骨髓衍生的巨噬细胞产

巨噬细胞功能的显著方面是其在先天免疫和适应性免疫的作用。因为它们的吞噬惰性颗粒，细菌或寄生虫的能力，巨噬细胞是抵御外来入侵者的第一道防线。一旦内化，微生物被吞噬溶酶体中降解。巨噬细胞也送招募信号和呈递抗原给其他的免疫细胞，如T淋巴细胞。巨噬细胞衍生自单核细胞。单核细胞出现在骨髓从髓样干细胞和迁移到外周血和各种组织中，其中它们分化成巨噬细胞。据估计，一个健康的成年小鼠包含分布在整个身体中各种器官和组织（ 表^1）1,2，大约10 ⁸巨噬细胞。因为他们来适应自己的微环境^3,4能力的巨噬细胞显示大表型和功能的多样性。最重要的macrop哈格财产是他们的抗菌活性，这是由它们的能力定义吞噬微生物并摧毁他们。吞噬反应是由是由​​微生物接触刺激复杂信号网络的激活所定义，因此，巨噬细胞响应各种刺激适当地调节基因表达。吞噬后，微生物在一个叫做吞噬溶酶体结构消除了，但是，许多病原微生物开发战略，颠覆巨噬细胞⁵的杀菌功能。由不同的微生物物种所利用的颠覆机制的多样性是证明了吞噬⁶过程的复杂性和吞噬溶酶体的生物合成。传染病是人类主要的健康问题，以及众多的机制和分子参与巨噬细胞的抗菌活性。此外，是由微生物劫持的杀菌性能的目标依然是未知，因此，有一个电子xplosion中的宿主 - 病原体相互作用的进化，遗传和生化方面已经就续约巨噬细胞科学的关注兴趣。目前，大部分的研究领域是做对巨噬细胞的细胞系，其中从初级巨噬细胞的吞噬活性，细胞因子产生和氧化爆发的调控有所不同。此外，它们更适合于显微镜。为了研究巨噬细胞的相互作用，其病原体是推荐使用初级巨噬细胞，如骨髓源性巨噬细胞（BMDMs），它表现出多种生理功能。此外，它可以工作在转基因BMDMs，因为这些巨噬细胞可能直接从转基因小鼠中分离出来，并与新颖的技术，如慢病毒转染的可用性，它们的基因表达图谱可以通过基因过表达或RNA干扰而改变。在这里，我们描述了一个程序来区分小鼠骨髓米箭头为巨噬细胞，将提供大量的巨噬细胞在7天为各种功能分析，如⁷蛋白质组学，转录^8，细胞内运输研究^9，动态研究^10，遗传筛选（RNAi）技术和药物筛选^11。

操守准则

该协议为动物处理批准了我们的机构动物伦理委员会"行政法院科学研究都中心去形成等德RECHERCHE实验医学 - Chirurgical"（CFREMC，项目许可证10-300122013埃里克GHIGO）从埃克斯 - 马赛大学符合规则的DécretN°的1987年10月19日87-848。该实验是在Faculté德MEDECI​​NE德拉蒂莫（实验许可证号13.385埃里克GHIGO）执行。

1。物质与文化媒体准备

1. 消毒2钳子，剪刀2，2手术刀，用研钵和研杵。
2. 得到含有10％胎牛血清（FCS），2mM谷氨酰胺，100 U / ml青霉素和100微克/毫升链霉素的完全DMEM。
3. 稀释10倍的PBS在无菌馏水中得到的1X PBS。
4. 获得冰冷的1X PBS，冰冷的完全DMEM，完全DMEM娃RMED至37°C。

2。的L929细胞上清液的制备

1. 成长L929细胞，在37℃至汇合（20175厘米²烧瓶）在完全DMEM，5％的CO _2。

注意:粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）来诱导造血细胞分化成巨噬细胞^12。 L929细胞产生GM-CSF。

2. 在汇合，用新鲜完全DMEM更换培养基。瓶转移至_{32℃，5％CO2} 10天。
3. 收集，游泳池和离心的上清液在750×g离心10分钟。丢弃细胞沉淀。
4. 在15ml试管和储存在-20°C店上清液

3。骨髓衍生的巨噬细胞（BMDM）准备

1. 牺牲1小鼠颈椎脱臼。
   1. 用无菌手术刀在整个实验。消毒用70％的资产负债管理委员会的皮肤HOL。做一个切口在每个后腿的顶部和拉扯皮肤向下朝向脚露出肌肉。
   2. 切断后腿，取出用无菌剪刀和无菌镊子皮肤。内含有无菌的，冰冷的1×PBS（5ml）中的无菌培养皿中（35 / 10mm）的放置的腿。
   3. 除去果肉及肌肉都秉承了骨头，用无菌剪刀和镊子。
2. 转移到骨头含有冰冷无菌的1×PBS（5ml）的一个新的无菌培养皿中（35/10毫米）。用5毫升冰冷的无菌1×PBS中洗骨头2倍。
3. 转移到骨含有5毫升冰冷的无菌的1×PBS的无菌研钵。
4. 从股骨切开胫骨处用无菌剪刀关节。在含有5毫升冰冷的无菌1×PBS中利用杵无菌研钵轻轻粉碎骨头。
5. 收集在冰冷的15ml试管上清液。重复此步骤3次。
6. 通过70微米尼龙细胞过滤STRA核研所，除去固体碎片。离心滤液在450×g离心10分钟，在4℃下
7. 轻轻弃上清。分离沉淀在10ml红细胞裂解缓冲液，持续30秒。加20毫升的冰冷，完全DMEM。

注意:该步骤的目的是为了除去污染的红细胞，因此，该步骤必须在2分钟内进行，以避免造血细胞改变的红细胞裂解缓冲液。

8. 离心机在450×g离心10分钟，在4℃下轻轻弃上清。分离的沉淀物在20ml完全DMEM，已加热到37℃。
9. 转移分离的细胞分成2培养皿（100/20毫米）。在37°C孵育他们4小时
10. 收集上清液在50ml试管在室温下。丢弃包含居民的巨噬细胞的菜肴。

注意:该步骤的目的是为了消除驻地骨MARRO瓦特巨噬细胞由他们坚持培养处理的塑料的能力。这些常驻的巨噬细胞可在其它实验中使用。

11. 离心收集上清液，在450×g离心10分钟，在4℃下弃上清。
12. 轻轻分离沉淀在10毫升含有15％的L929细胞上清液完全DMEM。通过一个40微米的尼龙细胞滤网过滤细胞。
13. 回收滤液。添加所收集的滤液（10毫升）中，以140毫升已补充了15％的L929细胞培养基完全DMEM。
14. 分发10毫升每培养皿（15培养皿中，100/20毫米）的细胞悬浮液。孵育的细胞在37℃，5％CO _2。
15. 生长细胞3天
16. 加入10 mL已补充了15％的L929完全DMEM。孵育细胞4额外的天数。

注:定期监测细胞的生长与倒置显微镜（步骤3.14-3.16）。贴壁的巨噬细胞会后培养3天观察到。

4。收获BMDMs

1. 除去上清液。用完全DMEM洗BMDMs 2倍
2. 加入5 ml已被加热到37℃。完全DMEM通过用橡皮警察轻轻一刮分离BMDMs。
3. 在450×g离心10分钟收集BMDMs在50ml试管并离心。轻轻地解离的细胞沉淀在20ml完全DMEM。
4. 计数BMDMs在台盼蓝的存在（不超过10％的死亡率，应观察到的）。

注:一般情况下，约6-7.5×10 ⁷巨噬细胞巨噬细胞的15培养皿（100/20毫米）获得。大约有4-5×10 ⁶的巨噬细胞/培养皿（100/20毫米）。

5. 按要求准备实验BMDMs。 16小时在完全培养基中，在37℃后，5％CO _2，巨噬细胞会再次附着到载体上。

5。存储BMDMs

1. 收集分离BMDMs（步骤4.3）。离心机在450×g离心10分钟。注意:BMDMs可以在液氮中冷冻。
2. 重悬细胞沉淀在冷冻培养基由10％DMSO和90％FCS中的4×10 ⁶个细胞/ ml和吸管1毫升到每个安瓿的最终浓度。
3. 冷冻的细胞以1℃/ min的冷却速率。 24小时后，将安瓿转移到长期存储液氮容器。

该方法的目的是为了容易地得到大量的巨噬细胞中几天。骨髓细胞的制备示于图1。从后腿骨头收集砸在研钵。一旦定居巨噬细胞是从骨髓细胞去除制剂，骨髓细胞与GM-CSF（第0天）。 3天后，细胞，它呈圆形和非贴壁培养前，开始分化成巨噬细胞和坚持（ 图1A）。流式细胞术分析使用F4/80和HLA-DR的标记显示，细胞表达两种标记从而证明它们分化 ​​成巨噬细胞（ 图1B）。 7天后，用6-7.5×10 7 BMDM /鼠标获得BMDM单层。巨噬细胞可在不同类型的实验（ 图2）可以使用。该BMDMs的功能活动可能以不同的方式来确定。例如，BMDM phagocytos就是由乳胶珠内化监控。每个细胞珠的数量随时间增加（ 图2A）。 BMDM内吞潜力（ 图2B），细菌性病原体相互作用（ 图2C）和信号转导通路（ 图2D）也进行了评估。

表1。巨噬细胞来源的组织和体液。

图1。 BMDM生产的示意图。（a）本图显示的步骤BMDM分化的祖细胞分化（0天），以成熟的巨噬细胞（第7天）。 （ 二）流式细胞仪分析显示分离出的细胞在第7天用巨噬细胞标记物HLA-DR和F4/80的纯洁性。 点击这里查看大R图。

图2。实验是可能的BMDMs实例 （ 一 ）吞噬试验。 BMDMs孵育与乳胶珠不同的时间段，并且珠摄取观察用显微镜。 （二）细胞内贝氏柯克斯体脂多糖（LPS）本地化BMDMs。脂多糖（红色）定位于该窝藏溶酶体相关膜蛋白-1（LAMP-1）的隔室（蓝色），但不组织蛋白酶D（绿色）。该实验表明，内毒素是存在于晚期内涵体是无法融合与溶酶体。 （ 三）感染Tropheryma whipplei（红色）BMDMs未在隔间怀有组织蛋白酶D本地化（绿色）。 （四）代表immunob很多展示总（t）和磷酸化（P）p38α的MAP激酶水平在大肠杆菌 LPS刺激BMDMs（1微克/毫升）。标尺代表5微米。

有没有申报利益冲突。