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方法文章

鉴定蛋白质-蛋白质相互作用 果蝇 通过串联亲和纯化（TAP）法纯化成年果蝇头部蛋白复合物

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DOI：

10.3791/50968

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2013年12月5日

 ,  ,  , 
1Neuroscience Center of Excellence, Louisiana State University Health Sciences Center

本文内容

摘要

Drosophila 因其强大的遗传操作能力而闻名，但并不以适合深入的生化分析著称。本文介绍一种基于TAP的方法，用于从果蝇大脑中鉴定任何目标蛋白的相互作用伙伴。该方法有望为研究开辟新的途径。

摘要

使用遗传筛选进行 黑腹果蝇 （果蝇）在推动生物科学进步方面已促成多项里程碑式发现。然而，旨在扩展遗传学分析所获知识的生化筛选方法，直到最近才被探索。本文描述了一种从成年果蝇头部纯化与任意目标蛋白相互作用的蛋白复合物的方法。该方法利用了 果蝇 利用GAL4/UAS系统在果蝇神经元中表达与串联亲和纯化（TAP）标签融合的诱饵蛋白 体内，然后采用类似于最初在酵母中建立的TAP方法进行两轮纯化1 用于纯化相互作用的蛋白质复合物。该流程结束后，可获得包含多种蛋白质复合物的混合物，其分子组成可通过质谱分析确定。候选蛋白质的验证将受益于果蝇中基因功能缺失研究的资源丰富性和操作便利性。类似的方法也可应用于其他果蝇组织。我们相信，在果蝇模型系统中结合遗传操作与蛋白质组学方法，将在神经生物学领域及其他基础科学问题的研究中展现出巨大潜力。

引言

定义介导特定生物学过程的分子通路或分子网络是生物医学研究的最终目标之一。果蝇遗传学家长期以来主要依赖正向遗传学方法，尤其是修饰基因筛选（包括增强子和抑制子筛选），来鉴定与目标基因协同作用、平行作用或位于其上下游的因子。然而，正向遗传学筛选往往难以鉴定出必需基因——这些基因发生突变时会导致早期发育阶段致死；也难以发现具有功能冗余和补偿机制的基因——其功能缺失仅引起细微表型，难以被准确识别。克服这一难题的一种策略是筛选蛋白质间的直接相互作用。十余年来，一系列生物化学方法不断发展，包括酵母双杂交、噬菌体展示、化学交联、免疫共沉淀（Co-IP）、串联亲和纯化（TAP）， 等等. 已用于研究蛋白质-蛋白质相互作用。这些方法在灵敏度和特异性方面各有其优势与局限性。  其中，TAP 方法能够在接近生理条件下检测物理相互作用，  保持特异性和一致性2 并具备扩展至高通量分析的能力3,4.

TAP 方法最初由 Rigaut 及其同事在酵母中开发1。该方法中，目标蛋白与 TAP 标签融合表达。TAP 标签包含两个独立的亲和结合结构域：一个可结合 IgG 的蛋白 A 结构域和一个钙调蛋白结合结构域。这两个结构域之间由烟草蚀刻病毒（TEV）蛋白酶切割位点分隔。这种组合可实现两轮独立的亲和纯化，从而充分减少非特异性结合并富集特异性结合蛋白1。因此，TAP 方法是一种非常强大的用于鉴定特定蛋白在体（in vivo）相互作用的技术，尽管外源蛋白的过表达可能导致其与正常情况下不形成复合物的蛋白发生结合。自该方法建立以来，已广泛应用于多种其他系统，包括基于细胞培养的系统5,6以及其他在体（in vivo）模型系统6–9。本文中，我们描述了 TAP 方法在果蝇（Drosophila）中的应用。我们首先构建了 pUAST-NTAP 和 pUAST-CTAP 载体，以便将 TAP 标签与目标基因的 N 端或 C 端融合克隆。随后，在神经元特异性 GAL4 驱动子10的控制下，于神经系统中表达 UAS-TAP 标签的转基因。接下来，收集大量成年果蝇头部，这些组织富含神经细胞，且在冷冻后可根据大小差异方便地与其他身体部分分离。将成年果蝇头部进行匀浆，并通过连续离心澄清，所得上清液用于下述 TAP 纯化流程。

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方案

1. 构建UAS-TAP标签转基因果蝇

  1. 构建pUAST-TAP标签DNA载体。
    1. 根据诱饵蛋白的结构/功能，确定TAP标签应融合至该蛋白的N端或C端。详见讨论部分。
    2. 将目的基因的cDNA编码区亚克隆至pUAST-NTAP或pUAST-CTAP载体的多克隆位点（MCS），分别构建N端或C端标签的UAS-TAP转基因。参见 图1 以获取详细图谱以及可用的限制性酶切位点和阅读框。
  2. 生成UAS-TAP标签转基因果蝇。
    1. 采用P元件介导插入法，按照标准方案制备转基因果蝇11目前有多种注射服务可供商业选择。
    2. 交叉神经元GAL4驱动器（即 BG380-GAL4）与每个独立的转基因品系杂交，并通过蛋白质印迹法（使用过氧化物酶抗过氧化物酶抗体）和/或免疫染色（使用抗TAP抗体）确定各品系的蛋白表达水平。通常建议选择蛋白表达水平接近内源性蛋白的转基因品系  TAP 实验步骤。详见讨论部分。
    3. 利用基因的失活突变体进行基于GAL4/UAS系统的拯救实验，以验证TAP标签转基因的功能性。选择能够显著挽救突变体表型的转基因用于后续TAP实验。

2. 准备TAP实验步骤所需的样品

  1. 构建一个同时携带神经元GAL4驱动器的果蝇品系（例如 BG380-Gal4）以及选定的TAP标签转基因，以方便果蝇样本的扩增。当上述组合导致存活或生长劣势时，极少情况下需收集GAL4驱动系与UAS-转基因杂交产生的F1代子代。
  2. 收集小规模样品，并优化裂解条件以溶解TAP标签蛋白。
    1. 使用非离子型去污剂 NP-40（0.1–1%）、NaDOC（0.1–1%）和 Triton X-100（0.05–0.5%）组合配制一系列裂解缓冲液。参见 表1 如需更多信息，请参见讨论部分。
    2. 在CO2垫上，使用5号镊子从表达TAP转基因的果蝇中解剖20个成年头部，并收集至1.5 ml离心管中，用于测试每种裂解缓冲液条件。
    3. 向离心管中加入100 μl检测裂解缓冲液，用塑料研磨棒上下抽动研磨头部组织，然后加入另外100 μl检测缓冲液。
    4. 在 4 °C 条件下以 21,500 x g 离心 10 分钟，离心后分离上清液和沉淀。加入 25 μl 2x SDS上样缓冲液至沉淀中，再加入10 μl 4x 分别向30 μl上清液中加入SDS上样缓冲液。
    5. 将两个样品煮沸5分钟，然后使用SDS-PAGE及随后的PAP抗体Western Blot进行并列分析。通过上清液中TAP-蛋白水平与沉淀中TAP-蛋白水平的比值来确定溶解度 沉淀物。
  3. 大规模制备样品
    1. 扩增并收集成年果蝇。
      1. 扩增神经元-GAL4/UAS-TAP-转基因品系，在培养瓶中培养，并每3天换瓶一次，直至累计使用250瓶用于收集。
      2. 将羽化后1-3天的成年果蝇收集至50 ml锥形管中，立即将管子放入液氮中以深度冷冻果蝇。  将果蝇存放在 -80 °C 超低温冰箱中。注意果蝇的体积不得超过 50 ml 离心管容量的 2/3。
    2. 在粉状干冰上收集果蝇头部（此步骤需在粉状干冰上进行）。
      1. 从-80 °C超低温冰箱中取出预冷的筛子和研钵研杵，置于干冰上，最好放在一个大的冰桶内。叠放两个美国标准试验筛，上层为25号筛，下层为40号筛。
      2. 将冻存的果蝇取出，放入液氮中，保持约10分钟。  剧烈振荡或摇动试管，使头部、腿部和翅膀从身体上分离。
      3. 将混合物倒入上层筛子中，然后双手握住两个筛子并用力振荡。筛分后，虫体会留在上层筛子上，果蝇头部将被截留在下层筛子上，而足、翅及其他碎屑则落入干冰中。分开两个筛子，小心地将果蝇头部转移至预冷的研钵中。
    3. 匀浆果蝇头部
      1. 在干冰上用研钵和研杵将头部组织研磨成粉末状，然后将粉末转移至预冷的15 ml玻璃Dounce组织研磨器中 置于冰上。
      2. 在将头部样品倒入研磨器前后分别称量其重量，然后计算头部样品的净重。每次TAP实验可使用6–15克果蝇头部，具体用量需根据目标蛋白的表达水平进行调整。向粉末中加入15 ml预冷的匀浆缓冲液（即2.2步骤中优化的裂解缓冲液），先用大间隙研杵上下研磨，直至研杵在研磨器内可顺畅移动。整个操作过程中须始终将玻璃研磨器置于冰上。
    4. 为TAP制备上清液
      1. 将匀浆转移至高速离心管中，在约 50,000 x g 条件下离心 20 分钟（4 °C）。将上清液转移至新的高速离心管中，再重复离心一次。
      2. 将上清液转移至超速离心管中，进行40 在约250,000 × g条件下离心，进一步澄清上清液。经超速离心后，上清液即可用于后续的串联亲和纯化步骤。

3. TAP 纯化

以下部分源自Séraphin实验室的TAP方案12（http://web.as.uky.edu/Biology/faculty/rymond/BIO%20510/Bertran%20Seraphin%27s%20TAP%20page.pdf）

  1. 进行IgG微珠亲和纯化
    1. 在样品离心的同时准备IgG Sepharose微珠。在15 ml Falcon管中用10 ml冷的IgG洗涤缓冲液洗涤400 µl IgG微珠，共洗涤3次。每次洗涤时，在摇床上轻轻振荡管子2分钟，然后在1,000 × g下离心2分钟使微珠沉淀。第三次洗涤结束后，移除上清液，仅保留管中的微珠。
    2. 小心地将澄清的上清液（约15 ml）转移至含有IgG微珠的15 ml管中。将微珠与脑组织裂解液混合物在4 ºC下于旋转仪上孵育2小时。
    3. 在冷室中设置一个洁净且空的微型层析柱，总体积约为15 ml。通过将混合物稳定地倒入柱中完成上样；注意避免在柱内截留气泡。让微珠在柱中自然沉降，并通过重力作用使缓冲液缓慢流出。
    4. 当全部脑组织裂解液流经沉降的IgG柱后，用10 ml冷的IgG洗涤缓冲液彻底洗涤柱子，重复洗涤2次。注意：切勿让微珠暴露于空气中干燥。
  2. 进行TEV酶切
    1. 第三次洗涤后，再用10 ml TEV酶切缓冲液洗涤柱子一次。此步骤用于将捕获了目标复合物的IgG微珠准备至适合TEV酶切的条件。
    2. 当最后一滴TEV缓冲液即将滴出时，立即在柱子底部加盖以阻断流出，向柱中加入含130单位TEV酶的1.3 ml TEV缓冲液，然后严密封闭柱子顶部。确保柱子两端均密封良好。
    3. 将柱子在18 ºC下旋转孵育2小时，使TEV酶在TEV识别位点处切割肽段，释放出蛋白复合物，同时使与IgG Sepharose微珠结合的蛋白A结构域肽段保留在柱上。
  3. 进行钙调蛋白（Calmodulin）微珠亲和纯化
    1. 在IgG微珠与TEV酶孵育的同时准备钙调蛋白微珠。在15 ml Falcon管中用10 ml冷的钙调蛋白结合缓冲液洗涤200 μl钙调蛋白微珠，共洗涤3次。每次洗涤时，在摇床上轻轻振荡2分钟，然后在1,000 × g下离心2分钟使微珠沉淀。第三次洗涤结束后，吸除全部缓冲液，仅保留管中的微珠。
    2. TEV酶切孵育结束后（步骤3.2.3），将IgG柱放回冷室并垂直放置，静置10分钟使微珠沉降。
    3. 移除柱子顶部和底部的盖子，收集1.3 ml TEV酶切产物至一个15 ml Falcon管中，待缓冲液完全流出。再向柱中加入200 µl TEV缓冲液以冲洗柱内死体积，将流出液收集至同一管中。
    4. 向上述收集的1.5 ml TEV酶切产物中加入4.5 ml钙调蛋白结合缓冲液和4.5 µl 1 M CaCl2。CaCl2的作用是中和TEV缓冲液中的EDTA。将6 ml混合液转移至含有钙调蛋白微珠的管中，在4 ºC下于旋转仪上旋转孵育1小时。
    5. 在冷室中设置另一个洁净且空的微型层析柱，总体积约为10 ml。将钙调蛋白微珠混合物上样至柱中，让其依靠重力自然流出。
    6. 当全部溶液流经沉降的钙调蛋白柱后，用10 ml冷的钙调蛋白结合缓冲液洗涤柱子两次。注意：避免扰动钙调蛋白微珠，洗涤过程中尽量保持微珠表面平整。
  4. 从钙调蛋白柱中洗脱目标复合物。
    洗涤完成后立即使用五份200 µl冷的钙调蛋白洗脱缓冲液对钙调蛋白柱进行洗脱。每份洗脱液，轻轻加入200 µl至柱中，并用标记好的1.5 ml Eppendorf管收集洗脱液。重复此操作4次。
  5. 通过SDS-PAGE分析蛋白复合物
    1. 从五个洗脱组分中各取少量等分试样（约30 µl），加入SDS上样缓冲液。将样品煮沸5分钟，随后在梯度（4–15%）SDS-PAGE凝胶中与蛋白质分子量标准品并排上样电泳。
    2. 待样品在凝胶中完全分离后，停止电泳，并使用基于G-250的高灵敏度胶体考马斯亮蓝染色方法（如“蓝银染色”）对凝胶进行染色13。银染可选但不推荐，因其与后续质谱分析不完全兼容。  将剩余洗脱液保存于-80 °C冰箱中，用于进一步分析，例如通过质谱鉴定纯化蛋白复合物的分子组成。参见讨论部分。

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结果

在此，我们展示了在果蝇大脑中鉴定与Highwire相互作用蛋白的研究工作。Highwire（Hiw）及其在脊椎动物和无脊椎动物中的同源蛋白均为大型泛素连接酶，可调控神经系统的发育与修复14它们共享多个高度保守的功能结构域，但其分子作用机制尚不完全明确。在蠕虫、果蝇和小鼠中开展的研究建立了目前的工作模型，即Hiw作为一种E3泛素连接酶和支架蛋白发挥作用，通过与不同的辅助因子相互作用并靶向不同的泛素底物，促进多亚基泛素化复合物的形成，从而调控具有时间和细胞类型特异性的神经元功能。为了鉴定与Hiw相关的泛素化复合物，我们首先构建了一个N端标记的UAS-TAP-Hiw转基因，该转基因在挽救突变表型方面完全具备功能 hiw 突变表型15约10克仅表达TAP或表达TAP-Hiw转基因蛋白的成年果蝇头部被收集，并平行进行上述TAP操作。两次纯化所得的最终洗脱液经SDS-PAGE分离后进行银染分析。质谱鉴定出仅在TAP-Hiw样本中存在的一组蛋白，包括 果蝇 FSN（DFsn，一种F-box蛋白）和Rae1（图2）。随后的遗传学和生化分析表...

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讨论

串联亲和纯化（TAP）方法提供了一种双重纯化流程，可通过两个独立的亲和纯化步骤实现蛋白质复合物的分离与富集。TAP标签的设计并不局限于本方案中所展示的形式，只要相应调整缓冲条件，其他蛋白质结合结构域和基序也可适用。其他TAP标签的一个良好示例是GS-TAP标签，该标签由G蛋白和链霉亲和素结合基序组合而成，由Giulio Superti-Furga研究团队设计，旨在从培养的哺乳动物细胞系中纯化蛋白质复合物18. GS-TAP 随后被改进用于研究蛋白质-蛋白质相互作用 黑腹果蝇 S2 细胞和胚胎19. Bailey最近在JoVE上发表的一篇文章 等 展示了如何使用细胞培养裂解液进行GS-TAP实验步骤20在此，我们介绍了TAP标签的应用 果蝇 用于大规模蛋白质组筛选的神经组织（成年果蝇头部）。该方案可潜在适用于其他允许大规模样本收集的组织，例如胚胎。在步骤2.3.2.3中收集于上层筛网的成年虫体也可用于TAP实验，但可能具有较大挑战性。必须修改并优化裂解缓冲液，以最大程度抑制消化道中大量存在的蛋白酶，同时显著缩短...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢EUROSARF向我们提供了酵母TAP表达质粒。同时感谢Ryan Labadens在编辑方面提供的帮助。本工作获得了美国国立卫生研究院神经疾病与中风研究所资助（R01NS070962）的支持，资助对象为C.W.。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
美国标准试验筛 No. 25Fisher Scientific04-881-18
美国标准试验筛 No. 40Fisher Scientific04-881-21
 Kontes Dounce 组织研磨器 15 mlKimble Chase885300-0015
IgG sepharose 微珠Pharmacia17-0969-01
Econo-column 0.7 cm x 20 cmBio-Rad737-4721
Econo-column 0.5 cm x 15 cmBio-Rad737-4716
钙调蛋白微珠Stratagene214303
Coors 研钵和研杵CoorsTek60311
AcTEV 蛋白酶Invitrogen12575-015
蛋白酶抑制剂混合液Roche11836153001
蛋白酶抑制剂混合物SigmaP8340

参考文献

  1. Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nat. Biotechnol. 17, 1030-1032 (1999).
  2. Collins, S. R., et al. Toward a comprehensive atlas of the physical interactome of Saccharomyces cerevisiae. Mol. Cell. Proteomics. 6, 439-450 (1074).
  3. Gavin, A. C., et al. Proteome survey reveals modularity of the yeast cell machinery. Nature. 440, 631-636 (2006).
  4. Krogan, N. J., et al. Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 440, 637-643 (2006).
  5. Forler, D., et al. An efficient protein complex purification method for functional proteomics in higher eukaryotes. Nat. Biotechnol. 21, 89-92 (2003).
  6. Veraksa, A., Bauer, A., Artavanis-Tsakonas, S. Analyzing protein complexes in Drosophila with tandem affinity purification-mass spectrometry. Dev. Dyn. 232, 827-834 (2005).
  7. Li, Y. The tandem affinity purification technology: an overview. Biotechnol. Lett. 33, 1487-1499 (2011).
  8. Volkel, P., Le Faou, P., Angrand, P. O. Interaction proteomics: characterization of protein complexes using tandem affinity purification-mass spectrometry. Biochem. Soc. Trans. 38, 883-887 (2010).
  9. Xu, X., et al. The tandem affinity purification method: an efficient system for protein complex purification and protein interaction identification. Protein Expr. Purif. 72, 149-156 (2010).
  10. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
  11. Bachmann, A., Knust, E. The use of P-element transposons to generate transgenic flies. Methods Mol. Biol. 420, 61-77 (2008).
  12. Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24, 218-229 (2001).
  13. Candiano, G., et al. Blue silver: a very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis. Electrophoresis. 25, 1327-1333 (2004).
  14. Tian, X., Wu, C. The role of ubiquitin-mediated pathways in regulating synaptic development, axonal degeneration and regeneration: insights from fly and worm. J. Physiol. , (2013).
  15. Wu, C., Wairkar, Y. P., Collins, C. A., DiAntonio, A. Highwire function at the Drosophila neuromuscular junction: spatial, structural, and temporal requirements. J. Neurosci. 25, 9557-9566 (2005).
  16. Wu, C., Daniels, R. W., DiAntonio, A. DFsn collaborates with Highwire to down-regulate the Wallenda/DLK kinase and restrain synaptic terminal growth. Neural Dev. 2, 16(2007).
  17. Tian, X., Li, J., Valakh, V., DiAntonio, A., Wu, C. Drosophila Rae1 controls the abundance of the ubiquitin ligase Highwire in post-mitotic neurons. Nat. Neurosci. 14, 1267-1275 (2011).
  18. Burckstummer, T., et al. An efficient tandem affinity purification procedure for interaction proteomics in mammalian cells. Nat. Methods. 3, 1013-1019 (2006).
  19. Kyriakakis, P., Tipping, M., Abed, L., Veraksa, A. Tandem affinity purification in Drosophila: the advantages of the GS-TAP system. Fly. 2, 229-235 (2008).
  20. Bailey, D., Urena, L., Thorne, L., Goodfellow, I. Identification of protein interacting partners using tandem affinity purification. J. Vis. Exp. (60), e3643(2012).
  21. Wu, Y., et al. A Drosophila model for Angelman syndrome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 12399-12404 (2008).
  22. Liao, L., McClatchy, D. B., Yates, J. R. Shotgun proteomics in neuroscience. Neuron. 63, 12-26 (2009).

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GAL4/UAS 系统免疫球蛋白 G 纯化TEV 切割钙调蛋白纯化质谱分析果蝇头部裂解液超速离心
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