本方案详细介绍了通过一系列酶消化步骤从人胸腺中分离抗原提呈细胞的方法，随后对单细胞悬液进行密度梯度离心，最后通过磁珠分选和/或荧光激活细胞分选（FACS）分离目标细胞群体。
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本文内容
摘要
摘要
本方案提供了一种从人胸腺中分离树突状细胞（DC）和胸腺上皮细胞（TEC）的方法。DC和TEC是正常胸腺中存在的主要抗原提呈细胞（APC）类型，它们在胸腺选择过程中发挥着明确且不同的作用。这些细胞定位于胸腺内不同的微环境，且每种APC类型仅占细胞总数的极小比例。为了进一步理解这些细胞类型的生物学特性，对它们进行表征非常必要；但由于其频率较低，分离任一类细胞均需要高效且可重复的操作流程。本方案详细描述了一种获取适用于多种细胞特性表征的细胞的方法。胸腺组织经机械破碎后，进行多步酶消化处理，所得细胞悬液通过Percoll密度梯度离心进行富集。对于髓系树突状细胞（CD11c+）的分离，采用磁性细胞分选法从低密度组分（LDF）中免疫富集目标细胞。TEC群体（mTEC、cTEC）的富集则是通过从Percoll低密度细胞组分中去除造血系（CD45hi）细胞实现，随后利用特异性细胞标志物通过荧光激活细胞分选（FACS）完成进一步分离。所获得的细胞可用于多种下游应用。
引言
胸腺是T细胞发育的器官。随着年龄增长，胸腺的相对和绝对体积逐渐减小，并逐步被脂肪组织取代，尽管在老年人中仍可检测到胸腺活性。其在免疫应答中的重要性于20世纪60年代初得到证实1。
T细胞受体与不同类型的胸腺抗原提呈细胞（APC）表面的肽-MHC复合物相互作用，从而塑造T细胞受库，这些相互作用为发育中的T细胞提供存活或死亡信号，最终形成具有功能且在很大程度上对自身耐受的T细胞受库2。
人类胸腺中约98%的细胞是正在发育的T细胞，称为胸腺细胞。其余2%由多种不同类型的细胞组成，包括多种胸腺上皮细胞（皮质型、髓质型、被膜下型）、髓系和浆细胞样树突状细胞（mDC、pDC）、巨噬细胞、B细胞、成熟的再循环T细胞、粒细胞、成纤维细胞、内皮细胞，以及极少数表达表型类似于其他组织（如肌肉、神经元和呼吸道上皮）细胞的上皮细胞（图1）。其中，胸腺上皮细胞（TEC）和树突状细胞（DC）是正常胸腺中主要的抗原呈递细胞（APC）类型。近年来，对这些APC类型进行分离培养和分子特征分析的研究兴趣日益增加。由于这些细胞类型的频率较低，对其进行深入分析所需的分离过程必须高效、可重复且成本较低。本文所述方法是在先前已发表研究3,4的基础上进行的改进。
与其它组织一样，胸腺组织的细胞提取可通过酶解方法破....
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方案
1. 工具、酶溶液和缓冲液的准备
在开始本方案之前，请完成以下准备工作。
- 工具
将以下工具清洗、干燥并进行高压灭菌，并在无菌包装中保存至使用。- 用于切割胸腺组织的小型锋利剪刀（可选用弯头或直头），以及带锯齿尖端的小型弯头镊子，用于处理组织。
- 50 ml 橡树岭离心管（PC），用于 Percoll 密度梯度离心步骤。
- 酶溶液
按以下步骤配制胶原酶/脱氧核糖核酸酶 I（Collagenase/DNase I）酶混合液（2 mg 胶原酶/ml 和 0.1 mg DNase I/ml）：- 将 500 mg 冻干胶原酶 A（Roche）溶解于 250 ml RPMI 1640 培养基（不含 FCS）中，得到浓度为 2 mg/ml 的胶原酶溶液。胶原酶较难溶解，建议在室温下置于滚轴摇床上放置一段时间以助溶解。
- 将 100 mg DNase I（Roche）溶解于 10 ml 无菌蒸馏水中。分装成 2.5 ml 等份，可于 -20 °C 保存。取 2.5 ml 浓度为 10 mg/ml 的 DNase I 溶液加入 2 mg/ml 的胶原酶 A 溶液中。
- 使用 Stericup 滤器装置（0.22 μm）对胶原酶/DNase I 混合液进行无菌过滤。分装为 10–20 ml 等份....
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结果
本方案中使用的起始材料为接受矫正性心血管手术的儿童所切除的胸腺组织（德国图宾根大学医院胸心血管外科提供），在获得知情同意并遵循机构指导原则的前提下获取。这种废弃组织的大小差异较大，可从2-30克甚至更大。所获得的成熟树突状细胞（mDC）以及胸腺上皮细胞亚群（cTEC和mTEC）的数量取决于用于分离的胸腺组织样本的大小及其年龄。
图2 显示从一名六岁儿童获取的一块较大的组织（约9 cm）。本方案中一个重要的初步准备步骤是清除组织中不需要的部分（由白色箭头指示）。
胸腺组织按照方案第2节和3.1节所述方法处理，以获得单细胞悬液，并通过单次Percoll密度梯度离心进行分离。单细胞悬液中约含有3%的HLA-DR+细胞（图3A），经Percoll离心后，该比例在低密度组分（LDF，含有较大细胞）中升高至15–40%，而主要由均一的小型胸腺细胞组成的高密度组分（HDF）则几乎不含此类细胞（图3B）。随后收集富含抗原呈递细胞（APC）的目.......
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讨论
本文所述方案是对 Gotter et al4 发表方案的修改。该方案中的关键步骤包括组织的状态与初始处理，以及 Percoll 密度梯度分离。我们强烈建议在组织采集后尽快进行处理。在清洗和切割组织时，操作应迅速且彻底。在步骤 2.3 所述的胸腺细胞洗涤过程中，使用注射器活塞背面按压组织块时，需掌握适当的压力平衡，因为过于剧烈或持续时间过长的压力可能会损伤基质细胞。将培养基缓慢铺加在 Percoll 溶液/细胞悬液上方而不引起扰动，也可能需要一定的操作经验。离心后，应尽快从 Percoll 层中收集全部低密度组分的细胞，并尽量减少 Percoll 溶液的混入。
总体细胞得率和相对APC数量可能差异较大（见表1），并取决于供体（尤其是年龄因素）以及实验操作人员的技术水平。简要概述而言，可根据需要在方案的不同步骤后，使用HLA-DR和/或其他标志物对细胞悬液进行染色。用于表型分析的所有抗体均应进行滴定，以获得最佳结果。
由于与胸腺细胞相比，胸腺中抗原呈递细胞（.......
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致谢
我们感谢图宾根大学医院胸心血管外科的外科医生们为我们提供了胸腺样本，感谢德国海德堡DKFZ的Bruno Kyewski提供了CDR2抗体。我们还要感谢图宾根大学分选设施的Hans-Jörg Bühring和Sabrina Grimm。本工作得到了SFB 685和Hertie基金会的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 试剂与材料 | |||
| RPMI 1640 | PAA | E15-842 | |
| Dulbecco's PBS | PAA | H15-002 | |
| 胎牛血清-Gold | PAA | A15-151 | |
| 牛血清白蛋白 | PAA | K41-001 | |
| 胶原酶A | Roche | 10 103 586 001 | |
| DNase I，II型牛胰腺来源 | Roche | 10 104 159 001 | |
| 胰蛋白酶-EDTA 10倍PBS溶液 | PAA | L11-001 | 储存浓度 20 mg/ml |
| Alexa Fluor 488 蛋白标记试剂盒 | Molecular Probes | A-10235 | |
| 抗人CDR2（纯化） | Bruno Kyewski, DKFZ- Heidelberg, Germany | 用Alexa Fluor 488标记 | |
| 抗人CD45（Pacific Blue） | Biolegend | 304022 | |
| 抗人EpCAM（APC） | Miltenyi Biotec | 130-091-254 | |
| 抗人CD11c（PE） | Miltenyi Biotec | 130-092-411 | |
| 抗PE微珠 | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | |
| 抗CD45微珠，人源 | Miltenyi Biotec | 130-045-801 | |
| LS柱 | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| gentleMACS C管 | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | 用于组织解离仪 |
| Percoll（密度1.130 g/ml） | GE Healthcare, Life Sciences | 17-0891-01 | |
| 无菌蒸馏水（无DNA酶/RNA酶） | GIBCO | 10977-035 | |
| Gamunex 10% | Tajecris-Biotherapeutics | G120052 | 1:10预稀释，使用20 μl/1 × 106细胞 |
| 0.22 μm滤器 | Millex GS | SLGS033SS | 注射器驱动 |
| Stericup滤器单元 | Millipore | SCGPU05RE | 泵驱动 |
| 50 ml PC橡树岭离心管 | Nalgene | 3118-0050 | 50 ml |
| 50 ml PP锥形管 | Becton Dickinson | 352070 | |
| 12 mm × 75 mm 5 ml试管 | Becton Dickinson | 352058 | 用于FACS染色 |
| 70 μm细胞筛 | Becton Dickinson | 352350 | |
| 仪器 | |||
| 流式细胞仪-分选仪（BD FACSAriaTMIIu） | Becton Dickinson | ||
| Sorvall Evolution R6（转子） | Kendro | ||
| Rotator REAX 2 | Heidolph | ||
| gentleMACS解离仪 | Miltenyi Biotec | 130-093 235 | 组织解离仪 |
参考文献
- Miller, J. F. A. P. The discovery of thymus function and of thymus-derived lymphocytes. Immunological Reviews. 185, 7-14 (2002).
- Klein, L., Hinterberger, M., Wirnsberger, G., Kyewski, B. Antigen presentation in the thymus for positive selection and c....
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