方法文章

短肽自组装形成有序生物分子结构

DOI：

10.3791/50946

⸱

2013年11月21日

 , 
1Institute of Chemistry and The Center for Nanoscience and Nanotechnology, The Hebrew University of Jerusalem

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文描述了通过自组装这一自发过程形成高度有序的肽基结构的方法。该方法利用 commercially available peptides 和常见的实验设备。该技术可应用于多种不同的肽，并可能促进新型肽基组装体的发现。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在自然界中，生物分子在温和条件下通过自组装形成复杂的功能性结构。理解控制自组装的驱动力并模拟这一过程in vitro，将推动材料科学和纳米技术领域的重大进展。在现有的生物构建单元中，肽类具有多种优势：其结构多样性丰富，可大规模合成，并且易于与生物或化学实体进行修饰1,2。多种设计肽类，如环状肽、两亲性肽和肽缀合物，可在溶液中自组装形成有序结构。同芳香性二肽是一类短链自组装肽，其本身包含形成纳米管、球体和原纤维等有序结构所需的全部分子信息3-8。目前市场上已有多种此类肽可供使用。

本文介绍了一种通过同芳香族肽自组装形成有序结构的实验方法。该方案仅需商用试剂和基础实验室设备。此外，文中还描述了可用于表征肽基组装体的一些方法，包括电子显微镜、原子力显微镜和傅里叶变换红外光谱（FT-IR）。同时，论文展示了肽的混合（共组装）及一种有序结构的形成 "串珠状结构"-样结构通过此过程形成。9 本文所述方案可适用于其他类别的肽或生物结构单元，有望推动新型肽基结构的发现，并实现对其组装过程的更精确控制。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

自然界通过生物分子自组装过程形成有序且具有功能的结构。理解调控这一自发过程的作用力，可能使我们具备模拟自组装的能力 体外 从而推动了材料科学领域的重大进展10,11肽类分子作为一种生物分子构建单元极具应用前景，因其具有丰富的结构多样性、易于化学合成，并可方便地与生物或化学功能基团进行功能化修饰。肽自组装领域的研究由Ghadiri及其同事率先开创，他们证实了由交替排列的D型与L型氨基酸组成的环状肽能够实现肽纳米管的自组装。12其他成功的肽组装设计方法包括线性双亲性肽5, 两亲分子（AP）6非共轭自互补离子肽13，表面活性剂样肽4,14和嵌段共聚多肽15.

一种较新的方法涉及短芳香族肽的自组装，这类肽被称为同芳香族二肽。这些肽仅由两个具有芳香性质的氨基酸组成（例如 Phe-Phe，叔丁基二碳酸酯（Boc）-Phe-Phe7,8,16-21这些同芳香族肽形成的结构包括管状结构、球形结构、片层状组装体和纤维。6,8,15,21-32在某些情况下，这些纤维会形成原纤维网状结构，从而产生水凝胶33-37这些组装结构已被应用于生物传感、药物递送、分子电子学等领域。 等等.38-45

本文描述了启动同芳香族肽自发自组装所需的实验步骤。此外，还介绍了肽共组装的过程。该过程涉及多种肽单体的自组装。

我们的实验包括两种市售肽的共组装：二苯丙氨酸肽（NH2-Phe-Phe-COOH）及其Boc保护的类似物（Boc-Phe-Phe-OH）。每种肽均可自组装形成超分子结构：二苯丙氨酸肽形成管状组装体，而Boc-Phe-Phe-OH肽则根据溶剂的不同自组装成球形或纤维状结构7,17,46。我们将这两种肽按特定比例混合，并通过电子显微镜、力显微镜和傅里叶变换红外光谱（FT-IR）对所得组装体进行表征。结果表明，形成了由直径数微米（1–4 μm）的球形单元与直径数百纳米（~300–800 nm）的细长结构连接而成的肽基结构。该组装体在形态上类似于串珠状结构 ，球形单元似乎穿插在细长的组装结构上。因此，我们将这类组装体命名为"生物分子项链"。"生物分子项链"有望作为新型生物材料，用于药物递送或作为电子器件的支架。此外，引导肽自组装的这一方法也可应用于其他类别的肽和生物分子，有助于深入理解自组装过程中涉及的作用力以及新型有序结构的形成机制。

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方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 同芳香性二肽的自组装

  1. 称取所需量的冻干肽（例如 NH2-Phe-Phe-OH、Boc-Phe-Phe-COOH）溶于1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇（HFP）中，配制适当浓度的储备溶液例如 100 mg/ml，用于NH2-Phe-Phe-OH 和 Boc-Phe-Phe-COOH7,17,46.
  2. 混合溶液 使用涡旋振荡器混匀，并置于实验台面上直至肽完全溶解 是 完全溶解，得到溶液 似乎清晰（几分钟）。
  3. 用适当的溶剂将肽段储备液稀释至合适的浓度（例如 2 mg/ml 的 NH2- 用于形成纳米管的Phe-Phe-OH三蒸水（TDW）溶液；将2 μl肽储备液加入98 μl三蒸水中，以及用于形成球形结构的5 mg/ml Boc-Phe-Phe-COOH乙醇溶液。
  4. 在室温下保存溶液24小时。
  5. 为避免任何预聚集现象，每次实验均需 freshly 配制储备液。

2. 两种同芳香性二肽的共组装

  1. 通过将 TDW 与无水乙醇等体积混合，配制 50% 乙醇溶液。使用涡旋振荡器混合两种溶液。
  2. 称取 2 mg NH2-Phe-Phe-OH 肽和 1 mg Boc-Phe-Phe-OH 肽。将每种肽分别溶解于 HFP 中，配制成浓度为 100 mg/ml 的储备液。
  3. 使用涡旋振荡器混合肽的储备液，并置于实验台上，直至肽完全溶解且溶液呈现澄清状态。
  4. 将肽的储备液按所需比例混合。在本实验中，将 10 μl NH2-Phe-Phe-OH 肽溶液与 6 μl Boc-Phe-Phe-OH 肽溶液混合（最终比例为 5:3）。由于 HFP 溶剂具有高挥发性，建议配制较大量的混合储备液（至少 10 μl）。
  5. 使用涡旋振荡器混合均匀。
  6. 用 50% 乙醇将混合肽储备液稀释至所需终浓度。在本实验中，为获得 NH2-Phe-Phe-OH 终浓度 5 mg/ml 和 Boc-Phe-Phe-OH 终浓度 3 mg/ml，需将 8 μl 混合肽储备液加入 92 μl 50% 乙醇溶液中。使用移液器轻轻混匀溶液。
  7. 将溶液在室温下静置 24 小时。
  8. 需要注意的是，由于溶剂具有高度挥发性，实验对肽浓度的微小变化较为敏感。因此，每次实验均应 freshly 配制新的储备液。

3. 使用扫描电子显微镜（SEM）表征自组装结构

  1. 孵育24小时后，取10 μl肽溶液滴加于玻璃盖玻片上，在室温下干燥。
  2. 使用溅射镀膜仪在玻璃样品上镀一层薄金（几纳米），镀膜时间为90 秒。
  3. 采用10–20 kV工作电压的扫描电子显微镜观察组装结构。

4. 使用透射电子显微镜（TEM）表征自组装结构

  1. 将10 μl肽溶液滴加到覆盖有碳膜并由聚合物薄膜支撑稳定的200目铜网上。
  2. 1分钟后，用滤纸吸去多余液体。
  3. 在TDW中配制2%醋酸铀酰溶液，并使用0.22 μm滤器过滤该溶液。
  4. 为对样品进行染色（负染），在铜网上滴加10 μl醋酸铀酰溶液。
  5. 30秒后，用滤纸吸去多余液体。需要注意的是，尽管负染可提高图像对比度，但在某些情况下并非必需。
  6. 使用120 kV工作电压的透射电子显微镜（TEM）对铜网上的样品进行成像。

5. 原子力显微镜（AFM）对组装体的三维表征

  1. 按照第 3.1 段所述步骤制备用于原子力显微镜（AFM）分析的样品。
  2. 使用工作在交流（AC）模式下的原子力显微镜仪器对玻璃上的样品进行分析。采用弹簧常数为 3 N/m、共振频率为 75 kHz 的硅悬臂梁探针。
  3. 首先扫描网格的较大区域，以定位目标结构；然后聚焦于特定的较小区域进行扫描（本稿件所含图像的扫描尺寸为 2.5 μm x 2.5 μm）。

6. 通过傅里叶变换红外光谱（FT-IR）表征二级结构

  1. 将30 μl肽溶液滴加到CaF2窗片上。
  2. 在室温下让溶液自然干燥。
  3. 水在红外光谱中的吸收峰位于1,650 cm-1，该峰正好处于肽键酰胺I带的中心位置，也是肽和蛋白质α-螺旋结构的典型特征峰47。为解决此问题并避免水信号的干扰，必须进行氢-氘交换。将一滴重水（D2O）加至已干燥的肽样品上，液滴应足够大，以完全覆盖窗片上的肽沉积物。
  4. 将样品置于真空条件下干燥。
  5. 重复步骤6.3和6.4两次，以确保最大程度的氢-氘交换。交换完成后，将样品保存在真空环境中，直至进行分析。
  6. 使用氘化硫酸三甘氨酸酯（DTGS）检测器记录FT-IR光谱。FT-IR系统应配备吹扫气体发生器，以防止样品周围环境湿气干扰。对于短肽样品，建议以4 cm-1分辨率扫描2,000次。透射率的最小值可由仪器配套软件确定。

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结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文描述了一种通过肽的自组装在纳米和微米尺度上形成有序结构的方法。为了展示这一简单过程，我们呈现并表征了两种简单的芳香族肽的共组装过程（图1）。其中一种肽是NH2-Phe-Phe-OH（二苯丙氨酸），其可在水溶液中自组装形成具有纳米级尺寸的中空管状结构7。另一种肽是其Boc保护的类似物Boc-Phe-Phe-OH，该肽可在水溶液中形成纤维状结构，在乙醇中则形成球形组装体17,46。我们推测，这两种肽将共组装成一种结合上述两种结构特征的复合结构。通过扫描电镜（SEM）分析，我们发现混合肽形成了由直径数百纳米的细长结构连接的球形组装体，球体直径达数微米（图2）。由于其形态与串珠极为相似，我们将此类结构命名为“分子项链”。原子力显微镜（AFM）分析清晰地展示了这些结构的三维排列方式（图3）。此外，对不同样品多个区域的SEM分析表明，该组装过程具有很高的产率（图2b）。

FT-IR 分析提供...

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

总之，本文展示了基于肽的组装在体外形成的简便性。in vitro条件下，该过程使用市售的肽和溶剂，在向试管中加入极性溶剂后，组装可自发进行。由于肽在其他有机溶剂中溶解度较低，因此必须使用HFP作为肽的溶剂。此外，由于HFP具有高挥发性，每次实验均需新鲜配制储备液。同时，储备液的体积应大于10 μl，并且需迅速将溶解的肽转移至极性溶剂（水）中。

需要注意的是，这种肽的溶解和自组装方法只是其中一种可能的途径，通常用于此类芳香族肽。然而，也存在其他方法。此外，在这些实验中，肽在HFP中的储备溶液浓度较高，以尽量减少HFP在最终溶液中的浓度。

本文还介绍了一些用于表征基于肽的结构的主要技术，例如原子力显微镜（AFM）、透射电子显微镜（TEM）、扫描电子显微镜（SEM）和傅里叶变换红外光谱（FT-IR）。利用显微技术可以获得组装体形貌的相关信息。由于这些组装体的尺寸范围从数百纳米到数微米，因此使用常规电子显微镜即可满足其表征需求。对于直径小于100 nm的结构，或在无需导电涂层条件下成像时，超高清分辨率显微镜将更为适用...

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本工作得到了玛丽·居里国际回归基金和德以基金会的支持。我们感谢Yair Razvag先生进行原子力显微镜分析。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
NH2-Phe-Phe-OH巴赫姆G-2925.0001
Boc-Phe-Phe-OH巴赫姆A-3205.0005
1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇西格玛-奥德里奇52512-100ML
无水乙醇（脱水）分析纯 无菌生物实验室有限公司52555与超纯水混合配制50%溶液
醋酸铀酰西格玛-奥德里奇73943用于负染色。可不使用该试剂进行操作。
玻璃盖玻片玛丽恩费尔德实验室玻璃器皿110590
透射电镜载网电子显微科学公司FCF200-Cu-50Formvar/碳支持膜，200目，铜网
定量滤纸沃特曼1001055
氧化氘（D2O）西格玛-奥德里奇151882-100G氘原子丰度99.9%
CaF2窗口片派克科技160-121225 mm × 2 mm 窗口片，用于傅里叶变换红外光谱测量
原子力显微镜探针尖端纳米科学仪器公司CFMRAspire探针，CFMR-25系列
滤器单元密理博SLGV033RSMillex-GV，0.22 μm，PVDF材质，33 mm，伽马射线灭菌
扫描电镜FEIQuanta 200 ESEM
透射电镜FEITecnai T12 G2 Spirit
原子力显微镜JPK仪器公司JPK NanoWizard3
傅里叶变换红外光谱仪赛默飞世尔科技Nicolet 6700 高级金标光谱仪
傅里叶变换红外光谱吹扫装置派克BALSTON FT-IR Purge Gas Generator 型号 75-52
OMNIC（Nicolet）软件赛默飞尼科莱特公司用于傅里叶变换红外光谱数据分析
涡旋混合器维实德实验室设备ViseMix VM
电子天平梅特勒-托利多NewClassic MS
溅射镀膜仪波拉隆SC7640 溅射镀膜仪

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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