在果蝇睾丸中成像中心体

摘要

中心体蛋白成像 果蝇 精子发生是鉴定中心体生物学新关键蛋白以及阐明已知相关蛋白在该过程中特定功能的有力方法。

摘要

中心体是保守的基于微管的细胞器，其结构和功能在细胞周期及细胞分化过程中发生显著变化。中心体在有丝分裂期间决定细胞分裂轴，并在间期启动纤毛的形成。介导这些动态变化的蛋白质身份目前仅部分明确，许多已知参与这些过程的蛋白质功能仍处于初步认知阶段。近期研究表明，Drosophila 精子发生过程为鉴定对中心体功能和形成至关重要的新蛋白质提供了有力系统，同时也为深入了解已知因子在中心体相关过程中的特定功能提供了途径。Drosophila 是一种成熟的遗传模式生物，其中中心体基因的突变体易于获得且便于分析。此外，近年来光学显微镜的灵敏度和分辨率显著提高，以及稳定遗传标记的中心体标记物的开发，极大地提升了利用 Drosophila 睾丸作为简单且易于获取的模型系统来研究中心体的能力。本文描述了使用遗传标记的中心体标记物进行遗传筛选以发现新的中心体突变体，并揭示新鉴定基因的特定功能的方法。

引言

Drosophila 睾丸是研究多种细胞和发育过程的合适器官系统，多年来已被广泛综述^1-9。 本文重点介绍利用Drosophila 睾丸研究中心体，这是一种保守的细胞器。与其他系统一样，Drosophila 睾丸中的中心体在有丝分裂、减数分裂和纤毛发生过程中发挥功能¹⁰。中心体由一对基于微管的结构——即中心粒——以及围绕其周围的复杂蛋白质网络（称为中心粒周围物质，PCM）组成。这一对中心粒包括一个较老的母中心粒和一个较年轻的子中心粒。当细胞进入有丝分裂时，两个中心粒分离、复制，并获得大量PCM，最终形成两个独立的中心体。包含原始母中心粒的中心体被称为母中心体，而包含原始子中心粒的中心体则被称为子中心体。

由于多种原因，果蝇（Drosophila）睾丸是通过荧光显微镜研究中心体生物学分子基础的理想材料。

1. 大部分的 黑腹果蝇 在睾丸中对中心体生物学至关重要的蛋白质在真核生物中是保守的，这表明通过研究中心体可获得与人类及其他物种中心体生物学相关的新见解 果蝇 睾丸 ^1,11-14 .
2. 进行突变体分析 果蝇 提供了显著优势，因为与其他许多模型不同，中心体突变在 果蝇 不会导致胚胎致死，因此可进行中心体功能的经典遗传学分析。这一独特的特性使得 果蝇 是由于母源性贡献在胚胎发育的关键阶段持续存在所致。 ^1,11-14 因此，可以：a）研究完全消除中心体形成的突变；b）在母源贡献被耗尽后，研究在早期胚胎中由母源贡献形成的正常中心体在突变背景下的命运（该方法的原理见 ¹¹).
3. 带有遗传编码荧光标签的功能性转基因可用于标记中心体。许多品系利用蛋白自身的启动子驱动转基因的转录，以避免强烈过表达。这一点尤为重要，因为蛋白过表达常导致干扰中心体功能分析的人工假象 ^1,11 .
4. 中心粒和中心体在整个细胞周期中始终保持独特的长度 果蝇 精子发生，从而通过成像实现对中心体的快速且简便的分析。
5. 精子发生和中心体生物学的连续步骤在睾丸中按时间顺序排列，起始于睾丸顶端的精原干细胞中心体，终止于睾丸底部成熟精子细胞中中心体尺寸和活性的降低图1和图2这有助于在精子发育的不同阶段对中心体功能进行简便的识别与分析。
6. 睾丸可轻松从雄性幼虫、蛹及成虫中解剖获得 ²⁷.
7. 在精子发生过程中，中心体及其中心粒会经历多种组成、结构和功能状态的变化，以参与有丝分裂、减数分裂以及纤毛的形成。在这些过程中，中心体会进行组装、复制、迁移、锚定于细胞特定区域、成熟、分裂，并形成纤毛。此外，成熟精子细胞中的中心粒会产生一种名为远端中心粒附属结构（PCL）的中心粒前体 ¹在成熟的精子细胞中，中心体也会经历一个称为中心体缩减的过程，该过程中会丢失许多中心粒周围物质（PCM）和中心粒的组分。图1和图2因此，对睾丸的研究可揭示中心体生命周期的多个方面，例如干细胞中中心体的保留、中心粒复制、中心粒稳定性、中心粒延长、中心粒分离与分配、中心体周围物质（PCM）的招募、纤毛形成、远端中心粒附属结构（PCL）的形成、中心体缩减以及星体微管成核等过程。
8. 最后，中心体生物学的研究还受益于其他已知的特性 果蝇 具有较短的世代时间、遗传操作简便，以及能够进行随机和定点诱变等优点，使其成为生物学研究中首选的模式生物。

综上所述，Drosophila 精巢的上述特性为研究中心体提供了一个可通过简便、快速且详细的成像手段进行观察的模型。本文所述技术已被应用于研究中心体生物学的多个方面，包括中心粒的形成¹¹、中心粒复制¹⁵、中心体周围物质（PCM）的招募¹⁶、中心体的调控¹⁷以及纤毛发生¹⁸。这些技术还被用于研究中心体在其他生物学领域中的作用，例如减数分裂调控¹⁹、纺锤体组装²⁰以及不对称干细胞分裂过程中的中心体活性²¹等。

中心体成像实验从获取表达遗传标记中心体蛋白的果蝇并分离雄性幼虫、蛹或成虫的睾丸开始。这类果蝇可由多个研究团队提供^{1,11,15,22-25}。幼虫期睾丸包含减数分裂前的所有精子发生阶段，在分析在蛹期或成虫期致死的突变时尤为有用。然而，晚期蛹或年轻成虫的睾丸结构最为完整，且包含精子发生过程中减数分裂前和减数分裂后的所有阶段，因此更适合用于分析。由于精子细胞数量随果蝇年龄增长而减少，使用成虫睾丸也适用于在衰老背景下研究中心体²⁶。此前已有文献描述过从成虫果蝇中分离睾丸的方法²⁷。

中心体的成像及其功能研究 黑腹果蝇 通过以下三种相关途径可实现睾丸的处理（图3选择哪一条路径最为合适，取决于研究人员所要解决的问题的性质。

方案A涉及活体睾丸的成像。这是三种方案中最快的一种，但仅适用于无需保存样本且不需要进行免疫染色的情况。在方案A中，将睾丸（完整、刺穿或切开）置于载玻片上，并在盖玻片下小心压片，使细胞分散为单层，便于识别。随后使用相差显微镜和荧光显微镜对细胞进行观察。相差显微镜的应用对于分析黑腹果蝇（Drosophila）睾丸尤为重要，因为它能够揭示其他透射照明方式无法观察到的细胞结构信息，从而快速识别精子发育的各个阶段^28,29。然而，方案A存在两个主要缺点：第一，睾丸破裂后，细胞的形态完整性常常受到破坏；第二，未固定的细胞有时会在样本中移动，导致难以对特定区域进行多层共聚焦成像。为了便于对特定细胞类型的分析，可预先对睾丸进行刺穿或切割，以控制其破裂方式，从而使盖玻片下的压片过程对目标细胞类型的形态影响最小化。

B方案涉及睾丸的化学固定。该方案的样本制备所需时间中等，其优点在于固定的样本可保存以供后续分析。此外，固定处理可使细胞结构更加坚固，从而在成像过程中最大限度地减少样本的移动。然而，化学固定后相位差显微镜的成像信息量显著降低，导致某些精子发育阶段难以识别。

C路线耗时最长，但其额外优势在于细胞结构已被固定并进行了免疫染色，从而可以观察那些无法通过合适的遗传标签标记的蛋白质。目前已有大量商业化的或来自不同研究团队的抗体可用于对黑腹果蝇（Drosophila）睾丸中的中心体及中心体相关结构进行免疫染色。

方案

1. 轨道 A. 活体睾丸的制备

1. 通过将 8.0 g NaCl、0.2 g KCl、1.44 g Na₂HPO₄ 和 0.24 g KH₂PO₄ 溶解于 800 ml 蒸馏水中配制 PBS，并将 pH 值调节至 7.4。加水至总体积为 1 L，经高压灭菌后保存。
2. 按照先前所述方法²⁷分离睾丸组织。
3. 将 1 mg/ml 的 DAPI 储存液用 PBS 稀释至 1 μg/ml，配制 DAPI 染色缓冲液。使用铝箔包裹试管以避光，并在 -20 °C 下保存。
4. 分离睾丸后，将样本置于经正电荷处理的载玻片表面，滴加 6 μl DAPI 染色缓冲液，孵育 10 分钟。睾丸组织可良好地黏附于市售的正电荷载玻片上，便于样本操作。此类载玻片表面经过共价修饰而带有稳定的正电荷，类似于多聚赖氨酸包被，可促进睾丸组织与玻片表面的结合。
5. 用 PBS 替换染色缓冲液两次，每次加入 6 μl，以洗去多余的 DAPI。每次洗涤后使用滤纸从边缘吸去液体。注意避免在吸液过程中意外移除睾丸组织。
6. 向样本中加入 6 μl PBS。缓冲液体积应根据盖玻片大小进行适当调整。本方案中提供的体积适用于 18 × 18 mm 的盖玻片。可选步骤：建议在目标细胞类型所在的大致位置附近用锋利洁净的手术刀刺破睾丸组织。此举可在压片过程中减少对这些细胞的压力，从而保持其结构完整性。
7. 小心地将盖玻片覆盖在样本上方。
8. 使用透明指甲油密封盖玻片边缘，以防止成像过程中活体样本中的缓冲液蒸发。
9. 使用记号笔标记睾丸的位置，以便于在载玻片上快速定位样本，随后进行成像。
10. 用 PBS 替换染色缓冲液两次，每次加入 6 μl，以去除多余的 DAPI 染色缓冲液。每次洗涤后使用滤纸吸去液体，注意避免在吸液过程中意外移除样本。

2. 轨道 B. 固定睾丸的制备

1. 通过将37%的甲醛储备液用PBS稀释，配制终浓度为3.7%甲醛的1×PBS固定液。
2. 将1 mg/ml的DAPI储备液用PBS稀释至1 μg/ml，配制DAPI染色缓冲液。
3. 在带正电荷的玻璃载玻片上滴加6 μl PBS，将睾丸组织浸入其中。
4. 手动将睾丸组织排列成线性或其他所需方向。
5. 用滤纸吸去PBS，更换为6 μl固定液，室温固定5分钟。
6. 用滤纸吸去固定液，加入6 μl DAPI染色缓冲液，室温染色10分钟。
7. 小心地将18 × 18 mm的盖玻片覆盖在样本上方。
8. 用透明指甲油密封盖玻片边缘，防止成像过程中缓冲液蒸发。
9. 使用记号笔标记睾丸的位置，以便于在载玻片上快速定位样本，随后进行成像。

3. 跟踪 C. 免疫染色睾丸的制备

盖玻片硅化处理：将多个 18 × 18 mm 的盖玻片浸入盛有硅化溶液的小托盘中，在通风橱内室温下孵育 1 分钟。确保盖玻片完全浸没且彼此不重叠堆叠。

1. 将样本置于硅化盖玻片上的一滴 5 μl PBS 中。根据需要调整睾丸的方向，并使用锋利的解剖刀刺破睾丸。轻轻将一张带正电荷的玻璃载玻片盖在盖玻片上，使 PBS 在盖玻片与载玻片之间均匀分布。用一小块滤纸吸去盖玻片与载玻片之间的多余缓冲液。当滤纸吸去缓冲液时，压力增加会使睾丸压平。应同时制备多个样本，因为在整个实验过程中可能会有部分样本丢失或损坏。如果需要同时制备不同类型的样本，可使用玻璃刻刀标记载玻片。
   1. 将盖玻片在水中清洗 3 次，每次 1 分钟；随后在 70% 乙醇中清洗 3 次，每次 1 分钟；最后再在水中清洗 1 次，持续 1 分钟。将硅化后的盖玻片置于通风橱下自然晾干。
2. 将载玻片放入液氮中，使样本冷冻 5–10 分钟。
3. 使用大号镊子将载玻片从液氮中取出。用解剖刀迅速移除盖玻片。样本应保留在载玻片上。在此过程中需小心操作，避免通过滑动盖玻片而造成样本涂抹或损伤。
4. 将载玻片置于玻璃 Coplin 染色缸中，浸入预冷的甲醇中，在 -20 °C 下孵育 15 分钟。
5. 将载玻片转移至另一玻璃 Coplin 染色缸中，其中含有预冷的丙酮，在 -20 °C 下孵育 30 秒。
6. 使用玻璃 Coplin 染色缸，在室温下用 PBS 清洗载玻片 1 分钟。
7. 通过向 PBS 中添加 0.1% Triton-X100 和 1% 牛血清白蛋白（BSA）配制 PBST-B。为减少非特异性二抗结合产生的背景信号，可用与二抗同源物种的 5% 正常血清（见步骤 3.14）替代 BSA。
8. 将载玻片置于玻璃 Coplin 染色缸中的 PBST-B 中，在室温下孵育 10 分钟，以封闭非特异性结合位点。
9. 在湿盒的孔中加入水。盒内湿度可在孵育过程中最大限度减少抗体溶液从样本上的蒸发。
10. 通过向 PBST-B 中添加 100 μg/ml RNase A 配制 PBST-BR。RNase A 可降解样本中的 RNA，同时因其对玻璃表面的强吸附作用，还可作为额外的封闭剂。
    1. 在样本上方放置一块约 1×1 cm 的 Parafilm 膜，以使抗体溶液均匀铺展并防止其蒸发。盖上湿盒，于室温下用一抗孵育样本 1 小时。
11. 从 PBST-B 中取出载玻片。用滤纸小心吸干载玻片上样本周围区域的液体，注意不要吸干样本本身。最后将载玻片放入湿盒中，样本面朝上。
12. 在样本上方轻轻加入 100 μl 用 PBST-BR 稀释的一抗溶液（对于未表征的抗体，1:200 通常是一个良好的起始浓度）。
    1. 用一块约 1×1 cm 的 Parafilm 膜覆盖样本，盖上湿盒。于室温下用二抗孵育样本 1 小时。
13. 打开湿盒，用镊子小心移除载玻片上的 Parafilm 膜。将载玻片置于玻璃 Coplin 染色缸中，在室温下用 PBST 孵育 5 分钟进行清洗。重复此步骤，共清洗三次。
14. 从 PBST-B 中取出载玻片，放入湿盒中，样本面朝上。在样本上方轻轻加入 100 μl 用 PBST-BR 稀释的二抗溶液。
15. 打开湿盒，用镊子小心移除载玻片上的 Parafilm 膜。再次将样本在玻璃 Coplin 染色缸中用 PBST 清洗 3 次，每次 5 分钟，随后再用 PBS 清洗 3 次，每次 5 分钟。
16. 使用 Kimwipe 纸和滤纸小心擦干载玻片表面，注意避免触碰或干燥样本。
17. 在样本上加入 6 μl 封片剂，盖上干净的盖玻片（无需硅化处理），并用指甲油密封边缘。
18. 使用记号笔标记睾丸的位置，以便于在载玻片上快速定位样本，随后进行成像。

4. 成像注意事项

可以使用正置或倒置的普通光学显微镜或共聚焦显微镜进行成像。显微镜应配备相差显微功能，这对于活体睾丸样本的成像尤为重要（A路线）。该功能最近已在共聚焦显微镜上实现。

当睾丸自发破裂时（A 轨道），其顶端（干细胞区域）通常保持完整且易于识别，可作为初始定位和定向的良好标记。

中心粒是相对较小的结构，因此应尽量使用63倍或100倍物镜、4-6倍的缩放系数，以及至少512 × 512像素的分辨率进行成像。

结果

中心体在精子发生过程中经历多种形态和功能上的转变。精子发生的这一特征使得睾丸成为研究中心体生物学多个方面的有用系统。其中一个易于观察的过程是中心体的伸长。在精原细胞中，中心粒标记物Ana1-GFP标记出长度为0.6 μm的中心粒图4a）。该中心粒在精子发生过程中延长，在接近成熟的精子细胞中可达到2.5 μm的长度。由于中心粒在 果蝇 精子具有独特的长形结构，因此成像可用于对中心体的伸长进行定量分析（图4b）。在突变体背景下也可进行中心粒长度的分析，已有多种突变体被鉴定出可影响中心粒的生长（图5。例如 始终早期 (aly 以及 炮弹 (能，减数分裂开始前即导致精子发生停滞的突变 ³⁰ 但不阻断中心粒的延长。在这些突变体中，成熟精母细胞的中心粒长度增长至约2.4 μm，而对照细胞的中心粒最长仅达1.8 μm。

图1. 精子发生与中心体生物学。A) 干细胞与精原细胞的发育。所有精子细胞均起源于位于睾丸顶端的干细胞。每个干细胞进行不对称分裂，产生一个继承母源中心体的干细胞和一个继承子代中心体的前体精原细胞³¹。精原细胞形成后，会被2个囊细胞包围，这些囊细胞在整个精子发生过程中持续包裹精母细胞和精子细胞。精原细胞连续分裂4次，产生16个精原细胞，每个细胞含有两个中心粒。B) 精母细胞的发育与减数分裂。在精母细胞发育期间，中心粒再复制一次，每个细胞形成四条中心粒，成对排列，每囊共64条中心粒。在精母细胞发育早期，每条中心粒移向质膜，锚定于膜上，并延伸形成类似初级纤毛的结构^18,32-34。在成熟的精母细胞中，中心粒长度可达约1.8 μm。中心体在减数分裂中发挥关键作用。在减数分裂I期间，仍附着于质膜上的中心粒对向细胞中心移动，并在其远端引发细胞膜内陷。中心粒周围的中心体周围物质（PCM）增加，成核形成星体微管，并与纺锤体极共定位。在进入减数分裂II的过程中，中心粒对分离，使得每个纺锤体极仅含有单个中心粒。C) 精子形成。减数分裂II结束时，早期圆形精子细胞具有一个附着于内陷质膜的中心粒。一个大型圆形线粒体衍生物位于细胞核附近，并在后期圆形精子细胞中沿正在伸长的轴丝开始延伸。在精子发生过程中，轴丝在细胞质内形成并伸长。此外，一种称为PCL（近端中心粒样结构，Proximal Centriole Like）的新中心粒结构出现在原有中心粒附近¹。精子发生结束时，共享同一囊腔的细胞彼此分离，成为完全成熟的可动精子。精母细胞发育图示(B)和精子形成图示(C)分别仅展示每囊16个精母细胞和64个精子细胞中的一个细胞，未显示囊细胞。 点击此处查看高清大图。

图 2. Drosophila 精巢。 表达泛中心粒标记物 Ana-1-GFP 的整体装片精巢的相差显微图像与 GFP 荧光显微图像的叠加图。图 1 中对应于图版 1-3 的不同区域由一条红色虚线分隔：A) 干细胞与精原细胞，B) 精母细胞与减数分裂，C) 精子形成。

图3. 在中国台湾 Drosophila 睾丸中成像中心体的路径。

图4. 精子发生过程中的中心体延长。A) 每一阶段均显示相差图像（左）、荧光图像（中）以及中心体的放大图像（右）。相差图像根据细胞、细胞核、核仁和线粒体的位置与形态，显示特定的细胞阶段。荧光图像显示用DAPI染色的DNA（蓝色）。中心体图像显示由Asterless-GFP（Asl，上方图像）和Ana1-GFP（Ana1，下方图像）标记的中心体。白色圆圈在相差图像和荧光图像中均标示细胞膜。荧光图像中的白色虚线圆圈和灰色圆圈分别标示细胞核和核仁的位置。黄色箭头指向Y染色体环。红色虚线圆圈标记线粒体。阶段1-6参考文献²⁹，阶段13-17参考文献³²中对细胞阶段的描述。阶段1：初级精母细胞。识别为睾丸顶端的小细胞。阶段2a：极性精母细胞。通过细胞核一侧存在线粒体帽来识别。阶段3：非极性精母细胞。相对于初级精母细胞体积较大，且无细胞核一侧的线粒体帽。阶段4：初级精母细胞。通过所有3个Y染色体环的出现来识别。阶段5：成熟初级精母细胞。精子发生过程中产生的最大精母细胞，通过细胞核进一步增大来识别。阶段6：减数分裂前初级精母细胞。Y染色体环解体，细胞核消失。阶段13：洋葱期精子细胞。圆形细胞，含有大小相等的细胞核和线粒体。阶段17：晚期精子细胞。识别为仍属于64个精子细胞束的一部分的细长精子细胞，细胞核位于睾丸基部附近。细胞核比精囊中成熟的精子细胞略宽。比例尺：10 μm 和 1 μm。B) 图表显示通过Asterless-GFP（蓝色）和Ana1-GFP（绿色）测量的各阶段平均值与标准差。在阶段6中，Asterless-GFP（蓝色）和Ana1-GFP（绿色）的平均值与标准差重叠，仅显示Asterless-GFP（蓝色）。从阶段13开始，Asterless-GFP不再标记整个中心粒，因此未测定测量值（ND）。

图5. aly 和 can 突变体精母细胞第6阶段中异常延长的中心粒。A-C) 整个睾丸的光镜图像及由Ana1-GFP标记的代表性中心体的荧光图像。注意 aly 和 can 突变体睾丸形状异常，这是由于减数分裂阻滞导致精子细胞缺失所致。D) 图表显示野生型、aly 和 can 中心粒长度的平均值、标准差及数据分布情况。每个数据点的样本数量在括号中注明。比例尺：1 μm。

讨论

利用基因标记的中心体标记物在果蝇睾丸中研究中心体生物学，是一种在野生型和突变型背景下评估中心体功能与活性的有效方法。其中，路径 A 适用于快速筛选中心体异常，例如结构畸形、分离错误、不稳定或长度异常，有助于鉴定新的突变体。此外，活体标本中的精子细胞纤毛在解剖后约 15 分钟内仍保持运动能力，因此在路径 A 中使用活体睾丸还能方便地研究精子运动能力。由于精子运动纤毛的活性与中心体功能直接相关，因此可开展实验以确定不同中心体突变对纤毛功能的影响。路径 B 适用于需要统计数据分析的更特异性观察，例如计数每个细胞中的中心粒数目或每个囊泡中的细胞数目。路径 C 最适用于需要抗体染色的精细观察，例如标记特定细胞类型（如干细胞）、染色无可用标签的蛋白质（如乙酰化微管蛋白），或验证某种蛋白质在突变体中是否缺失或错位。

在对中心体及中心体相关结构进行成像时，使用基因标记的示踪分子而非抗体不仅实验操作更为简便，而且能够提供更可靠且可重复的结果。因此，利用基因标记的中心体蛋白是开展需要大量数据集的机制性与定量分析的一种可靠方法。例如，基因标记的中心体标记物在中心粒长度的定量分析中已体现出重要价值。此类分析表明，各种突变可根据中心粒长度的变异情况分为两类：一类突变会改变中心粒长度，但不影响其标准差¹；另一类突变则同时影响中心粒长度及其长度的标准差¹¹。此类定量数据可为特定中心体基因的功能提供有价值的见解。若中心体突变体表现出中心粒长度异常且标准差增大，可能是由于中心粒结构的稳定性遭到破坏；而若中心粒长度异常但标准差保持正常，则提示该突变可能并未在结构上破坏中心粒的稳定性，更可能是由于调控中心粒长度的调节机制发生了改变。由于免疫染色结果存在不一致性，仅依赖抗体标记物进行定量分析较为困难。

中心体是一种体积较大且结构复杂的蛋白质结构，其内部包含许多特异性的蛋白质。使用基因标记的中心体标记物而非抗体，能够持续地标记中心体内部的组分，而这些组分的抗原表位可能无法被抗体标记所识别。例如，利用抗体对Bld10进行定位研究时，发现该蛋白富集于中心粒的远端和近端¹³，而Bld10-GFP则显示出更为均匀的分布模式¹。然而，也必须考虑特定基因标记蛋白的表达水平，因为这可能影响蛋白的分布情况。在内源启动子驱动下表达的Sas-4-GFP和SAS-6-GFP仅定位于中心粒的近端^1,16,35；相反，在强效泛素启动子驱动下表达的Sas-4-GFP和SAS-6-GFP则沿整个中心粒长度分布^12,14。另一个重要考虑因素是基因标签对蛋白功能的影响。可通过将转基因蛋白引入突变体背景中，并检测该转基因蛋白是否能够挽救突变表型，来验证基因标记蛋白是否具有正常功能。

可以使用多种化学固定剂对Drosophila精巢进行固定。本文描述了甲醛（B路线）和甲醇-丙酮（C路线）两种固定方法。然而，这两种固定剂可互换使用，由于不同固定剂可能在化学上破坏抗体识别的天然表位，因此用于免疫染色的合适固定剂需通过实验确定。常用的固定剂及孵育条件包括：3.7%甲醛，室温孵育5分钟；甲醇，-20 °C孵育15分钟；丙酮，-20 °C孵育10分钟；甲醇，-20 °C孵育15分钟，随后丙酮，-20 °C孵育30秒；乙醇，-20 °C孵育20分钟。尽管使用丙酮、甲醇和乙醇固定的样品在免疫染色时无需额外的透化步骤，但甲醛固定后需在室温下用PBST-B缓冲液孵育1小时，以透化细胞膜，使抗体能够进入细胞内结合表位。此外，某些固定剂对特定抗原更为适用。例如，甲醛适用于小分子蛋白的固定，而甲醇和丙酮则更适合大分子复合物的固定³⁶。

免疫染色 果蝇 睾丸组织已在此前的研究中被用于观察染色质结构和微管细胞骨架 ^29,37在此（Track C）中，该实验方案已针对含有基因标记蛋白的中心体结构分析进行了优化。我们提供了该方案的详细描述，以指导在该领域经验不足的研究人员进行操作。 黑腹果蝇 睾丸。该操作还包括一些改进措施，以提高睾丸组织的保存效果和形态学质量，例如使用硅化盖玻片和带正电荷的玻璃载玻片。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DAPI	Invitrogen	D1306
带正电荷载玻片	AZER Scientific	EMS200A+
Feather 微型手术刀	电子显微镜科学公司	72045-30
37% 甲醛或多聚甲醛	菲舍尔科技公司	BP531-500
磷酸盐缓冲液 (PBS)	Boston Bioproducts	BM-220
18×18 mm 盖玻片，1.5 号	VWR	48366 205
指甲油	电子显微镜科学公司	72180
Sigmacote	Sigma-Aldrich	SL2-100 ml
甲醇	菲舍尔科技公司	A412-4
丙酮	菲舍尔科技公司	A949-1
Triton-X100	Sigma-Aldrich	T9284-100ML
牛血清白蛋白 (BSA)	Jackson ImmunoResearch	001-000-162
RNA酶 A	5 prime	2900142
滤纸	Whatman	1001-055
玻璃刻蚀器	Dremel	290-01
TCS SP5 共聚焦显微镜	Leica
封片介质	电子显微镜科学公司	17985-10
免疫染色湿盒，黑色	电子显微镜科学公司	62010-37
玻璃染色缸，带螺帽	电子显微镜科学公司	70315