亚毫秒级蛋白质构象变化的光热束偏转法解析

摘要

本文报道了光热束偏转技术与笼锁型钙化合物DM-nitrophen相结合的应用，用于监测钙离子与神经元钙感受器——下游调控元件拮抗调节因子（Downstream Regulatory Element Antagonist Modulator）结合过程中伴随的微秒和毫秒级结构变化的动力学及热力学特性。

摘要

光热束偏转、光声量热法和热光栅均属于光热方法，可监测蛋白质在光诱导构象变化过程中微秒至毫秒时间尺度下的体积和焓变的时间过程，这一时间范围是传统停流仪器无法达到的。此外，由于这些技术探测的是总体积和/或焓的改变，因此可应用于缺乏荧光团或发色团标记的蛋白质及其他生物大分子。用于监测与Ca²⁺相关的结构变化的动力学和热力学过程²⁺ 结合钙信号转导分子，例如神经元钙感受器，采用笼锁型钙化合物DM-nitrophen来光触发快速（τ < 使用光热束偏转技术探测游离钙离子浓度的增加（20 μsec）以及相关的体积和焓变。

引言

光热方法（如光声量热法、光热束偏转（PDB）以及与纳秒激光激发耦合的瞬态光栅）为研究短寿命中间体的时间分辨实验提供了强有力的替代瞬态光学光谱学的手段^1,2。与瞬态吸收和红外光谱等监测发色团周围吸收变化时间过程的光学技术不同，光热技术检测的是热/体积变化的时间依赖性，因此是研究光学上“静默”过程时间特征的有力工具。迄今为止，光声量热法和瞬态光栅已成功应用于研究光诱导过程的构象动力学，包括球蛋白中双原子配体的迁移^3,4、配体与氧感应蛋白FixL的相互作用⁵、血红素-铜氧化酶⁶以及光系统II中的电子和质子传递，以及视紫红质中的光异构化⁷和隐花色素中的构象动力学⁸。

为了将光热技术的应用扩展到缺乏内源性生色团和/或荧光团的生物体系，PBD 技术被结合使用笼锁化合物，以在几微秒或更快的时间内（取决于所用的笼锁化合物）通过光触发实现配体/底物浓度的升高。该方法使得能够监测配体/底物与缺乏内源性荧光团或生色团的蛋白质结合时所伴随的结构变化的动力学和热力学过程，其时间尺度是商用停流仪器无法达到的。本文展示了利用 PBD 技术监测笼锁化合物 Ca²⁺DM-nitrophen 光解反应的热力学，以及 Ca²⁺ 与神经元钙感应蛋白下游调节元件拮抗剂调节蛋白（DREAM）C端结构域结合的动力学。Ca²⁺ ....

方案

1. 样品制备

1. 在暗室中进行样品制备及所有样品操作，以防止发生非预期的光解反应。
2. 将DM-硝酚（(1-(2-硝基-4,5-二甲氧基苯基)-N,N,N',N'-四(羰基氧基甲基)-1,2-乙二胺)）溶于50 mM HEPES缓冲液、100 mM KCl、pH 7.0中，终浓度为400 µM（ε_350nm = 4330 M^-1cm^{-1 9}）。
3. 从0.1 M储备液中加入CaCl₂，以达到所需的[Ca²⁺]:[DM-硝酚]比例。对于Ca²⁺结合的K_d大于10 µM的蛋白质，建议采用1:1的[Ca²⁺]:[DM-硝酚]比例，以防止光解释放的Ca²⁺与去笼状态的DM-硝酚结合。实际上，考虑到DM-硝酚的K_d值为10 nM，且DM-硝酚与Ca²⁺的总浓度为400 µM时，约有90%的钙结合蛋白（K_d = 10 μM）将处于无钙状态。另一方面，在研究Ca²⁺与K_d < 10 µM的蛋白质结合时，建议将[Ca²⁺]:[DM-硝酚]比例降低至0.95，以防止在笼状物光解离之前Ca²⁺与无钙蛋白形成复合物。

结果

Ca²⁺DM-硝酚光解释放Ca²⁺的典型PBD轨迹示例如图3所示。快速相对应于Ca²⁺DM-硝酚的光裂解及Ca²⁺的释放，而慢速相则反映了Ca²⁺与未光解笼合物的结合。根据公式4，将样品PBD信号在快速相和慢速相的振幅相对于参考化合物振幅进行归一化，并结合温度依赖因子[C_pρ/(dn/dt)]，同时依据公式5-7将观测到的溶液中释放热量和非热体积变化归一化至DM-硝酚光解离的量子产率（Φ = 0.18）¹¹，由此获得快速相的反应焓变和体积变化值（ΔV_fast = -12±5 ml/mol 和 ΔH_fast = -50±20 kcal/mol）以及慢速相的相应值（ΔV_slow = 9±5 ml/mol 和 ΔH_slow = -23±12 kcal/mol）。Ca²⁺与神经元钙感受.......

讨论

光热方法背后的物理原理是：被光激发的分子通过振动弛豫将多余能量耗散至基态，导致周围溶剂产生热加热效应^1,12。对于水等溶剂，这会产生快速的体积膨胀（ΔV_th）。处于激发态的分子还可能发生光化学过程，由于键的断裂/形成和/或分子结构的变化，导致非热体积变化（ΔV_nonth），这些变化可改变分子的分子尺寸（i.e. 范德华体积的变化），以及改变分子的电荷分布，从而引起电致收缩效应。这导致被照射区域迅速膨胀，产生折射率变化，可通过多种光学方法进行探测。光束偏转检测（PBD）利用了如下事实：由于高斯形状的激光脉冲在样品中建立了折射率梯度，当探测光束穿过样品时会发生偏转，如图2所示。

光热束偏转技术能够测定多种光引发过程的时间分辨体积变化和焓变，包括配体-血红素复合物的光解反应机理¹³、笼状化合物复合物中生物活性分子的释放¹⁴，以及荧光团三重态寿命的探测。与常用于监测生物大分子结构变化的传统技术（如瞬态吸收光谱和荧光光谱）.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1-(4,5-二甲氧基-2-硝基苯基)-1,2-二氨基乙烷-N,N,N',N'-四乙酸	Life Technologies	D-6814	DM-硝基苯，钙笼合物，储备液需避光保存以防止光解
4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸，N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-(2-乙磺酸)	Sigma Aldrich	0909C	HEPES缓冲液
铁氰化钾(III)	Sigma Aldrich	702587	PBD测量用参比化合物
铬酸钠	Sigma Aldrich	307831	PBD测量用参比化合物
氦氖激光二极管，5 mW，635 nm	Edmund Optics	54-179	用作PBD测量的探测光束
示波器	LeCroy	Wave Surfer 42Xs	400 MHz带宽
Nd:YAG激光器	Continuum	ML II	PBD测量的泵浦光束
M355；Nd:YAG激光反射镜	Edmund Optics	47-324	355 nm激光线用反射镜
M1 和 M2；激光二极管反射镜	Edmund Optics	43-532	可见光平面反射镜，波长范围300–700 nm
P1 和 P2；虹膜光阑	Edmund Optics	62-649	针孔，用于整形探测光束和泵浦光束
L1；双凸透镜	Thorlabs	LB1844	用于将探测光束聚焦至探测器的透镜，有效焦距50 mm，波长范围350–2,000 nm
DM，二向色镜	Thorlabs	DMLP505	长通二向色镜，截止波长505 nm
F1；边缘滤光片	Andower	500FH90-25	长通滤光片，截止波长500 nm
温控比色皿支架	Quantum Northwest	FLASH 300