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方法文章

一种用于诱发点状触觉刺激的简易刺激装置：寻找局部场电位向峰电位转换的探照灯

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DOI：

10.3791/50941

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2014年3月25日

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1Institute of Molecular Bioimaging and Physiology (IBFM), Department of Biomedicine, National Research Council, 2Institute of Biomedical Technologies (ITB), Department of Biomedicine, National Research Council, 3Faculty of Life Sciences, University of Manchester

本文内容

摘要

为了阐明局部场电位（LFPs）向峰电位转换的复杂过程，构建了一种适用于轻度机械性外周刺激的合适刺激器。作为应用实例，采用多目标优化策略分析了从体感皮层记录到的峰电位活动。结果表明，所提出的刺激器能够以毫秒级和毫米级的精度传递触觉刺激。

摘要

当前神经生理学研究的目标是开发方法，以探究神经元到神经元之间的信号传递路径，特别是从锋电位到局部场电位（LFPs）以及从局部场电位到锋电位的转换过程。

局部场电位（LFPs）对锋电位活动具有复杂的依赖性，而它们之间的关系目前仍 poorly被理解1。阐明这些信号之间的关系，不仅有助于临床诊断（例如，深部脑刺激的刺激范式），也有助于更深入地理解正常与病理状态下神经编码策略（例如，癫痫、帕金森病、慢性疼痛）。为此，必须解决与刺激装置、刺激范式及计算分析相关的技术难题。因此，开发了一种定制的刺激装置，以实现时空上高度可控的刺激，并避免机械共振。随后，作为示例，提取了一组可靠的LFP-锋电位关系。

通过细胞外记录大鼠初级躯体感觉皮层对刺激的胞外放电、联合锋电位及局部场电位（LFP）响应，评估了该装置的性能。随后，采用多目标优化策略，建立了基于局部场电位预测锋电位发生的预测模型。

该范式应用表明，该设备非常适合传递高频触觉刺激，性能优于常见的压电驱动器。为验证该设备的有效性，展示了以下结果：1）局部场电位（LFP）反应的时间特性和可靠性与锋电位反应高度一致；2）LFP对刺激历史敏感，不仅能捕捉平均反应，还能反映锋电位活动的单次试验间波动；最后，3）利用LFP信号可建立一系列预测模型，用以捕捉锋电位活动的不同特征。

引言

在信号处理领域，冲激响应为动态系统的行为提供了基本的表征。

尽管理想的脉冲刺激在实际中难以实现，但通过使用能够产生高频位移的执行元件，可以获得对其较为合理的近似。这种类型的轻触-振动刺激已知可同时作用于皮肤深层例如 快速反应、快速适应的环层小体2 以及浅表感受器（例如 低阈值慢适应的默克尔盘状结构2.

目前的刺激装置主要采用压电致动器，存在诸多缺陷，尤其是共振和位移较小的问题。为克服这些缺陷，本文提出了一种替代性的脉冲式刺激方法，即在中频扬声器锥盆的膜片中心垂直安装一个钝化尖端（本实验中采用仙人掌状平滑尖端）。该方法可实现更大的位移和更宽的频率范围。

此类设备的一个有效应用是研究局部场电位（LFPs）与锋电位之间依赖关系的相关神经生理学问题。由于这些电事件之间存在细微的时间关联，因此需要一种精确调控的设备来传递外周刺激。刺激必须尽可能快速且具有空间选择性，以减少 "背景噪声" 并增强目标信号。为此，刺激装置与刺激递送方案均针对该任务进行了联合优化。本文中，我们描述了该技术并展示了一些代表性结果。

已设计并优化了一种基于随机化成对脉冲的刺激方案，以避免习惯化。该方案兼具经典成对脉冲的优势，同时降低了刺激与神经元自发周期性簇发放活动之间发生伪同步的可能性。

通过使用这种随机成对脉冲刺激，能够快速且可靠地获得局部场电位（LFP）和峰电位反应，并捕捉到这些反应的特殊特征，即LFP和峰电位均依赖于刺激历史。事实上，从原始LFP反应中还提取出一组与平均峰电位反应高度相关的三个LFP特征（LFP本身、LFP的一阶导数以及一阶导数的相位）。

目前提出的用于建立由局部场电位（LFP）预测神经脉冲发放模型的方法较少3,4。通常，模型拟合过程中的一个关键环节——同样适用于从刺激信号预测脉冲事件——在于选择合适的目标函数以进行最大化或最小化。尽管已有多种目标函数被提出（例如相关性和相干性）5，但这些方法均无法共同捕捉脉冲响应的全部复杂性。为此，本文引入了一种基于多目标优化的新框架。我们证明，通过使用所设计的方法和该计算框架，可以估计出一组基于强LFP-脉冲关系的预测模型。

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方案

伦理声明

为了研究感觉刺激如何通过神经元活动来表征，必须使用动物并采用体内方法，别无替代。所有动物的处理均遵循意大利及欧洲关于科学研究中动物使用的法律法规（意大利生物伦理委员会，《科研动物处理法令》，1992年1月27日，第116号）。实验实施单位——意大利国家研究委员会（CNR）——代表联合国教育、科学及文化组织（UNESCO）、国际医学科学组织理事会（CIOMS）和国际生物科学联合会（IUBS），加入了国际实验动物科学委员会（ICLAS）。因此，本研究无需单独的实验方案专项审批。意大利卫生部的批准文件在米兰大学伦理委员会档案中编号为“Biella 1, 3/2011”。

1. 实验动物的准备

  1. 选择体重约300-400 g的雄性大鼠。
  2. 对大鼠进行实验前麻醉。
    1. 腹腔注射巴比妥类溶液（戊巴比妥钠，诱导剂量50 mg/kg，维持剂量10 mg/kg）。
    2. 通过足部的低阈值和高阈值机械刺激检查麻醉水平，确保无退缩反射发生。
    3. 通过准确剃除颅骨表面的毛发来准备颅骨皮肤，然后做切口以暴露颅骨表面。
    4. 通过气管插管（内径2 mm，外径2.5 mm）插入气管，并以手术结扎法在气管周围固定插管。
    5. 在气管节段外侧暴露颈静脉，插入连接注射器的导管（PE10）进行插管，并通过血管周围的手术结扎固定。
  3. 将大鼠固定于立体定位仪上。
    1. 固定大鼠身体并置于仰卧位。
    2. 用耳杆固定头部并阻塞吻部。放置耳杆前，在大鼠耳部滴加一至两滴局部麻醉剂（利多卡因）。
  4. 通过电子控制加热垫调节立体定位仪垫的温度，将温度维持在 37.5 °C.
  5. 将气管插管连接至呼吸麻醉装置。
    1. 将呼吸麻醉装置设置为1次呼吸/秒，输送异氟烷（2.5%，0.4–0.8 L/min）和O₂2 (0.15-0.2 L/min)
  6. 用聚维酮碘局部消毒剂仔细清洁颅骨骨窗。
  7. 取一把无菌手术刀，从吻部基底沿中线纵向切至枕骨角。
    1. 用拉钩撑开伤口边缘，并用两把小型cockers钳夹住伤口边缘固定。
    2. 通过将光源照射在颅骨穹窿上，观察其半透明表面，以识别骨膜。小心刮除颅骨穹窿，去除骨膜，暴露骨表面。
    3. 若骨面出现局部出血，可用棉签或外科海绵在骨面加压止血。
  8. 使用细尖笔，在矢状缝与冠状缝的交叉处标记立体定位点前囟。
    1. 在手术显微镜下，辨认覆盖于对侧后肢（用于实验）躯体感觉皮层之上的立体定位区域（S1HL）（前囟，前后向 -0.5 至 1.2 mm，外侧向 -2.3 至 2.5 mm）。
  9. 用细头笔画出待钻孔区域的方形轮廓。
    1. 钻一个9 mm的孔2 移除骨片，在先前确定的蓝色方块上打孔。
    2. 清理并吸收潜在的骨出血。
    3. 小心地移除 硬脑膜 用浸有持续保持在人工脑脊液中的手术海绵覆盖皮层表面 37.5 °C.
  10. 将电极阵列固定在连接至电子显微操作仪的持针器上。
    1. 通过微型连接器将矩阵的头部连接到前置放大器。
    2. 在手术显微镜控制下手动推动电极矩阵至皮层表面（但不接触皮层）。
    3. 打开带有听觉信号的放大器。
    4. 通过电子控制驱动电极矩阵接触皮层表面，直至接触完成，以清晰的噪声音调变化作为接触信号。
    5. 通过电子控制步进下拉电极矩阵（2 μm/step）直至达到350-400 μm 达到皮层第四层（cortical layer IV）。
    6. 通过轻触对侧后爪检查神经元的反应性。
    7. 通过进一步调节深度，直至观察到清晰的放电反应。
    8. 通过静脉注射加拉碘铵（Gallamine thriethiodide，20 mg/kg/hr）使大鼠瘫痪。在整个实验过程中使用折算剂量以维持筒箭毒化水平（0.2 ml/1 hr）。

2. 信号处理

  1. 将软件带通滤波器设置为 [0.1 6000] Hz。
    1. 以 32 kHz 的采样率记录 8 通道微电极阵列的神经信号。
  2. 采集结束后，将记录的信号导出为适用于后期处理的二进制格式。
    1. 使用 Wave_clus 工具箱11 进行峰电位分类处理。

3. 刺激装置的制造与配置

  1. 将仙人掌茎干（尖端钝化）垂直固定在中档扬声器表面，将茎干基部粘接到扬声器帽上。
  2. 编程微控制器，使其向扬声器的驱动电路输送电压脉冲。
    1. 编程微控制器，使其每秒输送两组成对的电流脉冲（见图1C）。
  3. 使用L293D H桥和基本的无源元件将扬声器与微控制器组装在一起（见图1A）。
  4. 将微控制器连接到12 V可充电电池。

4. 刺激方案

  1. 将后肢足背侧粘附于固定框架上，暴露足底表面，并避免关节扭曲。
  2. 将刺激装置的尖端放置于目标肢体/足部位置。
  3. 打开刺激装置。

离线步骤：

5. 刺突反应的评估

  1. 针对每个记录的神经元，计算刺激诱发的放电活动的香农互信息（MI）（刺激类别为 1（有刺激）或 0（无刺激））。
    1. 估计条件响应概率 p(r | s)，其中 s 表示刺激类别，r 表示在固定时间窗口内发放的脉冲数量。
    2. 采用文献9中描述的打乱程序对 MI 估计值进行校正。

6. LFP 反应的评估

  1. 将记录的信号在频率范围 [0.1 100] Hz 内进行滤波，以获得局部场电位（LFP）信号
  2. 按照参考文献10中所述方法计算LFPSNR，即LFP响应性的度量指标

7. 模型估计

  1. 构建如下形式的模型：
    静态平衡方程，\( r_{\text{est}} = \Theta(F(x_1, x_2, x_3)) \)，数学公式。
    其中 x 参数代表三个不同的局部场电位（LFP）特征（x1 为 LFP 本身，x2 为其导数，x3 为其导数的希尔伯特相位），而 F 的表达式如下：
    静态平衡，Σ 符号，表示函数求和的方程，数学概念。
    其中 g 系数为线性组合的权重，f 为一个算子，用于取每个 xi 的绝对值、幂值或原始值。
  2. 使用 NSGAII 算法，基于以下三个目标函数来估计模型参数与算子：i) 一种局部的、逐次试验的拟合度量 静态平衡公式图示；Σnr=1|rest(n)−r(n)|/2Nsp(Nr−Nsp)/Nr，用于数据分析。，其中 Nsp 和 Nr 分别表示总脉冲数和响应向量的长度；ii) 一种基于平均响应的全局拟合度量 性能因子 PF 的静态平衡方程，包含 PSTH(n) 项，数学分析。，其中 Nresp 表示平均响应的长度；iii) 一种模型复杂度的度量（另见）10 化学方程 CO=1.5(1-∑^3_{i=1}g_i^2)，公式，数学表示。。

8. 组织学确认

  1. 处死大鼠。
    1. 实验记录结束后，将动物置于深度气体麻醉（异氟烷 2%，4 L/min）下，并静脉注射过量巴比妥类药物（>50 mg/kg，戊巴比妥钠）。
    2. 等待心脏停搏。
    3. 将大鼠从立体定位仪上取下。
  2. 灌注。
    1. 将大鼠仰卧放置于接液盆中的网格上，以收集灌注过程中的血液和液体。
    2. 通过解剖胸骨并分离其与肋骨连接处，打开胸腔。
    3. 用持针钳夹住胸骨剑突，并将胸骨向上翻起，使覆盖心脏的肋骨分开。
    4. 辨认左心室和右心房，将一连接灌注导管的9号钝头针插入左心室，同时用精细手术剪刀剪开右心房。
    5. 先用冷（4 °C）含肝素生理盐水（250 ml）开始灌注，随后灌注4%甲醛溶液（250 ml）。
  3. 使用合适的镊子打开颅腔，取出脑组织，并将其置于10%甲醛溶液中固定。
  4. 一周后，使用切片机制备组织学切片（厚度10 μm）。
  5. 用焦油紫溶液对脑组织的冠状切片和矢状切片进行染色。

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结果

提示偏移特征

为了表征所提出刺激装置的动力学特性，我们设计了一系列实验。采用一种特定装置，该装置由耦合了硅光电晶体管的砷化镓红外发射二极管组成，用于评估刺激探针的位移量、位移持续时间以及可能存在的位移延迟。通过该光学断续器开关，将刺激器探针置于发射二极管孔边缘（高度 = 1 mm），同时记录微控制器和光电晶体管的输出信号。探针定位过程借助一台最大分辨率为 1 mm 的微步进装置完成。

器件的响应如图2A所示。红线表示光电晶体管的响应，随后是微控制器的响应，后者指示了探针位移的精确起始时刻。值得注意的是，由于换向引起了一个系统性延迟，该延迟已被量化（图2B，在100次试验中的平均值为583 μsec），远低于所需的时间精度（1 msec）。最后，我们测量了探针位移的持续时间，平均为3.96 msec，如图2C所示。

用于捕获局部场电位与脉冲放电关系的随机配对脉冲方案

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讨论

本研究首先提出了一种新型、简单且低成本的装置，可实现快速且空间上点状的感官刺激。随后，验证了一种随机配对脉冲刺激方案及一系列计算分析方法。总体目标是建立一个框架，用于在触觉刺激期间的电生理记录中估计局部场电位（LFP）与动作电位之间的关系。

该设备、实验方案和分析方法共同促成了这一结果，即首次证明了一种能够描述和预测局部场电位到尖峰转换（LFP-to-spike transitions）的确定性方法，而这一神经过程目前仍知之甚少1。

一个关键点在于可编程微控制器板的适当设置，该控制器用于调节防尘罩牵拉探针尖端运动的强度和长度。结果部分已描述了一种合适的解决方案，可实现可靠的高频刺激和相对较大的位移。与传统的压电驱动器相比，该装置具有两个主要优势：避免了典型的机械共振问题，并允许探针尖端产生相对较大的位移。

已知初级体感皮层（S1）中的神经元对触觉刺激具有较大的感受野和快速反应8。这种快速的、类似脉冲的刺激能够有效激活表浅和深层皮...

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披露

作者声明不存在竞争性财务利益。

致谢

SN 和 AGZ 获得了 PON 01-01297 VIRTUALAB 项目资金的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
微步进器AB Transvertex (斯德哥尔摩, 瑞典)用于下拉电极阵列的微步进器
32通道Cheetah系统Neuralynx (蒙大拿州, 美国)电生理记录系统
L293D H桥电路RS Components (奇尼塞洛巴尔萨莫, 意大利)用于连接微控制器与扬声器的桥式电路
H21A3光电断续器开关Fairchild Semiconductor Corporation (加利福尼亚州圣何塞)用于确定电极尖端位移的光敏晶体管
Arduino UnoArduino (都灵, 意大利)用于向扬声器发送电流脉冲的微控制器
微电极阵列GB1FHC 
异氟烷Rhodia Organique Fine Ltd.用于动物麻醉的药物
立体定位仪Narishige (东京, 日本) 
雄性Sprague-Dawley大鼠Charles River (卡尔科, 莱科, 意大利) 
三碘季胺酚Sigma-Aldrich用于动物去神经肌肉阻滞的化合物
焦油紫Sigma-Aldrich 
局部抗菌剂（聚维酮碘10%）Meda Pharma (米兰, 意大利) 
肝素Sigma-Aldrich 
甲醛Carlo Erba Reagents (蓬贾诺米兰内塞, 米兰, 意大利) 

参考文献

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