评估单侧颈髓损伤后前肢功能的新型任务：肢体交替步态、姿势不稳定性和意大利面取物操作

摘要

本文描述了三种新的行为学测试方法（前肢步态交替测试、姿势不稳测试、意面抓取测试），用于评估啮齿类动物颈段脊髓损伤后的前肢功能。

摘要

颈段脊髓损伤（cSCI）可导致严重的神经功能缺损，包括上肢和手部功能的受损或丧失。人类大多数脊髓损伤发生在颈椎节段。因此，建立颈段损伤模型并开发相关且敏感的行为学检测方法具有重要意义。本文描述了一种新开发的前肢步态交替测试在大鼠颈段脊髓损伤后的应用。此外，我们还介绍了两种此前未用于脊髓损伤后评估的行为学测试：姿势不稳测试（PIT）和意大利面抓取测试。这三种行为学测试对损伤均具有高度敏感性，且操作简便。因此，我们认为这些行为学测试在研究cSCI后的治疗策略中可发挥重要作用。

引言

颈段脊髓损伤（cSCI）是患者中最常见的脊髓损伤类型，约占所有脊髓损伤的62%（http://www.spinalcord.uab.edu）。颈段脊髓损伤可能导致上肢功能障碍以及呼吸困难。近期一项针对cSCI患者的研究表明，上肢和/或手部的部分或完全功能恢复被认为是患者最优先关注的目标¹。因此，建立易于操作、敏感且可靠的cSCI动物模型及相关行为学检测方法是一个重要的研究目标。目前已有一些可用于评估啮齿类动物cSCI后前肢功能的行为学测试方法^1-17，但其中许多方法操作复杂，且需要特殊设备。其他研究团队已开发出意大利面取食操作测试^18,19，但该方法要求动物在特定的取食笼内进行摄食并录像，训练周期较长；而我们提出的方法可在动物的常规饲养笼内完成。此前报道的意大利面测试通常需要大量分析时间，且常需使用昂贵的分析软件，而本文所述方法则无需此类条件。本方法的目标是建立并使用操作简便、结果可靠且无需昂贵设备的行为学检测手段。具体而言，本文所述的前肢交替步态测试可使研究人员在损伤早期估算损伤体积，从而在实施长期干预前实现各实验组间的匹配。在本研究中，我们详细描述了三种新颖的行为学测试方法：（1）前肢交替步态测试，（2）姿势不稳测试，以及（3）意大利面取食操作测试。

确定使用哪些行为学测试可能较为困难。事实上，我们认为单一的行为学测试无法充分评估前肢功能。因此，我们建议结合使用多种行为学测试来评估脊髓损伤（SCI）后的前肢功能。从类别上讲，应采用一种开放场地的运动类任务（例如 前肢运动功能评分，圆筒实验）中评估动物在正常运动过程中前肢的使用情况，以及一项任务特异性测试，即要求动物执行一项需要使用前肢的特定任务（例如。意大利面进食、姿势不稳、握力 等。）。此处详细描述的行为学测试可用于评估损伤后约一周时的损伤严重程度（前肢交替步态、姿势不稳、意大利面取物测试），评估单侧损伤对对侧前肢的影响（前肢交替步态、姿势不稳），以及前肢精细运动功能（意大利面取物测试）。了解所用损伤模型的严重程度及其效应，有助于选择合适的行为学测试方法。若损伤后腕部的精细运动无法实现，则采用测量和量化前肢爪部使用情况的测试方法是不恰当的。例如，许多先前报道的意大利面取物测试会深入分析各手指的独立运动，但我们发现，鉴于本研究中损伤的严重程度和位置，这些指标并不相关，而应关注前肢整体定位方式的差异。

研究者可能倾向于进行多种行为学测试，并根据结果选择其中一部分用于演示。然而，建议针对每种实验模型均先开展预实验，以确定适用于该损伤的行为学测试方法。因此，需要特别指出的是，在决定采用哪些行为学测试之前，使用者应至少对特定类型损伤所导致的功能缺陷类型及其严重程度具备一定的先验知识。基于行为学表现来评估损伤严重程度，还可以在施加治疗干预之前，确保各治疗组间的损伤严重程度分布均衡。

方案

所有动物实验均依照德克萨斯大学奥斯汀分校内部动物护理与使用委员会（IACUC）批准的方案进行，并遵循美国国立卫生研究院（NIH）的指导原则。

本研究中使用的动物通过Infinite Horizon撞击器建立了C3/C4侧方挫伤模型，或采用C3/C4侧半切模型，这些方法也可广泛应用于其他模型¹⁸。我们建议研究人员在损伤前对动物进行为期2周的测试，在损伤后第3天以及研究期间定期（例如每周）进行测试。对术后动物进行行为学测试时，尤其是在术后第3天，必须注意确保动物已从手术中充分恢复，并且行为学测试过程不会给动物带来额外的疼痛或应激。

通常，在手术前需要进行 2 至 3 周的适应性操作和术前测试。这包括以与正式测试期间相同的方式对动物进行抓握操作，使其适应测试环境，同时允许动物在测试表面上自由活动。同时，让动物习惯被手持操作也非常重要，可通过在测试表面附近以非直接移动的方式移动动物，使其逐步适应抓握操作。在测试开始前以及各次测试之间，使动物保持放松状态也十分关键。为使动物放松，可将动物置于实验台面上，使其以前肢承重的姿势，呈“手推车”式站立，并轻轻上下弹动动物，使其前肢反复接触台面。这一过程有助于训练动物感知下方是否存在稳定支撑面，是实验操作中重要且必要的步骤，可确保动物在正式测试开始前处于放松状态。

1. 前肢交替步态测试

1. 测试总结：将动物放置在桌面上，使其双前肢均接触桌面，以判断其前肢是否交替使用。向前移动大鼠，使其重心前移，迫使它们尝试迈步。每只动物重复此测试四次，若动物前肢交替使用的能力达到或超过75%，则视为“交替者”。此为强制运动任务，因此被判定为“非交替者”的动物会反复使用同一条前肢迈步。
2. 将动物以仅前肢承重的姿势置于桌面上，身体与桌面接近呈90°角，呈“手推车”姿势。
3. 待动物表现放松后，向前推动其沿桌面表面移动。
4. 判断并记录大鼠在移动过程中前肢是否交替使用。
5. 记录启动运动的前肢以及动物在“前肢迈步交替测试评分表”（随附）中是否能够交替迈步。
6. 用一只手（右手或左手）握住动物，至少重复测试两次；再换另一只手握住动物，至少重复测试两次。
7. 若大鼠表现出该能力，可通过在首次迈步后引入5秒等待时间再次测试其迈步交替能力，以判断延迟后交替模式是否仍保持。记录结果并填入评分表。
8. 该测试可每日进行，建议在重复测量实验中至少每周测试一次动物。

注意：必须交替实验人员的手部位置，因为这可能会影响测试动物的交替行为。可使用提供的步态交替评分表记录动物迈步时的足部位置和使用情况。尽管目前我们尚未将这些数据纳入评分系统（在本研究中仅使用了交替状态对损伤动物进行分组），但用户可根据具体研究项目，轻松地将足部位置数据纳入分析。

2. 姿势不稳测试

1. 测试概述： 进行此项行为学测试时，将大鼠保持与前肢交替测试相似的姿势，但应分别单独测试每只前肢。测试台面应覆盖砂纸（220号），以防止测试过程中前肢打滑、支撑或拖拽。
   1. 本测试中，将记录动物为恢复平衡而用被检测前肢迈出一步所需移动的距离。
   2. 同一实验组内的动物应具有相近的体重、体型和年龄，因为体重差异较大可能导致不同个体维持重心所需的基线距离出现变异¹⁹。当使用姿势不稳测试（PIT）时，应设置假手术组，以确认行为变化是源于神经再生或功能恢复，而非年龄增长或体重增加所致。
2. 将动物以舒适站立姿势持于台面上，使其双前肢均能接触台面，动物身体应大致呈“手推车”状，躯干与台面接近垂直90°。需注意应尽量使动物保持更接近垂直的姿势，这有助于获得更一致的触发迈步所需距离，以恢复重心平衡。
3. 轻轻将一侧前肢固定于动物躯干侧面，并从上方观察，使大鼠鼻尖对准零刻度线。
4. 向前移动大鼠，使其重心前移，从而刺激动物迈步以恢复平衡。
5. 记录大鼠连续迈步两次后鼻尖的新位置，并取这两次迈步距离的平均值作为触发迈步所需的距离。
6. 每侧前肢独立测试5次，每次测试后将动物重新归零，并确认动物在实验者手中仍保持放松状态，以确保结果的一致性。
7. 将数据记录于提供的姿势不稳测试（PIT）评分表中。该测试可每日进行，建议在整个实验期间至少每周测试一次。

3. 面条处理测试

1. 测试概述：使用本测试评估啮齿类动物进食一段意大利面所需的时间及其在进食过程中的前肢偏好。在本测试中，使用长度为4.0 cm的干意大利面（细意大利面，直径约1.6 mm）。测试应在每天大致相同的时间进行。啮齿类动物通常能 readily 进食干意大利面；但如果动物不主动进食，建议在测试前禁食4-6小时。
2. 应在损伤前1-2周获取基线测量数据。在进行基线记录之前，应让大鼠在饲养笼内接触相同类型的意大利面，以适应测试。随后，让大鼠在测试箱内进食意大利面，并记录其进食时间。应将意大利面片段放置在测试箱前部附近，以便清晰观察前肢的使用情况。每次进食测试应包含至少三段意大利面的进食过程。若大鼠连续至少3天的进食时间保持稳定，则认为其已熟练掌握意大利面进食。
3. 在训练大鼠能够在测试箱内稳定地进食意大利面后，将大鼠放入记录用测试箱中进行正式测试。
4. 将意大利面片段放置在测试箱前部附近的地面，记录大鼠进食一段意大利面所需的时间、所使用的前肢以及前肢的位置，具体参照《意大利面操作评分表》（Pasta Handling Score sheet）中的标准进行评估。
5. 本测试可每日进行，但建议每周进行一次，同时监测动物体重，以避免过度喂食。

注意：意大利面处理评分表提供了记录食用意大利面所需时间及前肢使用情况的空间，类似于本研究中包含的数据。我们还增加了用于记录进食过程中前肢使用其他细节的区域，例如前肢的位置。

结果

我们建议在实验过程中定期对动物进行测试，采用重复测量设计的实验方法，以改进分析并评估随时间推移的改善情况。

前肢交替步态测试

该测试旨在评估动物交替使用前肢的能力。通过前肢步态交替测试，在脊髓损伤（cSCI）后12至16周，仅有50%的动物能够交替使用其前肢¹⁹（图1A）。接下来，我们在动物迈出第一步后将其固定不动5秒，引入一个延迟，然后再推动动物完成第二步。在这一5秒延迟条件下，仅有原本能交替使用前肢的动物中的一半（即全部损伤组的25%）仍能保持交替步态（图1B）。我们将这些行为学结果与解剖学研究进行关联分析，结果表明，能够交替步态的动物在对侧保留了显著更大面积的皮质脊髓束 [F(1,1) = 5.56, p < 0.05] 和背柱 [F(1,1) = 19.2, p < 0.003]¹⁹。这些数据表明，前肢步态交替测试可用于预测损伤的严重程度以及损伤的单侧性。该测试产生的是名义上的分类数据，应采用重复测量分析方法进行统计分析。在本示例中，并未进行重复测量，而是选取一个时间点来展示组间差异。每只动物将被归类为“交替者”或“非交替者”，从而将动物分为两组损伤程度（分别为中度与重度）。

姿势不稳测试

脊髓单侧损伤不仅可导致受损或受累肢体发生改变，也可影响未受损肢体。姿势不稳测试（PIT）此前已在帕金森病大鼠模型动物中被描述并应用。 ¹⁸ 以及在cSCI的啮齿类动物模型中 ¹⁹我们对慢性脊髓损伤（cSCI）后使用PIT，发现损伤状态具有显著效应[F(1,1) = 8.17, p < 0.01]。此外，与假手术组动物相比，损伤动物同侧前肢（右前肢）的位移（恢复重心所需距离）显著更大（6.00 ± 0.24 cm 对比 8.00 ± 0.10 cm， p < 0.0001; 图2). 与假手术动物相比，损伤动物健侧前肢的位移距离显著减小（假手术组为 6.00 ± 0.25 cm，cSCI 组为 4.00 ± 0.10 cm， p < 0.0001; 图2）。该结果表明，对侧前肢也因对侧损伤而发生了改变（即 通过健侧前肢进行姿势调整以重新获得重心平衡的变化。该测试所得数据为定量数据，应采用重复测量方差分析（repeated measures ANOVA）来检验实验过程中各组的变化。

意大利面操作测试

意大利面取食实验旨在测试动物在食用干意大利面时前肢的灵巧运用能力。此前类似实验已被用于检测单侧脑卒中和帕金森病动物模型^20,21以及慢性脊髓损伤（cSCI）后¹⁹前肢灵巧功能的缺陷。在损伤后慢性阶段（损伤后12周），所有假手术组动物在测试期间均能使用双侧前爪取食意大利面。而在损伤组中，我们发现整体取食一根意大利面所需时间与对照组相似（图3）。然而，相较于非交替组（重度损伤组；7只中有1只），更多交替组动物（轻度损伤；15只中有10只）能够使用同侧损伤前肢取食（图3）。意大利面取食实验可提供连续且定量的数据（取食时间）以及分类数据（前爪使用情况），应据此进行适当的分析。

图 1. 采用前肢步态交替实验对前肢功能进行慢性评估，结果显示动物根据损伤严重程度分为两个不同群体。动物在使用双前肢向前行走时表现出行为差异。仅50%的损伤动物在行走过程中交替使用前肢（交替型；10只损伤大鼠中有5只），而其余动物则表现为连续迈出同侧（对侧）前肢，缺乏步态交替能力（非交替型；10只损伤大鼠中有5只）。若在每步之间引入5秒延迟，表现出连续迈出同侧（对侧）前肢倾向的动物数量进一步增加（10只损伤大鼠中有8只）。

图 2. 使用姿势不稳测试（PIT）进行前肢慢性行为学评估。 如预期所示，颈段脊髓损伤（cSCI）动物的同侧前肢位移距离显著大于假手术组动物（6 cm 对 8 cm；*p<0.0001）。此外，与假手术动物相比，损伤动物对侧前肢的位移距离显著更小（6 cm 对 4 cm；*p<0.0001）。这可能提示在PIT测试中，损伤动物的对侧肢体功能有所增强。

图 3. 使用意大利面抓取与进食测试评估前肢功能，结果显示损伤后非交替组动物存在显著功能障碍。 实验中给予动物一段标准长度的意大利面，记录其前爪使用情况及进食所需时间。结果表明，交替组中仅有少数动物（33%）完全使用对侧前肢（提示损伤较轻），而非交替组中该比例显著升高（86%）。此外，假手术组、损伤后交替组和损伤后非交替组三组动物进食意大利面所需时间相似（p<0.05）。 点击此处查看高清大图。

讨论

颈脊髓损伤（cSCI）可导致患者出现毁灭性且改变终身的伤害。目前已开发出多种啮齿类动物颈脊髓损伤模型，用于研究神经基质的可塑性及治疗药物的效果。开发出敏感、有效、可重复且易于使用的功能性行为学检测方法，以评估颈脊髓损伤后的功能缺损及恢复情况，是一个重要的研究目标。本文中，我们详细描述三种此类行为学检测方法的应用：肢体交替试验、姿势不稳试验和意大利面处理试验。

啮齿类动物的脊髓损伤与人类相似，均属于异质性损伤。非常相似的损伤可能引发多种行为功能缺陷。因此，确定损伤动物病变严重程度非常重要。我们发现，肢体交替任务是判断颈段脊髓单侧损伤（半横断或挫伤型损伤）后对侧是否受损的一种非常有效的方法¹⁹。本课题组的研究数据显示，利用肢体交替任务可在损伤后第一周内判断损伤的严重程度。此外，损伤较严重的动物（非交替型）与能够进行肢体交替的动物（交替型）在恢复过程方面表现出显著差异（通过前肢运动功能评分量表评估）。因此，肢体交替任务在将损伤大鼠分为交替型与非交替型两组方面具有极高价值，特别是在研究涉及慢性干预治疗时，可确保各治疗组间损伤严重程度的分布均衡。

建议将前肢交替测试与其他可检测动物前肢使用情况的任务结合使用（如前肢运动功能评分或圆筒前肢偏好测试）。在实施该测试时，实验人员必须确保使用每只手进行测试的次数相同。例如 用左手两次，右手两次）以尽量减少实验者手部位置对大鼠行为的影响。该测试仅在动物于实验者手中处于放松状态时有效；建议进行2-3周的抓握训练以使动物放松。此外，当动物完全放松后，实验者应将其以接近90°的独轮车姿势握住，以减少个体内变异。

当前肢交替测试中动物无法用单个爪子独立迈步但能够完成交替动作时，该测试还可用于研究脊髓交叉神经连接。在大鼠等动物的正常四足运动中，涉及多个脑区以及沿脊髓全长分布的局部中枢模式发生器（CPGs）。具体到前肢节律性运动，颈段脊髓 C3-C6 节段被认为具有重要作用²²。此前，我们描述了损伤动物（在 C3/C4 处实施侧半横断）中能够交替运动与不能交替运动个体之间的解剖学差异，发现不能交替运动的动物其同侧损伤对侧的背柱和皮质脊髓束损伤更为严重¹⁸。目前认为，前肢运动的节律性模式发生器存在于颈段半侧脊髓的各个节段，而脊髓左右侧之间的交叉抑制性连接负责产生交替动作²³。我们先前的解剖学发现也表明，脊髓对侧的损伤可能破坏节律性运动输出（如交替动作），而若脊髓对侧结构更为完整，则节律性运动输出更有可能正常运作。我们未观察到脊髓对侧内侧腹侧区域存在显著损伤，因此未进行相关分析。

此处描述的姿势不稳测试是一种非常有用的检测方法，因为它能够检测到单侧损伤引起的双侧前肢（同侧和对侧）功能变化。需要注意的是，该测试仅应在动物处于实验者手中且完全放松的状态下进行。根据我们的经验，这通常需要对动物进行每天2-3周的持续抓握训练。一旦实验者与动物之间建立了舒适的关系，该测试将非常敏感，并可获得每侧前肢高度一致的位移数据。如果动物处于紧张状态，实验者可轻柔地握住动物，将其反复轻缓地从桌面上提起再放下，直到动物放松并理解桌面是安全的位置。当动物完全放松后，为获得一致的结果，应将其以接近90°的角度保持在“手推车”姿势中。该测试操作简便，仅通过一个简单的任务即可提供关于代偿机制和功能缺损的深入信息，优于其他行为学测试。

大鼠在摄像机前经过训练后 readily 食用干意大利面。因此，意大利面取食测试是一种相对容易实施的行为学实验。在本研究中，我们仅记录并使用了动物在取食过程中肢体使用情况（左侧、右侧或双侧）以及取食时间的数据。此前已有研究对存在单侧缺血性损伤和单侧纹状体多巴胺耗竭等损伤的动物进行了更详细的分析，包括取食意大利面过程中的爪子调整动作^20,21,24。因此，有可能在慢性脊髓损伤（cSCI）后开发并采用更为敏感的意大利面取食测试分析方法。我们在评分表中加入了爪子位置的记录项，因为这可能揭示动物的利手倾向或每只前爪的操作能力。此外，我们还记录每只爪子的抓握方式；一些动物在取食时会将爪子放置在意大利面的一侧，可能仅作为支撑，而非真正抓握意大利面。如果动物对食用意大利面表现出犹豫，可在测试前向实验方案中引入食物剥夺步骤。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
砂纸	3M	5097	使用了3M Gold Fre-Cut砂纸。 任何220目砂纸均可适用
干意大利面	Skinner		使用了Skinner细意大利面，可在沃尔玛购买