本方案详细介绍了通过一系列酶消化步骤从人胸腺中分离抗原提呈细胞的方法，随后对单细胞悬液进行密度梯度离心，最后通过磁珠分选和/或荧光激活细胞分选（FACS）分离目标细胞群体。
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本文内容
摘要
摘要
本方案提供了一种从人胸腺中分离树突状细胞（DC）和胸腺上皮细胞（TEC）的方法。DC和TEC是正常胸腺中存在的主要抗原提呈细胞（APC）类型，它们在胸腺选择过程中发挥着明确且不同的作用。这些细胞定位于胸腺内不同的微环境，且每种APC类型仅占细胞总数的极小比例。为了进一步理解这些细胞类型的生物学特性，对它们进行表征非常必要；但由于其频率较低，分离任一类细胞均需要高效且可重复的操作流程。本方案详细描述了一种获取适用于多种细胞特性表征的细胞的方法。胸腺组织经机械破碎后，进行多步酶消化处理，所得细胞悬液通过Percoll密度梯度离心进行富集。对于髓系树突状细胞（CD11c+）的分离，采用磁性细胞分选法从低密度组分（LDF）中免疫富集目标细胞。TEC群体（mTEC、cTEC）的富集则是通过从Percoll低密度细胞组分中去除造血系（CD45hi）细胞实现，随后利用特异性细胞标志物通过荧光激活细胞分选（FACS）完成进一步分离。所获得的细胞可用于多种下游应用。
引言
胸腺是T细胞发育的器官。随着年龄增长，胸腺的相对和绝对体积逐渐减小，并逐步被脂肪组织取代，尽管在老年人中仍可检测到胸腺活性。其在免疫应答中的重要性于20世纪60年代初得到证实1。
T细胞受体与不同类型的胸腺抗原提呈细胞（APC）表面的肽-MHC复合物相互作用，从而塑造T细胞受库，这些相互作用为发育中的T细胞提供存活或死亡信号，最终形成具有功能且在很大程度上对自身耐受的T细胞受库2。
人类胸腺中约98%的细胞是正在发育的T细胞，称为胸腺细胞。其余2%由多种不同类型的细胞组成，包括多种胸腺上皮细胞（皮质型、髓质型、被膜下型）、髓系和浆细胞样树突状细胞（mDC、pDC）、巨噬细胞、B细胞、成熟的再循环T细胞、粒细胞、成纤维细胞、内皮细胞，以及极少数表达表型类似于其他组织（如肌肉、神经元和呼吸道上皮）细胞的上皮细胞（图1）。其中，胸腺上皮细胞（TEC）和树突状细胞（DC）是正常胸腺中主要的抗原呈递细胞（APC）类型。近年来，对这些APC类型进行分离培养和分子特征分析的研究兴趣日益增加。由于这些细胞类型的频率较低，对其进行深入分析所需的分离过程必须高效、可重复且成本较低。本文所述方法是在先前已发表研究3,4的基础上进行的改进。
与其它组织一样，胸腺组织的细胞提取可通过酶解方法破坏细胞间及细胞与基质间的相互作用网络，从而获得单细胞悬液。在成功分离这些稀有细胞群体的过程中，某些参数至关重要，需进行优化，包括良好的解离效率、细胞得率、细胞活力以及细胞表面标志物的保留情况。
在本实验方案中，通过机械破碎和酶消化将组织制成单细胞悬液，以分离树突状细胞（DC）和胸腺上皮细胞（TEC）亚群。我们使用来自Clostridium histolyticum的胶原酶A，该酶具有多种酶活性的平衡比例，可降解维持组织结构的天然胶原。在酶解液中加入DNase I，以减少因死细胞（胸腺细胞非常敏感）释放的游离DNA导致的细胞聚集。我们还提供了一种替代传统酶消化的方法，即结合使用组织解离仪辅助进行机械和酶法处理组织。随后，将单细胞悬液进行单次Percoll密度梯度离心，以富集低密度细胞组分（LDF）。从该细胞组分中，可通过标记DC表面标志物（即 CD11c+）并结合磁性分离或荧光激活细胞分选（FACS）来分离DC。与构成胸腺中绝大多数细胞的淋巴细胞不同，TEC不高水平表达CD45，但表达上皮细胞黏附分子EpCAM。通过CDR-2（cortical dendritic reticulocyte-2）抗体识别的一种尚未明确的抗原的表达情况，以及相对较低的EpCAM表达水平，可将皮质型TEC（cTEC）与髓质型TEC区分开来4,5。EpCAM与CDR2的差异性共表达使得可通过高速细胞分选技术高效分离这些TEC亚群6。
本方案经过优化，适用于人胸腺组织。实验所需时间取决于组织量、操作者的熟练程度以及细胞分选仪的分选速度（如果使用FACS分选）。通常情况下，树突状细胞（DC）的分离可在5-6小时内完成，胸腺上皮细胞（TEC）的分离则需8-10小时。从胸腺组织中分离DC和TEC亚群对时间较为敏感，分离过程越快，细胞状态越好。最终获得的细胞可用于后续多种研究，如mRNA和蛋白质表达的比较分析、PCR实验、蛋白质提取、分子谱型分析（即转录组学、微小RNA分析）以及细胞培养6。
伦理声明
为了能够使用人胸腺组织进行研究，研究人员需要获得当地伦理委员会或相关主管部门的批准，以及供体（通常为其父母，因为组织通常来自未成年儿童）的书面知情同意。此外，所有人体组织均应被视为可能具有传染性，并应采取适当的防护措施，例如佩戴手套操作。 等等.
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方案
1. 工具、酶溶液和缓冲液的准备
在开始本方案之前，请完成以下准备工作。
- 工具
将以下工具清洗、干燥并进行高压灭菌，并在无菌包装中保存至使用。- 用于切割胸腺组织的小型锋利剪刀（可选用弯头或直头），以及带锯齿尖端的小型弯头镊子，用于处理组织。
- 50 ml 橡树岭离心管（PC），用于 Percoll 密度梯度离心步骤。
- 酶溶液
按以下步骤配制胶原酶/脱氧核糖核酸酶 I（Collagenase/DNase I）酶混合液（2 mg 胶原酶/ml 和 0.1 mg DNase I/ml）：- 将 500 mg 冻干胶原酶 A（Roche）溶解于 250 ml RPMI 1640 培养基（不含 FCS）中，得到浓度为 2 mg/ml 的胶原酶溶液。胶原酶较难溶解，建议在室温下置于滚轴摇床上放置一段时间以助溶解。
- 将 100 mg DNase I（Roche）溶解于 10 ml 无菌蒸馏水中。分装成 2.5 ml 等份，可于 -20 °C 保存。取 2.5 ml 浓度为 10 mg/ml 的 DNase I 溶液加入 2 mg/ml 的胶原酶 A 溶液中。
- 使用 Stericup 滤器装置（0.22 μm）对胶原酶/DNase I 混合液进行无菌过滤。分装为 10–20 ml 等份，于 -20 °C 保存备用。
- 缓冲液与溶液
- 1.5 M NaCl 储存液：将 NaCl 溶解于无菌蒸馏水中，终浓度为 1.5 M。经 0.22 μm 滤器过滤后，室温保存。
- 10x MACS 缓冲液：含 5% BSA 和 20 mM EDTA 的 1x PBS（不含 Ca2+/Mg2+）。使用 0.22 μm 滤器无菌过滤后，4 °C 保存。使用前用冰冷的无菌 1x PBS 将 10x 储存液稀释至 1x。
- FACS 缓冲液：含 1% BSA 和 0.02% NaN3 的 1x PBS（不含 Ca2+/Mg2+）。
- 细胞分选用 FACS 缓冲液：含 2% BSA 的 1x PBS（不含 Ca2+/Mg2+）。使用 0.22 μm 注射器滤器灭菌，4 °C 保存。
2. 组织的制备
组织处理应使用无菌试剂，并在层流柜中进行操作。在开始实验前，准备好以下试剂和设备：
-
- 将以下试剂 warmed 至室温：完全 RPMI 1640 培养基（RPMI 1640，10% 胎牛血清，1% 青霉素/链霉素）、普通 RPMI 1640 培养基、无 Ca2+/Mg2+ 的 PBS 缓冲液以及 2× 胶原酶/脱氧核糖核酸酶酶解溶液。
- 将带有旋转装置的恒温孵育器预热至 37 °C，并将固定角转子离心机冷却至 4 °C。
- 准备一个装有冰的盒子。
注意：此步骤所需时间取决于组织的状态和大小。对于状态良好、中等大小的组织（宽度约 5 cm），大约需要 20–30 分钟。
- 将组织置于含有无菌 PBS 的培养皿中，冲洗掉任何残留的血液。
- 加入新鲜 PBS 以防止组织干燥，并使用镊子和剪刀清除血块、结缔组织、脂肪组织以及任何看起来不健康的组织部分。
- 注意去除坏死组织，以免增加碎片量。
- 清洗后，称量组织以作参考。
- 将组织切成约 1 cm3 的小块。加入足量 PBS 以浸没组织。
注意： 为确保实验结果的可重复性，应将组织切成大小均匀的片段。
- 使用无菌注射器（10–20 ml）的尾部对胸腺组织块施加压力（切勿过于剧烈或持续过久）。此步骤将去除大部分胸腺细胞，从而减少后续消化的组织体积。该操作需在冰上进行，并迅速完成。
- 随着胸腺细胞的释放，溶液将明显变浑浊。轻轻搅动培养皿，然后借助5 ml移液器或玻璃吸管小心吸除含有胸腺细胞的上清液，注意避免误吸组织块。
提示：可使用无菌细胞刮棒将所有组织块集中至培养皿的一侧，然后将培养皿倾斜（约45°角），吸除上清液。加入新鲜PBS，重复此操作，直至上清液相对透明。最后一次洗涤使用RPMI基础培养基（不含血清）。
- 使用锋利的剪刀将组织块切碎（尽可能细碎，碎片大小应在 2-4 mm 左右）。碎片应足够小，能够通过 5 ml 移液管。
3. 胸腺组织单细胞悬液的制备
此处介绍了该步骤的两种替代方法。第一种方法描述了典型的酶解组织消化（第3.1节），而第二种方法则涉及借助组织解离仪进行的机械和酶解组织处理（第3.2节）。
本方案已针对重量为 5 g 的组织样本进行了优化。对于更大或更小的组织样本，应相应调整酶的使用体积。
3.1 典型的酶解组织消化以获得单细胞悬液
- 将研磨后的组织放入50 ml离心管中，每5 g组织加入10 ml胶原酶/DNase溶液。加入RPMI基础培养基，使总体积达到20 ml。
注意：在 50 ml 离心管中消化组织量不超过 10 g。根据组织量相应调整酶的体积。
- 将组织悬液置于恒温孵育箱中，在 37 °C 下缓慢旋转孵育 40 分钟。
注意：孵育步骤可在带有旋转装置的恒温孵育器中进行，也可在37 °C的细菌培养箱中使用摇床进行。
- 随着细胞被释放到酶溶液中，溶液将变得浑浊。消化结束后，将离心管以 110 × g 离心 2 分钟，使组织碎片沉淀。
- 收集本次消化的上清液。将细胞悬液以 400 × g 离心 10 分钟形成沉淀。吸除上清液，并根据细胞沉淀的大小，将细胞重悬于 10–50 ml 的完全 RPMI 培养基中。
- 将细胞悬液置于 37 °C 培养箱中，瓶盖保持松动。
- 若需要获得更多的细胞数量，可用剩余的组织碎片重复消化步骤，并合并第一次和第二次消化所得细胞。此外，若需分离胸腺上皮细胞（TEC），应进行两轮消化。
- 取部分细胞悬液与台盼蓝按 1:10 至 1:100 比例稀释，使用血细胞计数板计数活细胞。
- 将细胞置于 37 °C 培养箱中保存，直至进行后续 Percoll 密度梯度离心步骤（第 4 节）。后续树突状细胞亚群的分离（第 5 节）将从此细胞悬液中进行。
注意：胸腺组织的组成可能因年龄等因素而存在差异，这会影响消化效率以及单细胞悬液的制备效果。
- 为后续分离胸腺上皮细胞（TEC），需要进行第三轮酶消化。将组织残余物重悬于10 ml新鲜的胶原酶/DNase溶液中，加入10 ml RPMI基础培养基，并在溶液中加入胰蛋白酶/EDTA（按2.5%母液1:50稀释）。
- 在37 °C下轻柔旋转孵育40分钟。在孵育的最后10至15分钟内，加入FCS（1:5）以中和胰蛋白酶的活性。
- 在室温下以110 × g离心2分钟，使组织碎片沉淀。
注意： 经过上述三轮消化后，组织可能尚未完全消化。组织的年龄和整体状态是影响胸腺组织解离效率的两个参数。
- 收集细胞上清液，并弃去沉淀的组织碎片。
- 将细胞上清液在400 × g离心10分钟。吸除上清液，将细胞沉淀重悬于RPMI完全培养基中。
提示：细胞沉淀较为松散，弃去或吸除上清液时需小心操作。
- 使用血细胞计数板对活细胞进行计数。将细胞置于37 °C培养箱中孵育，直至进行Percoll分离（第4节）。后续将从这些细胞中通过去除CD45hi细胞来对胸腺上皮细胞（TEC）进行预富集（第6节）。
3.2 利用组织解离仪辅助进行机械法与酶解法组织处理
使用组织解离仪方法，可将组织消化步骤所需时间缩短至上述方法（第3.1节）所需时间的一半。以下方案是对用于解离小鼠胸腺组织以分离胸腺上皮细胞（TEC7,8）的方法进行的改良版本。
- 将5 g剪碎的组织块（步骤2.5）转移至含有10 ml胶原酶/脱氧核糖核酸酶溶液的C管中。
- 将C管安装到组织解离仪上，运行程序m_spleen_02（10秒）。重复此程序4-5次（共40-50秒）。
- 在37 °C下轻轻旋转孵育20分钟。
- 在室温下以110 × g离心2分钟。
- 收集上清液，并按步骤3.1.4操作。加入10 ml新鲜的胶原酶/脱氧核糖核酸酶溶液。
- 将C管安装到组织解离仪上，运行程序m_spleen_01（56秒）。
- 在37 °C下轻轻旋转孵育20分钟。
- 在室温下以110 × g离心2分钟。
- 收集细胞上清液，并以400 × g离心10分钟沉淀细胞悬液。后续操作同步骤3.1.4。
- 如步骤3.1.9所述，为后续胸腺上皮细胞（TEC）的分离，需进行第三轮消化。为此，将组织残余物重悬于10 ml新鲜胶原酶/脱氧核糖核酸酶溶液中，并加入胰蛋白酶/EDTA（将2.5%储备液按1:50稀释）。
- 在37 °C下继续轻轻旋转孵育20分钟，然后加入FCS（1:5），再孵育10分钟。
注意： 采用此方法，在最后一次消化步骤后，组织通常已完全解离，未见未消化的组织碎片。
- 按照步骤 3.1.11-3.1.14 进行操作。
4. 使用Percoll密度分离法富集细胞的LDF
组织经酶消化后，获得总的胸腺单细胞悬液，随后通过一步Percoll密度梯度离心法富集LDF细胞。该LDF细胞组分中富含抗原提呈细胞（APC），在此细胞组分中可检测到树突状细胞（DC）和胸腺上皮细胞（TEC）。
- 使用从第1个获得的单细胞悬液st 和 2nd 用于mDC分离的消化液（混合细胞，见步骤3.1.8）或3rd 消化（用于TEC分离）（3.1.14）。将每步消化所得的单细胞悬液于400 × g离心10分钟。
- 在此洗涤步骤中，配制终密度为1.07 g/ml的Percoll溶液（参见下表中的示例）。
制备 Percoll 溶液 最终密度为1.07 g/ml (ρ = 1.07) 管编号 1 2 3 4 未稀释的Percoll（ρ = 1.130）（ml） 2.96 5.92 8.88 11.84 1.5 M NaCl（毫升） 0.6 1.20 1.8 2.4 蒸馏水 H2O (ml) 2.44 4.88 7.32 9.76 最终工作稀释液的体积 6 ml 12 ml 18 ml 24 ml - Percoll 管的数量取决于步骤 3.1.8 和/或 3.1.14 中确定的细胞数量。合并无菌溶液并充分混匀。为实现最佳分离效果，需使用 0.6–1 × 109 每管Percoll可加载的细胞数量。将无菌溶液混合并充分混匀。
提示：Percoll 对光敏感，且应保持低温。首先配制含有 NaCl 和 H2O（室温）的混合液，最后在用 Percoll 溶液重悬细胞前加入未稀释的 Percoll。
注意：不同供应商和批次的Percoll密度可能存在差异！如果未稀释的Percoll溶液密度不等于1.130 g/ml，请参照生产商提供的说明，计算获得终密度为1.07 g/ml所需的Percoll和H2O的确切用量。
- 将最多 1 × 109 个细胞重悬于 6 ml 已配制的 Percoll 溶液（ρ = 1.07）中，充分混匀以获得均一的悬液，并转移至 50 ml 的 Oak Ridge 聚碳酸酯螺口离心管中。
- 用移液器将 30 ml RPMI 完全培养基小心地逐管叠加在 Percoll 溶液/细胞悬液上方。缓慢加入培养基，使其停留在悬液上层，并注意不要扰动界面层。
- 称量各离心管，确保重量相等，以便在离心过程中保持平衡。若重量不等，需在较轻的管中谨慎添加更多培养基（无菌条件下操作）。
- 小心将离心管转移至预冷的带有固定角转子的离心机中，在 4 °C 条件下以 3,500 × g 离心 35 分钟，关闭刹车。确保离心机温度不超过 4 °C。
- 从离心机中取出离心管，使用无菌巴斯德吸管小心收集位于 Percoll 与培养基之间的界面层（即低密度组分，LDF）中富集的抗原呈递细胞（APC）。将细胞转移至含有冷 RPMI 完全培养基的 50 ml 离心管中，并加满培养基以稀释残留的 Percoll。
- 将细胞悬液在 4 °C 条件下以 300 × g 离心 10 分钟。弃去上清液，并重复洗涤一次。
- 将细胞沉淀重悬于培养基中，计数细胞数量（使用台盼蓝染色和血细胞计数板）。根据我们的经验，低密度组分（LDF）细胞约占酶消化后所得单细胞悬液总量的 2–20%。典型的低密度富集细胞产量（来自幼年胸腺，年龄范围为出生后 1 天至 2 年）约为每 1 × 109 个起始细胞获得 1 × 108 个细胞，相当于总单细胞悬液细胞数的 10%。
注意：在此阶段，您可能会观察到细胞在悬浮液中发生聚集（尤其是来自年龄较大儿童的样本）。细胞团块是细胞死亡的迹象，由死亡细胞释放的DNA导致细胞相互黏连所致。若出现此情况，向样本中加入DNase I（50 μg/ml），并在室温下孵育最多20分钟（每5分钟轻轻颠倒混匀一次），以降解游离的DNA分子。
5. 胸腺mDC的分离
在通过Percoll分离进行抗原呈递细胞富集后，可在第一轮和第二轮酶消化之后，从LDF中高效分离出成熟树突状细胞（mDC）。以下方案是用于分离mDC（CD11c+）的磁珠分选细胞分离法的改良版本。
- 将来自混合第一次和第二次酶消化所得单细胞悬液中富集的APC细胞在4 °C条件下以300 × g离心10分钟，然后按每107个细胞加入100 μl MACS缓冲液重悬细胞沉淀。
- 按每107个细胞加入5 μl CD11c-PE抗体。
注意：建议进行滴定实验以获得最佳结果。
- 充分混匀，并在 4 °C 避光孵育 15 分钟。
- 每 107 个细胞加入 1–2 ml MACS 缓冲液洗涤细胞，然后在 300 × g 离心 10 分钟。
- 完全吸除上清液，并将最多 107 个细胞重悬于 80 μl MACS 缓冲液中。
- 每 107 个细胞加入 20 μl 抗 PE 微珠。
- 充分混匀（切勿涡旋），并在 4 °C 避光孵育 15 分钟。
- 重复步骤 5.4 的操作。
- 将最多 108 个细胞重悬于 500 μl 缓冲液中。
- 如有必要，使用 40 μm 细胞筛过滤细胞悬液，以去除可能阻塞柱子流速的碎片和细胞聚集体。
- 使用 LS 柱，因为胸腺细胞悬液在 LS 柱中的流速更佳。按照制造商说明书准备 LS 柱。将细胞悬液缓慢移入柱中，避免产生气泡。每 1 × 108 个细胞使用一根柱子。
- 按照制造商说明书洗涤柱子。将柱子从磁铁上取下，放入一个无菌的 12 ml 圆底聚丙烯管中。向柱中加入 3 ml MACS 缓冲液，并通过插入并用力推动推杆来收集磁标记细胞。
- 收集洗脱组分，即 CD11c+ 髓系树突状细胞（mDC），并在 400 × g 离心 6 分钟。
- 计数细胞数量，并通过流式细胞术分析确认所选细胞群体的纯度。建议使用的标记物包括 CD45、CD11c 和 HLA-DR。
注意： 也可使用流式细胞分选仪分离CD11c+ mDC。
6. 用于胸腺上皮细胞分选的 CD45lo/neg 细胞富集
为了分离胸腺上皮细胞（TEC），可使用CD45微珠耗尽CD45hi细胞，从而富集目标细胞，加快后续通过细胞分选进行的分离过程。
使用从3获得的单细胞悬液rd 消化步骤（3.1.14）后，通过Percoll离心进行分离。
- 在 4 °C 条件下，以 300 × g 离心 10 分钟，沉淀细胞，然后每 107 个细胞用 80 μl MACS 缓冲液重悬细胞沉淀。
- 每 107 个细胞使用推荐量三分之一的 CD45 微珠（6.7 μl）。
注意：通过使用较少数量的微珠，可对 CD45lo 和 CD45neg 细胞同时进行预富集。建议进行滴定以获得最佳结果。
- 轻轻弹击离心管充分混匀（切勿涡旋震荡），于 4 °C 孵育 15 分钟。
- 加入 10 ml MACS 缓冲液洗涤未结合的微珠，于 4 °C 以 300 × g 离心 10 分钟。彻底吸除上清液。
- 将最多 108 个细胞重悬于 500 μl 缓冲液中。
- 如有必要，使用 70 μm 细胞筛过滤细胞悬液，以去除可能阻塞层析柱流过的碎片和细胞聚集体。
- 选用 LS 柱，因为胸腺细胞悬液在 LS 柱中流过效果更佳。按照生产商说明书准备 LS 柱。缓慢将细胞悬液移入柱中，避免产生气泡。每 108 个细胞使用一根柱子。
- 收集未标记细胞（流穿液及洗涤液），其中含有 CD45lo/neg 细胞组分，并按照生产商说明书洗涤柱子。
- 于 4 °C 以 300 × g 离心 10 分钟，将细胞沉淀重悬于无菌 FACS 缓冲液中，用于细胞计数并进行后续染色以进行细胞分选。
7. 荧光激活细胞分选染色
- 进行细胞染色前执行 FcR 封闭，以减少非特异性抗体结合。将细胞悬液与混合人免疫球蛋白溶液在室温下孵育 15 分钟。这些试剂可从商业途径获得（即 Gammunex 10% 溶液
- 加入预冷的无菌FACS缓冲液洗涤细胞，在4 °C下以400 × g离心6分钟。
- 弃去上清液，将细胞重悬于冰冷的无菌FACS缓冲液中。按照以下示例制备5个样品：
样本 样本类型 抗体 细胞数量 总体积 1. 未染色 对照 1 × 106 50 μl 2.scc*-太平洋蓝 对照 CD45-Pacific Blue 1 × 106 50 μl 3. scc-APC 对照 CD3-APC 1 × 106 50 μl 4.scc-Alexa 488 对照 CD8-Alexa 488 1 × 106 50 μl 5. 细胞分选 分析物 CD45-Pacific Blue
EpCAM-APC
CDR2-Alexa 48810 x 106 - 50 × 106 500 μl
10 x 106 细胞/100 μl
单色对照；scc
- 将细胞与抗体在冰上避光孵育30分钟。
- 以400 × g在4 °C下离心6分钟，用FACs缓冲液洗涤细胞两次。
- 将待分选样品的细胞浓度调整至 1 x 10⁷7 细胞/毫升（或按照细胞分选机构推荐的浓度）用无菌FACS缓冲液进行细胞分选（即 无 NaN3).
- 将细胞样品通过70 μm细胞滤网，以去除可能在分选过程中堵塞流式细胞仪的细胞团块。
- 将对照样品重悬于 200–400 μl 缓冲液中。将离心管置于冰上并避光保存。
- 在收集管中加入培养基。
注意事项：
- 对抗体进行滴定，以获得最佳染色效果。
- 在一次分选样本中，最多可在500 μl的总反应体积中对50 × 106个细胞进行染色。
- 在5 ml Falcon聚苯乙烯圆底试管中对需分选的样本进行染色。单色对照可在96孔板的不同孔中分别染色。
- 由于TEC亚群属于稀有细胞群体，建议为每种荧光染料使用另一种高表达频率的阳性标记，以帮助确定合适的流式细胞术分选参数，并确保在所选荧光染料需要时能够正确进行补偿。可使用如CD45、CD3或CD8等标记物对CD45+组分的细胞进行不同荧光染料的染色，染色后可将未染色的CD45+细胞加入样本中。
8. 通过荧光激活细胞分选法分离胸腺上皮细胞
胸腺上皮细胞亚群可从CD45lo/neg组分中分选获得，其中EpCAMhiCDR2-为mTEC，EpCAMloCDR2+为cTEC。
- 运行未染色细胞样本，调节前向散射和侧向散射，使目标细胞群位于量程范围内。调节每个检测器的电压，使细胞可见，但位于直方图最左侧区域。
- 运行每种单染样本，并对每种荧光颜色进行补偿调节。
- 在完成未染色和单染对照样本的电压及补偿调节后，运行待分选样本，并使用设门工具定义目标细胞群。使用较宽的前向散射和侧向散射门，以确保包含所有基质细胞大小的细胞，同时排除细胞碎片。
- 在CD45-Pacific Blue versus 前向散射的散点图上，对CD45low和CD45neg细胞设门。
- 将此门应用于EpCAM versus CD29散点图，通过设门确定待分选的细胞亚群。
- 确定设门策略后，选择包含目标细胞群的门，开始分选。
- 收集分选后的细胞，离心细胞悬液，并根据后续实验需求，将细胞重悬于适当的培养基或缓冲液中。
注意： 分选过程中，为防止细胞粘附收集管管壁，可预先用含50% FCS的PBS溶液充满收集管，在室温下孵育30分钟进行包被处理。在加入收集培养基前，弃去包被液。
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结果
本方案中使用的起始材料为接受矫正性心血管手术的儿童所切除的胸腺组织（德国图宾根大学医院胸心血管外科提供），在获得知情同意并遵循机构指导原则的前提下获取。这种废弃组织的大小差异较大，可从2-30克甚至更大。所获得的成熟树突状细胞（mDC）以及胸腺上皮细胞亚群（cTEC和mTEC）的数量取决于用于分离的胸腺组织样本的大小及其年龄。
图2 显示从一名六岁儿童获取的一块较大的组织（约9 cm）。本方案中一个重要的初步准备步骤是清除组织中不需要的部分（由白色箭头指示）。
胸腺组织按照方案第2节和3.1节所述方法处理，以获得单细胞悬液，并通过单次Percoll密度梯度离心进行分离。单细胞悬液中约含有3%的HLA-DR+细胞（图3A），经Percoll离心后，该比例在低密度组分（LDF，含有较大细胞）中升高至15–40%，而主要由均一的小型胸腺细胞组成的高密度组分（HDF）则几乎不含此类细胞（图3B）。随后收集富含抗原呈递细胞（APC）的目...
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讨论
本文所述方案是对 Gotter et al4 发表方案的修改。该方案中的关键步骤包括组织的状态与初始处理，以及 Percoll 密度梯度分离。我们强烈建议在组织采集后尽快进行处理。在清洗和切割组织时，操作应迅速且彻底。在步骤 2.3 所述的胸腺细胞洗涤过程中，使用注射器活塞背面按压组织块时，需掌握适当的压力平衡，因为过于剧烈或持续时间过长的压力可能会损伤基质细胞。将培养基缓慢铺加在 Percoll 溶液/细胞悬液上方而不引起扰动，也可能需要一定的操作经验。离心后，应尽快从 Percoll 层中收集全部低密度组分的细胞，并尽量减少 Percoll 溶液的混入。
总体细胞得率和相对APC数量可能差异较大（见表1），并取决于供体（尤其是年龄因素）以及实验操作人员的技术水平。简要概述而言，可根据需要在方案的不同步骤后，使用HLA-DR和/或其他标志物对细胞悬液进行染色。用于表型分析的所有抗体均应进行滴定，以获得最佳结果。
由于与胸腺细胞相比，胸腺中抗原呈递细胞（...
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致谢
我们感谢图宾根大学医院胸心血管外科的外科医生们为我们提供了胸腺样本，感谢德国海德堡DKFZ的Bruno Kyewski提供了CDR2抗体。我们还要感谢图宾根大学分选设施的Hans-Jörg Bühring和Sabrina Grimm。本工作得到了SFB 685和Hertie基金会的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 试剂与材料 | |||
| RPMI 1640 | PAA | E15-842 | |
| Dulbecco's PBS | PAA | H15-002 | |
| 胎牛血清-Gold | PAA | A15-151 | |
| 牛血清白蛋白 | PAA | K41-001 | |
| 胶原酶A | Roche | 10 103 586 001 | |
| DNase I，II型牛胰腺来源 | Roche | 10 104 159 001 | |
| 胰蛋白酶-EDTA 10倍PBS溶液 | PAA | L11-001 | 储存浓度 20 mg/ml |
| Alexa Fluor 488 蛋白标记试剂盒 | Molecular Probes | A-10235 | |
| 抗人CDR2（纯化） | Bruno Kyewski, DKFZ- Heidelberg, Germany | 用Alexa Fluor 488标记 | |
| 抗人CD45（Pacific Blue） | Biolegend | 304022 | |
| 抗人EpCAM（APC） | Miltenyi Biotec | 130-091-254 | |
| 抗人CD11c（PE） | Miltenyi Biotec | 130-092-411 | |
| 抗PE微珠 | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | |
| 抗CD45微珠，人源 | Miltenyi Biotec | 130-045-801 | |
| LS柱 | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| gentleMACS C管 | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | 用于组织解离仪 |
| Percoll（密度1.130 g/ml） | GE Healthcare, Life Sciences | 17-0891-01 | |
| 无菌蒸馏水（无DNA酶/RNA酶） | GIBCO | 10977-035 | |
| Gamunex 10% | Tajecris-Biotherapeutics | G120052 | 1:10预稀释，使用20 μl/1 × 106细胞 |
| 0.22 μm滤器 | Millex GS | SLGS033SS | 注射器驱动 |
| Stericup滤器单元 | Millipore | SCGPU05RE | 泵驱动 |
| 50 ml PC橡树岭离心管 | Nalgene | 3118-0050 | 50 ml |
| 50 ml PP锥形管 | Becton Dickinson | 352070 | |
| 12 mm × 75 mm 5 ml试管 | Becton Dickinson | 352058 | 用于FACS染色 |
| 70 μm细胞筛 | Becton Dickinson | 352350 | |
| 仪器 | |||
| 流式细胞仪-分选仪（BD FACSAriaTMIIu） | Becton Dickinson | ||
| Sorvall Evolution R6（转子） | Kendro | ||
| Rotator REAX 2 | Heidolph | ||
| gentleMACS解离仪 | Miltenyi Biotec | 130-093 235 | 组织解离仪 |
参考文献
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