亚毫秒级蛋白质构象变化的光热束偏转法解析

摘要

本文报道了光热束偏转技术与笼锁型钙化合物DM-nitrophen相结合的应用，用于监测钙离子与神经元钙感受器——下游调控元件拮抗调节因子（Downstream Regulatory Element Antagonist Modulator）结合过程中伴随的微秒和毫秒级结构变化的动力学及热力学特性。

摘要

光热束偏转、光声量热法和热光栅均属于光热方法，可监测蛋白质在光诱导构象变化过程中微秒至毫秒时间尺度下的体积和焓变的时间过程，这一时间范围是传统停流仪器无法达到的。此外，由于这些技术探测的是总体积和/或焓的改变，因此可应用于缺乏荧光团或发色团标记的蛋白质及其他生物大分子。用于监测与Ca²⁺相关的结构变化的动力学和热力学过程²⁺ 结合钙信号转导分子，例如神经元钙感受器，采用笼锁型钙化合物DM-nitrophen来光触发快速（τ < 使用光热束偏转技术探测游离钙离子浓度的增加（20 μsec）以及相关的体积和焓变。

引言

光热方法（如光声量热法、光热束偏转（PDB）以及与纳秒激光激发耦合的瞬态光栅）为研究短寿命中间体的时间分辨实验提供了强有力的替代瞬态光学光谱学的手段^1,2。与瞬态吸收和红外光谱等监测发色团周围吸收变化时间过程的光学技术不同，光热技术检测的是热/体积变化的时间依赖性，因此是研究光学上“静默”过程时间特征的有力工具。迄今为止，光声量热法和瞬态光栅已成功应用于研究光诱导过程的构象动力学，包括球蛋白中双原子配体的迁移^3,4、配体与氧感应蛋白FixL的相互作用⁵、血红素-铜氧化酶⁶以及光系统II中的电子和质子传递，以及视紫红质中的光异构化⁷和隐花色素中的构象动力学⁸。

为了将光热技术的应用扩展到缺乏内源性生色团和/或荧光团的生物体系，PBD 技术被结合使用笼锁化合物，以在几微秒或更快的时间内（取决于所用的笼锁化合物）通过光触发实现配体/底物浓度的升高。该方法使得能够监测配体/底物与缺乏内源性荧光团或生色团的蛋白质结合时所伴随的结构变化的动力学和热力学过程，其时间尺度是商用停流仪器无法达到的。本文展示了利用 PBD 技术监测笼锁化合物 Ca²⁺DM-nitrophen 光解反应的热力学，以及 Ca²⁺ 与神经元钙感应蛋白下游调节元件拮抗剂调节蛋白（DREAM）C端结构域结合的动力学。Ca²⁺ 在 10 μsec 内从 Ca²⁺DM-nitrophen 中通过光照释放，并以约 300 μsec 的时间常数重新结合到未光解的笼锁分子上。另一方面，在存在 apoDREAM 的情况下，观察到一个额外的、发生在毫秒时间尺度上的动力学过程，反映了配体与蛋白质的结合。由于仪器上的困难，PBD 技术在探测生物体系构象转变方面的应用曾受到一定限制；例如，探针光束与泵浦光束难以对准，导致难以获得强而可重复的 PBD 信号。然而，通过精心设计仪器装置、精确控制温度，以及仔细对准探针光束和泵浦光束，可以获得稳定且可靠的 PBD 信号，从而在 10 µsec 至约 200 msec 的宽时间尺度上监测时间分辨的体积变化和焓变。此外，对实验流程进行改进，以确保在相同的温度、缓冲液组成、光学池取向和激光功率等条件下检测样品和参比信号， 等等，可显著降低测得的反应体积和焓值的实验误差。

方案

1. 样品制备

1. 在暗室中进行样品制备及所有样品操作，以防止发生非预期的光解反应。
2. 将DM-硝酚（(1-(2-硝基-4,5-二甲氧基苯基)-N,N,N',N'-四(羰基氧基甲基)-1,2-乙二胺)）溶于50 mM HEPES缓冲液、100 mM KCl、pH 7.0中，终浓度为400 µM（ε_350nm = 4330 M^-1cm^{-1 9}）。
3. 从0.1 M储备液中加入CaCl₂，以达到所需的[Ca²⁺]:[DM-硝酚]比例。对于Ca²⁺结合的K_d大于10 µM的蛋白质，建议采用1:1的[Ca²⁺]:[DM-硝酚]比例，以防止光解释放的Ca²⁺与去笼状态的DM-硝酚结合。实际上，考虑到DM-硝酚的K_d值为10 nM，且DM-硝酚与Ca²⁺的总浓度为400 µM时，约有90%的钙结合蛋白（K_d = 10 μM）将处于无钙状态。另一方面，在研究Ca²⁺与K_d < 10 µM的蛋白质结合时，建议将[Ca²⁺]:[DM-硝酚]比例降低至0.95，以防止在笼状物光解离之前Ca²⁺与无钙蛋白形成复合物。
4. 将参比化合物K₃[Fe(III)(CN)₆]或Na₂CrO₄溶于与样品相同的缓冲液中。

2. 实验设置

1. 基本实验装置如图所示 图2.
2. 使用针孔（P₂）调节探针光束（He-Ne 激光器的 632 nm 输出，激光功率约 5 mW）的直径至 1 mm，并使用 M 将探针光束引导通过置于温控细胞池中的细胞中心₁ 镜子
3. 使用一面镜子（M₂在样品后方调整位置，使探针光束对准位置敏感探测器的中心。
4. 将探测光束聚焦在探测器中心，使得探测器上侧两个二极管与下侧两个二极管之间的电压差，以及左侧两个二极管与右侧两个二极管之间的电压差均为零。
5. 随后，使用一个3 mm的针孔（P）对Q开关Nd:YAG激光器输出的355 nm泵浦光束（FWHM 5 nsec）进行整形以确定其直径₁) 置于两片355 nm激光反射镜之间。
6. 将泵浦光束沿比色皿中心共传播，如图所示 图2两束激光必须几乎共线地穿过光学池的中心，以获得可测量的偏转角，从而产生高幅度的PBD信号，这一点非常重要。在实验条件下，探测光束与泵浦光束的交汇角度小于 15°.
7. 使用参考化合物对探针光束和泵浦光束进行准直，以获得满意的PBD信号。 即 良好的信噪比以及在较长时间尺度（约100毫秒）下稳定的PBD振幅。
8. 通过逐步调节355 nm激光的反射镜，微调泵浦光束相对于探测光束的位置。
9. 测量位置敏感探测器上两个顶部和底部光电二极管之间的PBD参考信号幅度。PBD信号应在快速时间尺度上表现出幅度的迅速增加<10 µsec）并在100毫秒时间尺度上保持稳定，如所示 图3PDB信号幅度的逐发波动在信号幅度的5%以内，信号重复性主要受振动影响。
10. 通过测量PBD信号对激发激光功率以及对所吸收的爱因斯坦数E的线性依赖关系，检验PBD信号幅度与释放的热能之间的线性关系_a = (1-10^{- A}其中A对应于激发波长处的参考吸光度。
11. 将激光功率保持在约以下 1,000 µJ 且样品/参比化合物在激发波长处的吸光度应小于0.5，以分别防止多光子吸收和泵浦光束功率下降，并确保PBD信号的线性。

3. PBD 测量

1. 首先测量参考样品的PBD信号。将参考化合物溶液置于1.0 cm × 1.0 cm或1.0 cm × 0.5 cm的石英比色皿中，并将比色皿放入温控样品架内。两种光程长度所获得的PBD信号幅度相当。
2. 在16–35 °C的温度范围内，以3 °C为温度增量，检测参考样品的PBD信号随温度的变化。
3. 每次改变温度后，检查探测光束在位置敏感探测器上的位置，并在必要时将其重新调整至探测器中心。
4. 根据公式2，检查PBD信号相对于[(dn/dt)/C_pρ]项的线性关系。
5. 将待测样品溶液装入与参考化合物相同的光学比色皿中，并保持比色皿方向与参考测量时一致。
6. 在与参考样品相同的温度范围内检测样品的PBD信号，并验证样品PBD信号幅度相对于[(dn/dt)/C_pρ]项的线性关系。

4. 数据分析

偏转幅度与样品加热引起的体积变化（ΔV_th）以及非热体积变化（ΔV_nonth）成正比，关系如公式1所示：

样品（A_S）和参比（A_r）的光束偏转检测（PBD）信号幅度可分别用公式2和公式3描述。

PBD 信号与仪器响应参数（K）和吸收的爱因斯坦数（E_a）成正比。公式 2 中的第一项（dn/dt）(1/ρC_p)Q 对应于由于释放到溶剂中的热量引起的信号变化。其中 dn/dt 项表示折射率随温度的变化，ρ 为溶剂的密度，C_p 为比热容。这些参数在纯水中是已知的，而对于缓冲溶液，可通过比较参考化合物在纯水和适当缓冲液中的 PBD 信号来确定。Q 是返回到溶剂中的热量。ρ (dn/dρ) 项是一个无量纲常数，在 10–40 °C 温度范围内与温度无关¹⁰。Δn_abs 项对应于由于溶液中存在吸光物质所引起的折射率变化；若探测光束的波长相对于溶液中任何物质的吸收光谱发生偏移，则该值可忽略不计。由参考化合物产生的信号（A_r）由公式 3 表示，其中 E_hν 为激发波长下的光子能量，当激发波长为 355 nm 时，E_hν = 80.5 kcal/mol。

1. 将参考PBD信号的幅度取为触发前与触发后PBD信号之间的差值，如图3所示。以类似方式，确定样品PBD信号的快速相（A_s^fast）和慢速相（A_s^slow）的幅度。
2. 为消除仪器响应参数K，将样品PBD信号的幅度除以参考PBD信号的幅度进行归一化。样品信号与参考信号的比值即为公式4，可表示为：
   
   
3. 利用该公式，通过绘制[(A_s/A_r) E_hν]项与温度依赖项[(dn/dt)(1/ρCp)]的关系图，分别从其斜率和截距确定光引发反应释放到溶液中的热量（Q）以及非热体积变化（ΔV_nonth）。
4. 为确定快速过程和慢速过程的反应体积和焓变，根据公式5-7将观测到的体积变化和焓变按相应的量子产率进行归一化。
   
   
   
   
   
   
   对于动力学过程发生在10 µsec~200 msec时间尺度上的多步反应，可分别确定反应各步骤相关的体积变化和焓变。通过将数据拟合至描述体积和焓变时间分布的函数F(t)，分析各步骤的幅度和寿命。
   
   其中α₀对应A_s^fast，每个独立过程的α_i对应A_s^slow，τ_i为各反应步骤的寿命。根据各过程速率常数（k_i = 1/τ_i）的温度依赖性，可通过Eyring图简便地确定活化焓和活化熵参数。

结果

Ca²⁺DM-硝酚光解释放Ca²⁺的典型PBD轨迹示例如图3所示。快速相对应于Ca²⁺DM-硝酚的光裂解及Ca²⁺的释放，而慢速相则反映了Ca²⁺与未光解笼合物的结合。根据公式4，将样品PBD信号在快速相和慢速相的振幅相对于参考化合物振幅进行归一化，并结合温度依赖因子[C_pρ/(dn/dt)]，同时依据公式5-7将观测到的溶液中释放热量和非热体积变化归一化至DM-硝酚光解离的量子产率（Φ = 0.18）¹¹，由此获得快速相的反应焓变和体积变化值（ΔV_fast = -12±5 ml/mol 和 ΔH_fast = -50±20 kcal/mol）以及慢速相的相应值（ΔV_slow = 9±5 ml/mol 和 ΔH_slow = -23±12 kcal/mol）。Ca²⁺与神经元钙感受...

讨论

光热方法背后的物理原理是：被光激发的分子通过振动弛豫将多余能量耗散至基态，导致周围溶剂产生热加热效应^1,12。对于水等溶剂，这会产生快速的体积膨胀（ΔV_th）。处于激发态的分子还可能发生光化学过程，由于键的断裂/形成和/或分子结构的变化，导致非热体积变化（ΔV_nonth），这些变化可改变分子的分子尺寸（i.e. 范德华体积的变化），以及改变分子的电荷分布，从而引起电致收缩效应。这导致被照射区域迅速膨胀，产生折射率变化，可通过多种光学方法进行探测。光束偏转检测（PBD）利用了如下事实：由于高斯形状的激光脉冲在样品中建立了折射率梯度，当探测光束穿过样品时会发生偏转，如图2所示。

光热束偏转技术能够测定多种光引发过程的时间分辨体积变化和焓变，包括配体-血红素复合物的光解反应机理¹³、笼状化合物复合物中生物活性分子的释放¹⁴，以及荧光团三重态寿命的探测。与常用于监测生物大分子结构变化的传统技术（如瞬态吸收光谱和荧光光谱）...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1-(4,5-二甲氧基-2-硝基苯基)-1,2-二氨基乙烷-N,N,N',N'-四乙酸	Life Technologies	D-6814	DM-硝基苯，钙笼合物，储备液需避光保存以防止光解
4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸，N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-(2-乙磺酸)	Sigma Aldrich	0909C	HEPES缓冲液
铁氰化钾(III)	Sigma Aldrich	702587	PBD测量用参比化合物
铬酸钠	Sigma Aldrich	307831	PBD测量用参比化合物
氦氖激光二极管，5 mW，635 nm	Edmund Optics	54-179	用作PBD测量的探测光束
示波器	LeCroy	Wave Surfer 42Xs	400 MHz带宽
Nd:YAG激光器	Continuum	ML II	PBD测量的泵浦光束
M355；Nd:YAG激光反射镜	Edmund Optics	47-324	355 nm激光线用反射镜
M1 和 M2；激光二极管反射镜	Edmund Optics	43-532	可见光平面反射镜，波长范围300–700 nm
P1 和 P2；虹膜光阑	Edmund Optics	62-649	针孔，用于整形探测光束和泵浦光束
L1；双凸透镜	Thorlabs	LB1844	用于将探测光束聚焦至探测器的透镜，有效焦距50 mm，波长范围350–2,000 nm
DM，二向色镜	Thorlabs	DMLP505	长通二向色镜，截止波长505 nm
F1；边缘滤光片	Andower	500FH90-25	长通滤光片，截止波长500 nm
温控比色皿支架	Quantum Northwest	FLASH 300