细胞的快速机械变形已成为一种有前景的无载体方法，可用于将大分子和纳米材料递送至细胞内。本方案详细介绍了如何将该系统应用于多种不同场景的操作步骤。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
细胞的快速机械变形已成为一种有前景的无载体方法，可用于大分子和纳米材料的细胞内递送。该技术在应对以往具有挑战性的应用方面展现出潜力，包括向原代免疫细胞递送、细胞重编程、碳纳米管以及量子点的递送。这种无载体微流控平台依赖于细胞膜的机械性破坏，以促进目标物质向细胞质的递送。本文详细描述了此类微流控装置的使用方法，包括装置组装、细胞准备及系统操作。对于此前未报道的应用，该递送方法需对装置类型和操作条件进行简要优化。所提供的操作说明可广泛适用于大多数细胞类型和递送材料，因为该系统无需特殊缓冲液或化学修饰/偶联步骤。本研究还提供了提升装置性能的建议，并针对堵塞、递送效率低以及细胞活力差等潜在问题给出了故障排除方案。
引言
将大分子递送至细胞质是治疗和科研应用中的关键步骤。例如，纳米颗粒介导的递送在基因治疗1,2中已显示出潜力，而蛋白质递送则是在临床3和实验室4环境中调控细胞功能的一种有前景的方法。其他材料，如小分子药物、量子点或金纳米颗粒，在从癌症治疗5,6到细胞内标记7,8以及单分子示踪9等多种应用中也备受关注。
细胞膜对大分子物质通常具有高度不通透性。许多现有技术利用聚合物纳米颗粒10,11、脂质体12或化学修饰13来促进膜的破坏或通过内吞作用递送物质。在这些方法中，递送效率和细胞存活率往往依赖于目标分子的结构和细胞类型。这些方法在递送结构均一的物质（如核酸）时可能较为高效，但通常不适用于结构更为多样的物质（如蛋白质14,15和纳米材料7）的递送。此外，大多数此类方法所依赖的内体破裂机制常常效率低下，导致大量物质滞留在囊泡结构中16。最后，许多为常用细胞系开发的方法在应用于原代细胞时效果不佳。
在某些应用中，膜穿孔方法（如电穿孔17,18和声穿孔19）是一种有吸引力的替代方案；然而，这些方法可能导致细胞存活率较低，并且可能受到目标递送材料电荷的限制。
细胞的快速机械变形是一种基于微流控技术的递送方法，近年来在细胞重编程20和纳米材料递送21方面展现出相较于现有技术的优势。该方法依赖于对细胞膜的机械性扰动，以促进周围缓冲液中物质向细胞质内的递送。该系统已在以往难以处理的细胞类型（例如原代免疫细胞和干细胞）以及材料（例如抗体和碳纳米管）中展现出显著的应用潜力。本文描述了利用此类装置实现靶向大分子胞内递送的一般操作流程。该流程可广泛适用于大多数细胞类型和递送材料；然而，对于此前未报道过的应用，建议根据我们先前发表的设计指南20对实验条件进行简要优化。迄今为止，该系统已成功用于RNA、DNA、金纳米颗粒、量子点、碳纳米管、蛋白质以及葡聚糖聚合物的递送20,21。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
1. 储存
- 将储液池、支架、O型圈和微流控装置保存在70%乙醇中。使用容器（例如 带盖的广口瓶或烧杯，以防止蒸发以及灰尘或外界颗粒的污染。将装置放入第一个容器（1），储液器和O形圈放入第二个容器（2），支架放入第三个容器（3）。
注意：使用70%乙醇保存的目的是维持无菌状态。如果溶液的唯一组分是乙醇和水（即 无变性剂的情况下，所有系统组分应完全兼容，且不会随时间降解。
- 每次使用前更换容器（2）和（3）中的乙醇溶液，以防止实验间交叉污染，并减少可能导致堵塞的杂质颗粒。
2. 实验准备
- 每次使用前，将容器（2）和（3）放入超声波清洗仪中处理 5–10 分钟 ，以去除先前实验中可能残留的污染颗粒。
- 使用 70% 乙醇溶液清洁生物安全柜内的工作区域。
- 将所有材料（3 个容器和镊子）在放入生物安全柜前喷洒 70% 乙醇溶液进行表面消毒。
3. 组装
- 在工作区域放置 2-3 块低纤维脱落擦拭布。
- 用镊子将塑料储液槽从容器中取出，置于擦拭纸上，以促进内表面乙醇溶液的蒸发。轻轻敲击储液槽表面，或向其中吹气，以促进乙醇溶液的去除。
- 将O型圈插入储液槽的相应槽位中。
- 从各自的容器中取出支架和芯片，并让乙醇挥发（约1-2分钟）。
- 使用镊子将所需芯片正面朝上放置（即 在支架中对准芯片的定位孔（将定位孔朝上）。将装有芯片的支架抬升至与视线齐平，检查芯片是否平整地置于支架内，必要时用镊子进行调整。重要提示：若芯片在支架中未正确就位，后续步骤中存在芯片破损的风险。
- 接下来，轻轻地将储液槽放置在支架上，并与卡扣对齐。在此过程中，注意确保O型圈不要从槽中脱落。
- 轻轻按压储液池，直至其卡入到位。确保储液池两侧均已固定，并确认芯片处于正确位置。
4. 细胞制备
- 对于贴壁细胞（原代细胞或已建立的细胞系）：在实验前1-2天接种细胞，确保实验当天细胞融合度不超过80%。
- 将细胞置于悬浮状态（在PBS或相应培养基中），目标操作浓度为1.0 × 106 个细胞/ml 至1.0 × 107 个细胞/ml。注意：我们未观察到细胞浓度对递送效率有显著影响。
- 在另一管中混合细胞与目标递送物质，以获得实验所需的物质浓度。重要提示：由于所述递送方法依赖扩散作用实现递送，较高的物质浓度将导致更高的递送效率。如条件允许，建议初次试验使用1 µM的目标物质溶液，后续实验可根据需要逐步降低浓度。本设备已有报道使用的最低浓度为10 nM21。
5. 操作
- 将细胞与递送材料的混合物移液至储液池中（当前设计的最大容量为 150 µl）。注意：大多数装置设计均为完全可逆，因此流体在通道中的流动方向无关紧要。样品可加载至两个储液池中的任意一个。
- 将压力管连接至已填充的储液池，并拧紧螺母以确保密封良好（通常用手拧紧即可）。
- 在调压阀上将压力调节至所需水平。此操作控制细胞通过装置的速度。请注意，按下按钮前细胞流动不会开始。
注意：在先前的研究中，氮气或压缩空气作为载气均表现出相同良好的效果。
- 将装置抬升至与视线齐平，并调整方向，使储液器中的液体清晰可见。注意：请监测液面高度，在储液器排空前关闭系统。
- 按下按钮以加压储液池并启动细胞流动。
- 当液面距离储液槽底部约 2 mm 时，迅速将调节器调至 0 psi 以停止流动。重要提示：若未在储液槽排空前及时停止流动，可能导致样品从收集储液槽中被喷出。另需注意，若液柱移动速度明显缓慢，或相较于初始流速显著减慢（例如 运行速度减慢3倍），表明安装的装置可能已堵塞，需要更换。使用堵塞的装置可能导致细胞死亡率升高。
- 从相应的储存器中收集处理后的细胞，并将其放入所需的收集管/板中。重要提示：此阶段切勿将收集的细胞用任何缓冲液稀释，因为穿孔后的细胞在最多10分钟内会持续摄取物质20此时间窗过后，将细胞用所需的培养基/缓冲液稀释。
- 如需收集更多处理过的细胞或尝试其他实验条件，可根据需要重复步骤 5.1–5.7。请注意，芯片具有可逆性，因此样品可加载至任意储液池中。若芯片发生堵塞，应及时更换。丢弃已堵塞的装置。
6. 拆卸
- 轻轻推开卡扣臂，将储液槽从主支架上拆下。
- 将各部件放入相应的储存容器中（详见第1节）。
- 将使用过的芯片放入单独的容器中以待处理。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
图1展示了微流控递送系统的示意图。图2a-b展示了在存在荧光标记的3 kDa葡聚糖20的条件下，使用不同装置设计处理HeLa细胞的典型结果。如果操作步骤正确，系统性能将对装置类型和运行速度敏感。因此，在进行更复杂的实验之前，应针对特定应用优化这些条件。在图中所示的操作条件下，细胞存活率保持在80%以上；然而必须注意，次优的递送参数（例如不合适的芯片类型）可能导致存活率低于30%。因此，对于任何此前未报道过的细胞类型，必须同时优化细胞存活率和递送效率。如果装置设计不适合目标细胞类型，结果可能从无递送效果到细胞大量死亡（例如存活率为10%）不等。如果实验条件不合适，例如目标物质结合到细胞表面，则可能无法准确测量递送效果，因为表面结合信号可能掩盖细胞质内的信号。
图2c-d 展示了我们在活细胞群体中测量递送效率的首选方法。图2c 中的对照组旨在反映细胞暴露于递送材料时所产生的全部表面结合和内吞效应...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
所述实验步骤的某些方面（即 除了芯片设计和运行速度之外的其他因素可能需要根据系统所应用的细胞类型和递送材料进行优化。以下讨论涉及实验设计时需考虑的一些最常见因素。
为了提高荧光标记化合物的递送信号，需要解决背景荧光的来源问题。例如，可在递送后5–10分钟内洗涤细胞，以在培养或进一步处理前去除多余的物质，从而减少表面结合和内吞作用的影响。如果选择省略洗涤步骤，则最好将处理后的细胞在目标培养基中稀释5–10倍，以降低周围溶液中目标物质的浓度，从而减少内吞速率。在某些情况下（例如蛋白质递送），可能需要主动阻断细胞表面（例如使用未标记的牛血清白蛋白），以最大限度地减少递送材料的非特异性结合。在特定应用中，若通过流式细胞术测得未处理组的荧光强度比内吞对照组低一个数量级以上，则表面结合或内吞作用可能构成干扰因素。需要注意的是，背景信号问题仅与递送材料的直接荧光检测相关；而功能检测（例如细胞重编程）通常不受影响，因为被内吞或表面结合的材料通常不具备活性。
为了提高细胞处理后的存活率，需要...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者 Armon Sharei、Robert Langer 和 Klavs F. Jensen 是 SQZ Biotechnologies 公司的股东，该公司生产本文所使用的微流控设备。
致谢
感谢 T. Shatova 在实验设计和数据分析方面的有益讨论。感谢 G. Paradis、麻省理工学院科赫研究所流式细胞术核心设施的工作人员以及麻省理工学院微系统技术实验室的工作人员提供的帮助和专业技术支持。本研究得到了美国国立卫生研究院资助项目 RC1 EB011187-02、DE013023、DE016516、EB000351 的支持，以及美国国家癌症研究所癌症中心支持（核心）资助项目 P30-CA14051 和 MPP-09Call-Langer-60 的部分支持。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 设备支架 &和塑料储液槽 | SQZ 生物技术公司 | 支架 | |
| LSRFortessa 分析仪 | Becton Dickinson | N/A | 科赫研究所核心设施所使用的流式细胞仪 |
| 微流控装置 | SQZ 生物技术公司 | 细胞挤压 | |
| O型圈 | 麦克马斯特 | 9452K311 | |
| 操作设备用压力系统 | SQZ 生物技术公司 | 压力系统 | |
| 镊子 | |||
| 超声波清洗机 |
参考文献
- Schaffert, D., Wagner, E. Gene therapy progress and prospects: synthetic polymer-based systems. Gene. Ther. 15, 1131-1138 (2008).
- Whitehead, K. A., Langer, R., Anderson, D. G. Knocking down barriers: advances in siRNA delivery. Nat. Rev. Drug Discov. 8, 129-138 (2009).
- Leader, B., Baca, Q. J., Golan, D. E. Protein therapeutics: a summary and pharmacological classification. Nat. Rev. Drug Discov. 7, 21-39 (2008).
- Kim, D., et al. Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells by Direct Delivery of Reprogramming Proteins. Cell Stem Cell. 4, 472-476 (2009).
- Dhar, S., Daniel, W. L., Giljohann, D. A., Mirkin, C. A., Lippard, S. J. Polyvalent Oligonucleotide Gold Nanoparticle Conjugates as Delivery Vehicles for Platinum(IV) Warheads. J. Am. Chem. Soc. 131, 14652-14653 (2009).
- Jiang, Z. -X., Zhang, Z. -Y. Targeting PTPs with small molecule inhibitors in cancer treatment. Cancer and Metastasis Reviews. 27, 263-272 (2008).
- Derfus, A. M., Chan, W. C. W., Bhatia, S. N. Intracellular Delivery of Quantum Dots for Live Cell Labeling and Organelle Tracking. Adv. Mater. 16, 961-966 (2004).
- Michalet, X., et al. Quantum Dots for Live Cells in Vivo Imaging, and Diagnostics. Science. 307, 538-544 (2005).
- Dahan, M., et al. Diffusion Dynamics of Glycine Receptors Revealed by Single-Quantum Dot Tracking. Science. 302, 442-445 (2003).
- Slowing, I. I., Trewyn, B. G., Lin, V. S. Y. Mesoporous Silica Nanoparticles for Intracellular Delivery of Membrane-Impermeable Proteins. J. Am. Chem. Soc. 129, 8845-8849 (2007).
- Pack, D. W., Hoffman, A. S., Pun, S., Stayton, P. S. Design and development of polymers for gene delivery. Nat. Rev. Drug Discov. 4, 581-593 (2005).
- Joseph, Z. Cationic lipids used in gene transfer. Advanced Drug Delivery Reviews. 27 (97), 17-28 (1997).
- Verma, A., et al. Surface-structure-regulated cell-membrane penetration by monolayer-protected nanoparticles. Nat. Mater. 7, 588-595 (2008).
- Yan, M., et al. A novel intracellular protein delivery platform based on single-protein nanocapsules. Nat. Nano. 5, 48-53 (2010).
- Shi Kam, N. W., Jessop, T. C., Wender, P. A., Dai, H. Nanotube Molecular Transporters: Internalization of Carbon Nanotube-Protein Conjugates into Mammalian Cells. J. Am. Chem. Soc. 126, 6850-6851 (2004).
- Varkouhi, A. K., Scholte, M., Storm, G., Haisma, H. J. Endosomal escape pathways for delivery of biologicals. Journal of Controlled Release. 151, 220-228 (2011).
- li, S. Electroporation Gene Therapy: New Developments In Vivo and In Vitro. Current Gene Therapy. 4, 309-316 (2004).
- Fox, M., et al. Electroporation of cells in microfluidic devices: a review. Anal. Bioanal. Chem. 385, 474-485 (2006).
- Miller, D. L., Pislaru, S. V., Greenleaf, J. F. Sonoporation: Mechanical DNA Delivery by Ultrasonic Cavitation. Somatic Cell and Molecular Genetics. 27, 115-134 (2002).
- Sharei, A., et al. A vector-free microfluidic platform for intracellular delivery. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 2082-2087 (2013).
- Lee, J., et al. Nonendocytic Delivery of Functional Engineered Nanoparticles into the Cytoplasm of Live Cells Using a Novel, High-Throughput Microfluidic Device. Nano Lett. 12, 6322-6327 (2012).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
