Method Article

生物分子有序结构由短肽的自组装形成

DOI:

10.3791/50946

⸱

November 21st, 2013

 , 
1Institute of Chemistry and The Center for Nanoscience and Nanotechnology, The Hebrew University of Jerusalem

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文描述了通过自组装的自发过程中形成高度有序的基于肽的结构。该方法利用市售的肽和普通的实验室设备。这一技术可以应用到大量的各种肽，并可能导致新的基于肽的装配体的发现。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在自然界中，复杂的功能性结构是由生物分子的自组装体在温和条件下形成的。了解控制自组装的力量和体外模拟这一过程将带来在材料科学和纳米技术等领域的重大进展。在现有的生物积木，肽具有若干优点，因为它们呈现大幅度的多样性，其在大规模的合成是直接的，并且它们可以很容易地与生物和化学实体1,2修改。几类设计的肽，如环肽，两亲性分子的肽和肽结合物自组装成有序结构在溶液中。同芳香族二肽，是一类含有需要形成有序结构，例如纳米管，球体和纤维3-8的所有分子信息短的自组装肽。种类繁多的这些肽是市售。 。9这里介绍的协议可以潜在地适用于其它类的肽或生物构建块的，并且可以导致新的基于肽的结构的发现和更好地控制他们的集会。

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

自然形成了生物分子自组装的过程有序和功能结构。了解管理这个自发过程的力量可能会导致模仿自组装体外 ，因此在材料科学10,11的区域重大进展的能力。肽，具体而言，抱很大的希望作为一个生物分子构建模块，因为他们目前大型结构的多样性，易于化学合成的，并且可以很容易地与生物和化学实体功能化。多肽自组装领域是率先由查德理和他的同事，谁表现肽纳米管的自组装由环肽交替D-和L-氨基酸12。其他成功的方法的肽组件的设计，包括线性bolaamphiphile肽5，两亲分子（AP）6，非共轭自补离子肽13，表面活性剂样肽 4,14，和二嵌段copolypeptides 15。

一个更近的方法包括短芳族肽的自组装，称为同芳香族二肽。这些肽仅包含2个氨基酸，芳香性质（ 例如苯丙氨酸，苯丙氨酸，二碳酸二叔丁酯（BOC）-苯丙氨酸-Phe的生产）7,8,16-21。由这些同芳香族肽形成的结构包括管状结构，球状，片状组件和纤维6,8,15,21-32。在某些情况下，纤维产生原纤网能够产生水凝胶33-37。这些组件已被开发用于生物传感，药物输送，分子电子学等的应用程序。38-45

本文介绍了需要的，以便开始同芳香族肽的自发自组装的实验步骤。此外，它提出了肽的过程coassembly。这个过程涉及一种以上类型的肽的自组装体单体。

我们的示范包括两种市售的肽的coassembly:将二苯基丙氨酸肽（NH 2-PHE-PHE-COOH）和它的Boc保护的类似物（的Boc-Phe-苯丙氨酸-OH）。每个肽自组装成超分子结构:的二苯基丙氨酸的肽形式的管状组件和的Boc-Phe-苯丙氨酸-OH肽自组装成任一球或纤维取决于溶剂7,17,46。我们混合两种肽在一定比率和特征将得到的组合件通过电子显微镜，力显微镜和FT-IR光谱。该方法证实，它由球形元件的直径为几微米（1-4微米），它们由细长的组件的直径为几百纳米连接（〜300-800纳米）的基于肽的结构的形成。该组件像串珠串在它们的形态，如球形结构似乎就被螺纹细长的组件。因此，我们称之为这些程序集"生物分子项链"。在"生物分子项链"可以作为一种新的生物材料作为药物输送剂或作为支架用于电子应用。此外，通向肽的自组装体的方法可用于与其它类肽和生物分子。这可能会导致更好的了解参与自组装和新的有序结构形成的势力。

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Protocol

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1。同芳香族二肽的自组装

  1. 称量所需的肽在其冻干形式（ 例如 NH 2-PHE-PHE-OH，的Boc-Phe-苯丙氨酸-COOH）和通过在1,1,1,3,3,3 -六氟溶解肽制备的原液基-2 -丙醇（HFP）到适当的浓度（ 例如 100毫克/毫升为NH 2-PHE-PHE-OH和Boc-苯丙氨酸-苯丙氨酸-COOH）的7,17,46。
  2. 采用涡和地方在板凳上，直到肽完全溶解，溶液似乎很清楚（几分钟）混合溶液中。
  3. 稀释的肽储备溶液，用适当的溶剂中，以适当的浓度（NH 2-PHE-PHE-OH中的三次蒸馏水（TDW）对碳纳米管的形成，例如 2毫克/毫升;通过加入2微升的肽的储备溶液至98微升TDW，的Boc-Phe-苯丙氨酸-COOH的乙醇为球形结构的形成5毫克/毫升）。
  4. 保持该溶液于室温24小时。
  5. 为了避免任何预聚合，准备新鲜的原液每一个实验。

2。两个同芳香族二肽Coassembly

  1. 通过混合TDW和无水乙醇的等体积制备50％乙醇的溶液中。用旋涡混合两种解决方案。
  2. 称量2毫克的NH 2-PHE-PHE-OH的肽和1毫克的Boc-Phe-苯丙氨酸-OH的肽组成。溶于HFP每种肽以100毫克/毫升的浓度。
  3. 采用涡流混合肽原液，并将其放置在板凳上，直到肽完全溶解和解决方案似乎是清楚的。
  4. 融合的肽储备液至所需的比例。在这个特定的实验中混合10微升的NH 2-PHE-PHE-OH的肽6微升的Boc-Phe-苯丙氨酸-OH肽（以5:3分别末期比）组成。由于HFP溶剂的高波动性，建议准备了大量的这种原液（在LEAST 10微升）。
  5. 用旋涡混合的混合肽原液。
  6. 稀混合的肽储备液，用50％乙醇至所需的最终浓度。在这个特定的实验中，为了分别得到的5毫克/毫升的最终浓度为NH 2-PHE-PHE-OH和3毫克/毫升的Boc-Phe-苯丙氨酸-OH添加8微升的混合肽原液到92微升的50％乙醇溶液中。用移液管轻轻摇匀瓶内的溶液。
  7. 保持该溶液于室温放置24小时。
  8. 应当指出的是，由于溶剂的高挥发性的性质，本实验是在肽的浓度的微小变化敏感。因此，新鲜原液应为每个实验做好准备。

3。自组装结构用扫描电子显微镜（SEM）表征

  1. 孵化后24小时，应用的肽溶液的10微升滴在玻璃科夫ř滑移和干燥在室温。
  2. 涂层在玻璃上使用溅射涂布机90秒一薄层金（几个纳米）的样品。
  3. 图片使用SEM工作在10〜20千伏的程序集。

4。自组装结构利用透射电子显微镜（TEM）表征

  1. 放置在200目铜网上覆盖有碳和由聚合物膜支持稳定的肽溶液的10微升下降。
  2. 1分钟后取出用滤纸将多余的液体。
  3. 制备的2％乙酸双氧铀中TDW的溶液。过滤用0.22微米的过滤器单元中的溶液。
  4. 染色的样品（阴性染色），将一滴在网格上10微升乙酸双氧铀溶液。
  5. 30秒后，用滤纸除去多余的液体。应当指出的是，虽然负染提高了图像的对比度，这是没有必要在所有的情况下。
  6. 图像上个样品Ë电网通过透射电镜在120千伏运行。

5。大会的原子力显微镜（AFM）三维表征

  1. 准备样品，使用第3.1段所述的程序的原子力显微镜分析。
  2. 使用原子力显微镜的仪器在AC模式下工作的玻璃样品进行分析。使用硅悬臂梁与3 N / m的弹簧常数和75 kHz的谐振频率。
  3. 开始扫描大面积的网格，以便找到所需的结构。然后集中在一个特定的较小的区域，然后扫描它（扫描尺寸为2.5微米×2.5微米的图像包含在这个手稿）。

6。通过FT-IR的二级结构的表征

  1. 应用肽解决了氟化钙窗口的30微升滴。
  2. 使该溶液干燥在RT。
  3. 水在IR光谱中的吸附是在1650厘米-1。该峰是在肽键的酰胺I带的中心。这也是肽和蛋白质47α-螺旋结构一个典型的峰值。为了克服这个问题，避免水的信号，一个氢 - 氘交换，必须执行。放置在干燥的肽样品一滴重水（D 2 O）。下拉应足够大，以完全覆盖在窗口上的肽存款。
  4. 让样品在真空下干燥。
  5. 重复步骤6.3和6.4倍，以确保最大的氢 - 氘交换。保存样品在真空下，直到它的分析。
  6. 使用氘化硫酸三甘氨酸（DTGS）检测器记录的FT-IR谱。用FT-IR系统包括一个清洗气体发生器中，为了防止湿度在试样的周围的环境。对短肽的样品，最好是扫描样品2,000×以4cm -1的分辨率。的透射率极小值可通过这样来确定与仪器ftware供给。

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Results

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本文描述了一种形成有序结构在纳米和微米尺度由肽的自组装体的方法。为了证明这一点，我们提出简单的过程，表征了两个简单的芳香肽的coassembly（ 图1）。一个肽是NH 2-PHE-PHE-OH（二苯基丙氨酸）的肽，其能够自组装在水性溶液与纳米尺寸7中空管状结构。其他的肽是其Boc保护的类似物，的Boc-Phe-苯丙氨酸-OH。这种肽可形成纤维状结构中的乙醇17,46水溶液和球形的组件。我们假定，这些肽会coassemble到一种结合所提到的两个元件的结构。使用SEM分析，我们发现该混合的肽形成的球形的组件的体系结构，其直径与直径几个hundr的连接由细长结构几微米编纳米（ 图2）。由于高相似的形态，以串珠串，我们称之为这些结构的"分子项链"。这些结构的AFM分析清楚地表明它们的三维结构（ 图3）。另外，各种样品的不同区域的SEM分析表明，该过程发生的以高收率（ 图2b）。

FT-...

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Discussion

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总之，本文说明中，基于肽的组件可以在体外形成的容易性。该过程涉及市售的肽和溶剂，并且它自发地发生的环境条件下，当加入的极性溶剂的试管中。关键的是要使用HFP作为肽的溶剂，由于肽在其他的有机溶剂的溶解度低。此外，由于HFP的高挥发性，有必要准备新鲜原液每个实验。此外，该储备液的体积应高于10微升和溶解的多肽的转移到极性溶剂（水）应迅速进行。

应当指出，该方法用于肽的溶剂化和自组装是一种可能的方法，通常用于这些芳香肽。其他的方法，然而，是可能的。此外，库存SOLUT的浓度在HFP的肽的离子是高在这些实验中，以尽量减少在最终溶液中的HFP的浓度。

这个手稿还提出了一些主要的技术基于肽的结构，例如原子力显微镜，透射电子显微镜，SEM和FT-IR表征。采用显微技术，可以获取有关组件的形态信息。由于这些组件的尺寸范围从几百纳米到几微米，它足以为使用标准电子显微镜对它们的描述。超高分辨率的显微镜将是结构，是在直径小于100纳米，当成像无导电涂层（ 例如，黄金）是需要的有用。在一些情况下，结构的...

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Disclosures

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作者宣称，他们有没有竞争的财务权益。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

这项工作是由居里夫人国际重返社会格兰特和由德国和以色列基金会的支持。我们承认雅尔Razvag先生原子力显微镜分析。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
NH2-Phe-Phe-OHBachemG-2925.0001
Boc-Phe-Phe-OHBachemA-3205.0005
1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇Sigma-Aldrich52512-100ML
乙醇无水（干粉）AR 无菌Bio-Lab Ltd.52555与 TDW 混合，制备 50%
乙酸铀酰Sigma-Aldrich73943用于阴性染色。没有它也可以工作。
玻璃盖玻片Marienfeld 实验室 玻璃器皿110590
TEM 网格电子显微镜科学FCF200-Cu-50Formvar/Carbon 200 Mesh， Cu
定量滤纸Whatman1001055
氧化氘 （D2O）Sigma-Aldrich151882-100G99.9 原子 %
D CaF2窗户PIKE Technologies160-121225 毫米 x 2 毫米窗户。用于 FT-IR 测量
AFM 针尖NanoScience InstrumentsCFMRAspire 探针，CFMR-25 系列
过滤装置MilliporeSLGV033RSMillex-GV，0.22 μm，PVDF，33 mm，伽马射线灭菌
SEMFEIQuanta 200 ESEM
TEMFEITecnai T12 G2 Spirit
AFMJPK 仪器A JPK NanoWizard3
FT-IRThermo Fisher ScientificNicolet 6700 高级金光谱仪
FT-IR 吹扫派克BALSTON FT-IR 吹扫气体发生器 型号 75-52
OMNIC （Nicolet） 软件Thermo Nicolet Corporation用于 FT-IR 光谱分析
涡旋混合器Wisd 实验室设备ViseMix VM
WeightMettler ToledoNewClassic MS
溅射镀膜机PolaronSC7640 溅射镀膜机
溶液

References

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