞质中表达报告分子 GFP，未转染的细胞被排除在分析之外（图 1B 和 1E）。在 GFP⁺ 设门范围内，测定与 AF647 标记的抗人 IgG 二抗结合相关的平均荧光强度（MFI）（图 1C 和 1F）。为了消除分析人血清时的背景荧光，通过从 HEK293^D2R+ 细胞的 MFI 中减去 HEK293^CTL 细胞的 MFI 来计算 ΔMFI（图 1G）。所示数据代表 D2R 抗体分析的典型结果，相同的设门策略和数据分析方法也可用于 NMDAR 抗体检测（数据未显示）。

讨论

本文介绍了一种基于流式细胞术的活细胞检测新方法，利用高通量进样器检测靶向特定细胞表面神经元蛋白的抗体。通过该技术，我们发现一组自身免疫性中枢神经系统疾病患者血清中存在针对细胞表面NMDAR或细胞表面D2R的抗体。

使用此高通量流式细胞术活细胞检测方法进行最佳抗体检测的关键步骤包括：1）获得大量健康的转染细胞，2）验证目的抗原在细胞表面的高表达水平，3）利用一组对照样本确定抗体阳性的阈值，4）确认数据的可重复性。

健康细胞的培养是该技术成功的关键。HEK293细胞以其易于培养、转染效率高以及不表达神经元蛋白的特性而广为人知，因此常被用于基于细胞的检测，以发现针对特定神经元抗原的抗体^4,5,8-10。为了准确计算MFI，获得高比例活GFP⁺细胞的最优转染率对该检测至关重要。因此，构建GFP⁺ HEK293^NMDAR+、HEK293^D2R+或HEK293^CTL的多克隆稳定细胞系具有优势，因其可提供稳定且...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
pIRES2-EGFP 载体	Clontech	6029-1
人HA-多巴胺-2受体（D2R）cDNA	密苏里州&T cDNA资源中心	DRD020TN00
人NMDAR亚基1（NR1）cDNA			A. Vincent 教授惠赠  （英国牛津）
单克隆纯化小鼠抗人NR1抗体（克隆：54.1）	BD Pharmingen	556308
小鼠纯化的单克隆抗DRD2 IgG（克隆：1B11）	Sigma-Aldrich	WH0001813M1-50UG
Alexa Fluor 647 驴抗小鼠 IgG（H + L）	Invitrogen	A31571
Alexa Fluor 647 山羊抗人 IgG（H + L）	Invitrogen	A21445
杜尔贝科’含4.5 g/L D-葡萄糖、L-谷氨酰胺和110 mg/L丙酮酸钠的改良型厄尔氏培养基（1x）	Invitrogen	11995-065
胎牛血清	Invitrogen	10099-141
庆大霉素	Invitrogen	15710-072
GlutaMAX	Invitrogen	35050-061
青霉素-链霉素	Invitrogen	15140-122
遗传霉素	Invitrogen	10131-035
杜氏磷酸盐缓冲液（1x）（-Ca2+/-Mg2+)	Invitrogen	14190-144
含酚红的 TrypLE Express (1x)	Invitrogen	12605-028
0.9% 氯化钠	Baxter	AHF7975
聚乙烯亚胺	Polysciences 公司	9002-98-6
Versene	Invitrogen	15040-066
XhoI	罗氏	10899194001
NheI	罗氏	10885843001
PureLink PCR 纯化试剂盒	Invitrogen	K3100-01
JetQuick 凝胶回收离心柱试剂盒	基因组学	420050
T4 DNA连接酶	罗氏	10481220001
质粒 加 Maxi 试剂盒	Qiagen	12963
设备/软件名称	公司	货号	模型/版本
配备高通量进样系统的流式细胞仪	BD 生物科学		BDLSRII 配 HTS
倒置显微镜	奥林巴斯		CKX41（配备汞灯和U-RFLT50电源）
电子多通道移液器（15-300） μl)	Eppendorf	613-2240P	12通道Xplorer Plus
Excel	微软		2010
Prism	GraphPad Software, Inc.		v4
FlowJo	Treestar		v7.5
50 ml 聚丙烯锥形管	BD 生物科学	352070
6孔板	BD 生物科学	353046
组织培养瓶（T75）	BD 生物科学	353136
Parafilm	佩秦尼塑料包装	PM-992
V型底96孔板	康宁	651180