骨髓来源巨噬细胞的制备

摘要

巨噬细胞长期以来被认为是先天性和适应性免疫应答的关键组成部分。近年来，关于巨噬细胞与微生物之间在进化、遗传和生化方面相互作用的知识迅速增长，使科学界对巨噬细胞重新给予了高度关注。本文介绍了一种从小鼠骨髓中分化巨噬细胞的方法。

摘要

巨噬细胞是先天性和适应性免疫反应的关键组成部分，由于其强大的杀菌活性，它们构成了抵御外来病原体的第一道防线。巨噬细胞广泛分布于全身，存在于淋巴器官、肝脏、肺、胃肠道、中枢神经系统、骨骼和皮肤中。由于其分布广泛，巨噬细胞参与了多种生理和病理过程。巨噬细胞是高度多能的细胞，能够识别微环境的变化，并维持组织稳态。许多病原体已进化出利用巨噬细胞作为“特洛伊木马”的机制，以在其中存活、复制，感染人类和动物，并在体内传播。近年来，人们对宿主-病原体相互作用在进化、遗传和生化层面的研究兴趣激增，使巨噬细胞再次成为科学关注的焦点。本文描述了一种从小鼠骨髓中分离和培养巨噬细胞的方法，可获得大量巨噬细胞，用于研究宿主-病原体相互作用以及其他相关过程。

引言

巨噬细胞功能的一个重要方面是其在先天免疫和适应性免疫中的作用。由于巨噬细胞具有吞噬惰性颗粒、细菌或寄生虫的能力，因此它们是抵御外来病原体的第一道防线。一旦被内化，微生物将在吞噬溶酶体中被降解。巨噬细胞还能向其他免疫细胞（如T淋巴细胞）发出招募信号并呈递抗原。巨噬细胞来源于单核细胞。单核细胞由骨髓中的髓系干细胞产生，并迁移至外周血和各种组织，在这些部位分化为巨噬细胞。据估计，一只健康的成年小鼠体内约含有10⁸个巨噬细胞，广泛分布于全身各器官和组织中（表1）^1,2。由于巨噬细胞能够适应其微环境，因而表现出高度的表型和功能多样性^3,4。巨噬细胞最重要的特性是其杀菌活性，这由其吞噬并消灭微生物的能力所决定。吞噬反应由微生物接触所激活的复杂信号网络介导；因此，巨噬细胞能够根据不同的刺激适当调节基因表达。吞噬后，微生物在一种称为吞噬溶酶体的结构中被清除；然而，许多致病性微生物已进化出多种策略以逃避巨噬细胞的杀菌功能⁵。不同微生物物种所采用的逃逸机制多种多样，这充分说明了吞噬过程⁶及吞噬溶酶体形成的复杂性。感染性疾病是人类健康的主要问题之一，众多机制和分子参与了巨噬细胞的抗微生物活动。此外，微生物所劫持的杀菌作用靶点仍有许多未知；因此，人们对宿主-病原体相互作用的进化、遗传和生化机制产生了极大兴趣，使巨噬细胞重新成为科学研究的焦点。目前，该领域的大多数研究使用巨噬细胞系进行，但这些细胞系在吞噬活性、细胞因子产生以及氧化爆发的调控方面均与原代巨噬细胞存在差异。此外，它们在显微镜观察方面也不够理想。为了研究巨噬细胞与病原体之间的相互作用，建议使用更具有生理特性的原代巨噬细胞，例如骨髓来源的巨噬细胞（BMDMs）。此外，还可以使用基因修饰的BMDMs，因为这些巨噬细胞可直接从转基因小鼠中分离获得，并且借助慢病毒转染等新技术，可通过基因过表达或RNA干扰手段改变其基因表达谱。本文介绍了一种将小鼠骨髓细胞分化为巨噬细胞的方法，可在7天内获得大量巨噬细胞，用于蛋白质组学⁷、转录组学⁸、细胞内运输研究⁹、动态过程分析¹⁰、遗传筛选（RNAi）以及药物筛选¹¹等多种功能分析。

方案

伦理声明

动物处理方案已获得本机构动物伦理委员会的批准 "中国台湾医学与外科实验研究与培训中心科学委员会" （根据Aix-Marseille大学Eric Ghigo持有的CFREMC项目许可10-300122013，遵循Décret N的规定）° 87-848号，1987年10月19日。实验在蒂莫内医学院进行（实验许可号13.385，持有人Eric Ghigo）。

1. 材料与培养基制备

1. 将两把镊子、两把剪刀、两把手术刀片、研钵和研杵进行灭菌处理。
2. 准备含10%胎牛血清（FCS）、2 mM谷氨酰胺、100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的完全DMEM培养基。
3. 用无菌蒸馏水稀释10倍PBS，配制成1倍PBS。
4. 准备冰冻的1倍PBS、冰冻的完全DMEM以及预热至37 °C的完全DMEM。

2. L929 细胞上清液的制备

1. 在完全DMEM培养基中，于37 °C、5% CO₂条件下，将L929细胞培养至汇合（二十个175 cm²培养瓶）。

注意：诱导造血细胞分化为巨噬细胞需要粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）¹²。L929 细胞可产生 GM-CSF。

2. 细胞汇合后，更换为新鲜的完全DMEM培养基，将培养瓶转移至32 °C、5% CO₂条件下培养10天。
3. 收集上清液，合并后在750 × g离心10分钟，弃去细胞沉淀。
4. 将上清液分装至15 ml离心管中，于-20 °C保存。

3. 骨髓来源巨噬细胞（BMDM）的制备

1. 通过颈椎脱位处死1只小鼠。
   1. 整个实验过程中使用无菌手术刀。用70%酒精消毒皮肤，在每条后肢顶部做切口，并将皮肤向下拉至足部以暴露肌肉。
   2. 剪下后肢，用无菌剪刀和无菌镊子去除皮肤，将后肢放入含有5 ml无菌冰浴1×PBS的无菌培养皿（35/10 mm）中。
   3. 用无菌剪刀和无菌镊子去除附着在骨骼上的组织和肌肉。
2. 将骨骼转移至新的无菌培养皿（35/10 mm），其中含有5 ml冰浴无菌1×PBS。用5 ml冰浴无菌1×PBS洗涤骨骼两次。
3. 将骨骼转移至含有5 ml冰浴无菌1×PBS的无菌研钵中。
4. 用无菌剪刀在关节处分离胫骨与股骨，然后用研杵在含有5 ml冰浴无菌1×PBS的无菌研钵中轻轻研碎骨骼。
5. 收集上清液至冰浴的15 ml离心管中。重复此步骤3次。
6. 通过70 μm尼龙细胞滤网过滤，以去除固体碎片。将滤液在4 °C下以450 × g离心10分钟。
7. 小心弃去上清液。将沉淀物重悬于10 ml红细胞裂解缓冲液中，裂解30秒，然后加入20 ml冰浴的完全DMEM培养基。

注意：此步骤的目的是去除污染的红细胞；因此，必须在2分钟内完成，以避免红细胞裂解缓冲液对造血细胞造成改变。

8. 在 4 °C 条件下，以 450 × g 离心 10 分钟。轻轻弃去上清液。将沉淀重悬于 20 ml 预热至 37 °C 的完全 DMEM 培养基中。
9. 将解离后的细胞转移至 2 个培养皿（100/20 mm）中。在 37 °C 条件下孵育 4 小时。
10. 在室温下将上清液收集至 50 ml 离心管中。弃去含有常驻巨噬细胞的培养皿。

注意：此步骤的目的是利用培养处理过的塑料表面黏附的特性，去除定居的骨髓巨噬细胞。这些定居的巨噬细胞可用于其他实验。

11. 将收集的上清液在 4 °C 条件下以 450 × g 离心 10 分钟，弃去上清液。
12. 用 10 ml 含 15% L929 细胞上清液的完全 DMEM 培养基轻柔重悬沉淀。通过 40 μm 尼龙细胞筛过滤细胞。
13. 收集滤液。将收集的滤液（10 ml）加入 140 ml 含 15% L929 细胞培养基的完全 DMEM 中。
14. 每皿（15 个培养皿，100/20 mm）加入 10 ml 细胞悬液。将细胞置于 37 °C、5% CO₂ 条件下培养。
15. 培养细胞 3 天
16. 加入 10 ml 含 15% L929 的完全 DMEM 培养基，继续培养细胞 4 天。

注意：定期使用倒置显微镜监测细胞生长情况（步骤 3.14–3.16）。培养 3 天后可观察到贴壁的巨噬细胞。

4. 收集BMDMs

1. 移除上清液。用完全DMEM洗涤BMDMs 2次。
2. 加入5 ml预热至37 °C的完全DMEM。用橡胶刮棒轻轻刮擦使BMDMs脱落。
3. 将BMDMs收集至50 ml离心管中，在450 × g下离心10分钟。用20 ml完全DMEM轻轻重悬细胞沉淀。
4. 在台盼蓝染色下计数BMDMs（死亡率不应超过10%）。

注意：通常情况下，从15个培养皿（100/20 mm）的巨噬细胞中可获得约6-7.5 × 10⁷个巨噬细胞。每个培养皿（100/20 mm）约含有4-5 × 10⁶个巨噬细胞。

5. 根据实验要求准备骨髓来源的巨噬细胞（BMDMs）。在37 °C、5% CO₂条件下于完全培养基中培养16小时后，巨噬细胞将再次贴附于支持物表面。

5. 储存BMDMs

1. 收集分离的BMDMs（步骤4.3）。在450 × g下离心10分钟。注意：BMDMs可用液氮冷冻保存。
2. 将细胞沉淀重悬于冻存液中，冻存液由10% DMSO和90% FCS组成，终浓度为4 × 10⁶ 个细胞/ml，用移液器将1 ml分装至每支安瓿瓶中。
3. 以1 °C/min的冷却速率冷冻细胞。24小时后，将安瓿瓶转移至液氮容器中进行长期保存。

结果

本方法旨在数日内简便地获得大量巨噬细胞。骨髓细胞制备过程如图1所示。收集小鼠后肢骨骼，于研钵中捣碎。在去除骨髓细胞悬液中原有的常驻巨噬细胞后，将骨髓细胞与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）共同孵育（第0天）。培养3天后，原本呈圆形且不贴壁的细胞开始分化为巨噬细胞并贴附于培养表面（图1A）。通过F4/80和HLA-DR标志物进行的流式细胞术分析显示，这些细胞同时表达两种标志物，证实其已成功分化为巨噬细胞（图1B）。培养7天后，每只小鼠可获得6-7.5 × 10⁷个骨髓来源巨噬细胞（BMDM），形成单层细胞。巨噬细胞可用于多种类型的实验（图2）。BMDM的功能活性可通过多种方式测定。例如，通过乳胶微球的内吞作用来监测BMDM的吞噬功能，结果显示每个细胞内微球数量随时间逐渐增加（图2A）。此外，还评估了BMDM的内吞潜能（图2B）、与细菌病原体的相互作用（图2C）以及信号转导通...

讨论

本文所述方案详细介绍了一种大量制备骨髓来源巨噬细胞（BMDM）的方法。BMDM属于原代细胞，具有由单核细胞分化而来的成熟巨噬细胞的生物学功能和特性，这一点与未成熟的巨噬细胞系细胞不同。BMDM可用于基因筛选（RNAi）、药物筛选、功能研究、宿主-病原体相互作用研究以及众多其他研究领域。

本文介绍的实验步骤非常简单，无需任何专用设备，因此可在实验室或教室中轻松进行。该方法需要一定的练习和操作技巧。此外，也可将骨髓来源的巨噬细胞（BMDMs）保存于液氮中，以便后续实验使用。

成功的BMDM培养有几个关键步骤：1）保持无菌、健康的培养环境；2）骨髓提取需高效；3）L929上清液的质量至关重要；4）避免细胞接触红细胞裂解缓冲液超过2分钟，以防止造血细胞受损。

可以对本方案进行某些修改，但存在一定的限制。1）DMEM 可以用 RPMI 1640 替代，但 BMDM 的生成效率较低；2）可以使用商用 M-CSF（500–1000 UI/mL）替代 L929 上清液，但成本较高，且在细...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM	Gibco Life Technologies	21969-035
胎牛血清	Gibco Life Technologies	10270
青霉素/链霉素	Gibco Life Technologies	15070
谷氨酰胺	Gibco Life Technologies	25030-024
PBS (10倍浓缩液)	Lonza	BEM515F
红细胞裂解缓冲液	Sigma	R7757
细胞筛网 70 μm 尼龙	BD Falcon	352350
细胞筛网 40 μm 尼龙	BD Falcon	352340
50 ml 离心管	任意供应商	n/a
15 ml 离心管	任意供应商	n/a
培养皿 (100/20 mm)	任意供应商	n/a	经培养处理
培养皿 (35/10 mm)	任意供应商	n/a