巨噬细胞长期以来被认为是先天性和适应性免疫应答的关键组成部分。近年来，关于巨噬细胞与微生物之间在进化、遗传和生化方面相互作用的知识迅速增长，使科学界对巨噬细胞重新给予了高度关注。本文介绍了一种从小鼠骨髓中分化巨噬细胞的方法。
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本文内容
摘要
摘要
巨噬细胞是先天性和适应性免疫反应的关键组成部分，由于其强大的杀菌活性，它们构成了抵御外来病原体的第一道防线。巨噬细胞广泛分布于全身，存在于淋巴器官、肝脏、肺、胃肠道、中枢神经系统、骨骼和皮肤中。由于其分布广泛，巨噬细胞参与了多种生理和病理过程。巨噬细胞是高度多能的细胞，能够识别微环境的变化，并维持组织稳态。许多病原体已进化出利用巨噬细胞作为“特洛伊木马”的机制，以在其中存活、复制，感染人类和动物，并在体内传播。近年来，人们对宿主-病原体相互作用在进化、遗传和生化层面的研究兴趣激增，使巨噬细胞再次成为科学关注的焦点。本文描述了一种从小鼠骨髓中分离和培养巨噬细胞的方法，可获得大量巨噬细胞，用于研究宿主-病原体相互作用以及其他相关过程。
引言
巨噬细胞功能的一个重要方面是其在先天免疫和适应性免疫中的作用。由于巨噬细胞具有吞噬惰性颗粒、细菌或寄生虫的能力，因此它们是抵御外来病原体的第一道防线。一旦被内化，微生物将在吞噬溶酶体中被降解。巨噬细胞还能向其他免疫细胞（如T淋巴细胞）发出招募信号并呈递抗原。巨噬细胞来源于单核细胞。单核细胞由骨髓中的髓系干细胞产生，并迁移至外周血和各种组织，在这些部位分化为巨噬细胞。据估计，一只健康的成年小鼠体内约含有108个巨噬细胞，广泛分布于全身各器官和组织中（表1）1,2。由于巨噬细胞能够适应其微环境，因而表现出高度的表型和功能多样性3,4。巨噬细胞最重要的特性是其杀菌活性，这由其吞噬并消灭微生物的能力所决定。吞噬反应由微生物接触所激活的复杂信号网络介导；因此，巨噬细胞能够根据不同的刺激适当调节基因表达。吞噬后，微生物在一种称为吞噬溶酶体的结构中被清除；然而，许多致病性微生物已进化出多种策略以逃避巨噬细胞的杀菌功能5。不同微生物物种所采用的逃逸机制多种多样，这充分说明了吞噬过程6及吞噬溶酶体形成的复杂性。感染性疾病是人类健康的主要问题之一，众多机制和分子参与了巨噬细胞的抗微生物活动。此外，微生物所劫持的杀菌作用靶点仍有许多未知；因此，人们对宿主-病原体相互作用的进化、遗传和生化机制产生了极大兴趣，使巨噬细胞重新成为科学研究的焦点。目前，该领域的大多数研究使用巨噬细胞系进行，但这些细胞系在吞噬活性、细胞....
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方案
伦理声明
动物处理方案已获得本机构动物伦理委员会的批准 "中国台湾医学与外科实验研究与培训中心科学委员会" （根据Aix-Marseille大学Eric Ghigo持有的CFREMC项目许可10-300122013，遵循Décret N的规定）° 87-848号，1987年10月19日。实验在蒂莫内医学院进行（实验许可号13.385，持有人Eric Ghigo）。
1. 材料与培养基制备
- 将两把镊子、两把剪刀、两把手术刀片、研钵和研杵进行灭菌处理。
- 准备含10%胎牛血清（FCS）、2 mM谷氨酰胺、100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的完全DMEM培养基。
- 用无菌蒸馏水稀释10倍PBS，配制成1倍PBS。
- 准备冰冻的1倍PBS、冰冻的完全DMEM以及预热至37 °C的完全DMEM。
2. L929 细胞上清液的制备
- 在完全DMEM培养基中，于37 °C、5% CO2条件下，将L929细胞培养至汇合（二十个175 cm2培养瓶）。
注意：诱导造血细胞分化为巨噬细胞需要粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-C....
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结果
本方法旨在数日内简便地获得大量巨噬细胞。小鼠后肢骨骼被取出并在研钵中捣碎，以制备骨髓细胞，如图1所示。在去除骨髓细胞悬液中的常驻巨噬细胞后，将骨髓细胞与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）共同孵育（第0天）。培养3天后，原本呈圆形且不贴壁的细胞开始分化为巨噬细胞并贴壁附着（图1A）。通过F4/80和HLA-DR标志物进行流式细胞术分析显示，这些细胞同时表达两种标志物，证实其已成功分化为巨噬细胞（图1B）。培养7天后，每只小鼠可获得6-7.5 × 107个骨髓来源巨噬细胞（BMDM），形成单层细胞。巨噬细胞可用于多种类型的实验（图2）。BMDM的功能活性可通过多种方式测定。例如，通过乳胶微球的内吞作用来监测BMDM的吞噬功能，结果显示每个细胞内微球数量随时间逐渐增加（图2A）。此外，还评估了BMDM的内吞潜能（图2B）、与细菌病原体的相互作用（图2C）以及信号转导通路（
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讨论
本文所述方案详细介绍了一种大量制备骨髓来源巨噬细胞（BMDM）的方法。BMDM属于原代细胞，具有由单核细胞分化而来的成熟巨噬细胞的生物学功能和特性，这一点与未成熟的巨噬细胞系细胞不同。BMDM可用于基因筛选（RNAi）、药物筛选、功能研究、宿主-病原体相互作用研究以及众多其他研究领域。
本文介绍的实验步骤非常简单，无需任何专用设备，因此可在实验室或教室中轻松进行。该方法需要一定的练习和操作技巧。此外，也可将骨髓来源的巨噬细胞（BMDMs）保存于液氮中，以便后续实验使用。
成功的BMDM培养有几个关键步骤：1）保持无菌、健康的培养环境；2）骨髓提取需高效；3）L929上清液的质量至关重要；4）避免细胞接触红细胞裂解缓冲液超过2分钟，以防止造血细胞受损。
可以对本方案进行某些修改，但存在一定的限制。1）DMEM 可以用 RPMI 1640 替代，但 BMDM 的生成效率较低；2）可以使用商用 M-CSF（500–1000 UI/mL）替代 L929 上清液，但成本较高，且在细.......
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披露
不存在已声明的利益冲突。
致谢
本工作由法国国家科学研究中心（CNRS，E.G. 2012-2014 年 PICS 项目）以及坎帕尼亚大区政府（Regione Campania，L.R. n.5, 2002 年 3 月 28 日，资助 Giovanna Mottola）提供的资助支持。Filippo Conti 是科学合作基金会“Infectiopole Sud”的研究员。Nicola Boucherit 是法国研究与技术部的研究员。资助方在研究设计、数据收集、数据分析、发表决定以及稿件撰写过程中均未发挥任何作用。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| DMEM | Gibco Life Technologies | 21969-035 | |
| 胎牛血清 | Gibco Life Technologies | 10270 | |
| 青霉素/链霉素 | Gibco Life Technologies | 15070 | |
| 谷氨酰胺 | Gibco Life Technologies | 25030-024 | |
| PBS (10倍浓缩液) | Lonza | BEM515F | |
| 红细胞裂解缓冲液 | Sigma | R7757 | |
| 细胞筛网 70 μm 尼龙 | BD Falcon | 352350 | |
| 细胞筛网 40 μm 尼龙 | BD Falcon | 352340 | |
| 50 ml 离心管 | 任意供应商 | n/a | |
| 15 ml 离心管 | 任意供应商 | n/a | |
| 培养皿 (100/20 mm) | 任意供应商 | n/a | 经培养处理 |
| 培养皿 (35/10 mm) | 任意供应商 | n/a |
参考文献
- Rutherford, M. S., Witsell, A., Schook, L. B. Mechanisms generating functionally heterogeneous macrophages: chaos revisited. J. Leukocyte Biol. 53, 602-618 (1993).
- Van Furth, R. Inflammation: Basic Principles and Clinical Correlates. Gallin, J. I., Goldstein, I. M., Snyderm....
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重印与许可
