Drosophila 因其强大的遗传操作能力而闻名，但并不以适合深入的生化分析著称。本文介绍一种基于TAP的方法，用于从果蝇大脑中鉴定任何目标蛋白的相互作用伙伴。该方法有望为研究开辟新的途径。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
使用遗传筛选进行 黑腹果蝇 （果蝇）在推动生物科学进步方面已促成多项里程碑式发现。然而，旨在扩展遗传学分析所获知识的生化筛选方法，直到最近才被探索。本文描述了一种从成年果蝇头部纯化与任意目标蛋白相互作用的蛋白复合物的方法。该方法利用了 果蝇 利用GAL4/UAS系统在果蝇神经元中表达与串联亲和纯化（TAP）标签融合的诱饵蛋白 体内，然后采用类似于最初在酵母中建立的TAP方法进行两轮纯化1 用于纯化相互作用的蛋白质复合物。该流程结束后，可获得包含多种蛋白质复合物的混合物，其分子组成可通过质谱分析确定。候选蛋白质的验证将受益于果蝇中基因功能缺失研究的资源丰富性和操作便利性。类似的方法也可应用于其他果蝇组织。我们相信，在果蝇模型系统中结合遗传操作与蛋白质组学方法，将在神经生物学领域及其他基础科学问题的研究中展现出巨大潜力。
引言
定义介导特定生物学过程的分子通路或分子网络是生物医学研究的最终目标之一。果蝇遗传学家长期以来主要依赖正向遗传学方法，尤其是修饰基因筛选（包括增强子和抑制子筛选），来鉴定与目标基因协同作用、平行作用或位于其上下游的因子。然而，正向遗传学筛选往往难以鉴定出必需基因——这些基因发生突变时会导致早期发育阶段致死；也难以发现具有功能冗余和补偿机制的基因——其功能缺失仅引起细微表型，难以被准确识别。克服这一难题的一种策略是筛选蛋白质间的直接相互作用。十余年来，一系列生物化学方法不断发展，包括酵母双杂交、噬菌体展示、化学交联、免疫共沉淀（Co-IP）、串联亲和纯化（TAP）， 等等. 已用于研究蛋白质-蛋白质相互作用。这些方法在灵敏度和特异性方面各有其优势与局限性。 其中，TAP 方法能够在接近生理条件下检测物理相互作用， 保持特异性和一致性2 并具备扩展至高通量分析的能力3,4.
TAP 方法最初由 Rigaut 及其同事在酵母中开发1。该方法中，目标蛋白与 TAP 标签融合表达。TAP 标签包含两个独立的亲和结合结构域：一个可结合 IgG 的蛋白 A 结构域和一个钙调蛋白结合结构域。这两个结构域之间由烟草蚀刻病毒（TEV）蛋白酶切割位点分隔。这种组合可实现两轮独立的亲和纯化，从而充分减少非特异性结合并富集特异性结合蛋白1。因此，TAP 方....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
1. 构建UAS-TAP标签转基因果蝇
- 构建pUAST-TAP标签DNA载体。
- 根据诱饵蛋白的结构/功能，确定TAP标签应融合至该蛋白的N端或C端。详见讨论部分。
- 将目的基因的cDNA编码区亚克隆至pUAST-NTAP或pUAST-CTAP载体的多克隆位点（MCS），分别构建N端或C端标签的UAS-TAP转基因。参见 图1 以获取详细图谱以及可用的限制性酶切位点和阅读框。
- 生成UAS-TAP标签转基因果蝇。
- 采用P元件介导插入法，按照标准方案制备转基因果蝇11目前有多种注射服务可供商业选择。
- 交叉神经元GAL4驱动器（即 BG380-GAL4）与每个独立的转基因品系杂交，并通过蛋白质印迹法（使用过氧化物酶抗过氧化物酶抗体）和/或免疫染色（使用抗TAP抗体）确定各品系的蛋白表达水平。通常建议选择蛋白表达水平接近内源性蛋白的转基因品系 TAP 实验步骤。详见讨论部分。
- 利用基因的失活突变体进行基于GAL4/UAS系统的拯救实验，以验证TAP标签转基因的功能性。选择能够显著挽救突变体表型的转基因用于后续TAP实验。
2. 准备TAP实验步骤所需的样品
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
在此，我们展示了在果蝇大脑中鉴定与Highwire相互作用蛋白的研究工作。Highwire（Hiw）及其在脊椎动物和无脊椎动物中的同源蛋白均为大型泛素连接酶，可调控神经系统的发育与修复14它们共享多个高度保守的功能结构域，但其分子作用机制尚不完全明确。在蠕虫、果蝇和小鼠中开展的研究建立了目前的工作模型，即Hiw作为一种E3泛素连接酶和支架蛋白发挥作用，通过与不同的辅助因子相互作用并靶向不同的泛素底物，促进多亚基泛素化复合物的形成，从而调控具有时间和细胞类型特异性的神经元功能。为了鉴定与Hiw相关的泛素化复合物，我们首先构建了一个N端标记的UAS-TAP-Hiw转基因，该转基因在挽救突变表型方面完全具备功能 hiw 突变表型15约10克仅表达TAP或表达TAP-Hiw转基因蛋白的成年果蝇头部被收集，并平行进行上述TAP操作。两次纯化所得的最终洗脱液经SDS-PAGE分离后进行银染分析。质谱鉴定出仅在TAP-Hiw样本中存在的一组蛋白，包括 果蝇 FSN（DFsn，一种F-box蛋白）和Rae1（图2）。随后的遗传学和生化分析表.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
串联亲和纯化（TAP）方法提供了一种双重纯化流程，可通过两个独立的亲和纯化步骤实现蛋白质复合物的分离与富集。TAP标签的设计并不局限于本方案中所展示的形式，只要相应调整缓冲条件，其他蛋白质结合结构域和基序也可适用。其他TAP标签的一个良好示例是GS-TAP标签，该标签由G蛋白和链霉亲和素结合基序组合而成，由Giulio Superti-Furga研究团队设计，旨在从培养的哺乳动物细胞系中纯化蛋白质复合物18. GS-TAP 随后被改进用于研究蛋白质-蛋白质相互作用 黑腹果蝇 S2 细胞和胚胎19. Bailey最近在JoVE上发表的一篇文章 等 展示了如何使用细胞培养裂解液进行GS-TAP实验步骤20在此，我们介绍了TAP标签的应用 果蝇 用于大规模蛋白质组筛选的神经组织（成年果蝇头部）。该方案可潜在适用于其他允许大规模样本收集的组织，例如胚胎。在步骤2.3.2.3中收集于上层筛网的成年虫体也可用于TAP实验，但可能具有较大挑战性。必须修改并优化裂解缓冲液，以最大程度抑制消化道中大量存在的蛋白酶，同时显著缩短.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢EUROSARF向我们提供了酵母TAP表达质粒。同时感谢Ryan Labadens在编辑方面提供的帮助。本工作获得了美国国立卫生研究院神经疾病与中风研究所资助（R01NS070962）的支持，资助对象为C.W.。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 美国标准试验筛 No. 25 | Fisher Scientific | 04-881-18 | |
| 美国标准试验筛 No. 40 | Fisher Scientific | 04-881-21 | |
| Kontes Dounce 组织研磨器 15 ml | Kimble Chase | 885300-0015 | |
| IgG sepharose 微珠 | Pharmacia | 17-0969-01 | |
| Econo-column 0.7 cm x 20 cm | Bio-Rad | 737-4721 | |
| Econo-column 0.5 cm x 15 cm | Bio-Rad | 737-4716 | |
| 钙调蛋白微珠 | Stratagene | 214303 | |
| Coors 研钵和研杵 | CoorsTek | 60311 | |
| AcTEV 蛋白酶 | Invitrogen | 12575-015 | |
| 蛋白酶抑制剂混合液 | Roche | 11836153001 | |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Sigma | P8340 |
参考文献
- Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nat. Biotechnol. 17, 1030-1032 (1999).
- Collins, S. R., et al. Toward a comprehensive....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
