细胞的快速机械变形已成为一种有前景的无载体方法，可用于将大分子和纳米材料递送至细胞内。本方案详细介绍了如何将该系统应用于多种不同场景的操作步骤。
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本文内容
摘要
摘要
细胞的快速机械变形已成为一种有前景的无载体方法，可用于大分子和纳米材料的细胞内递送。该技术在应对以往具有挑战性的应用方面展现出潜力，包括向原代免疫细胞递送、细胞重编程、碳纳米管以及量子点的递送。这种无载体微流控平台依赖于细胞膜的机械性破坏，以促进目标物质向细胞质的递送。本文详细描述了此类微流控装置的使用方法，包括装置组装、细胞准备及系统操作。对于此前未报道的应用，该递送方法需对装置类型和操作条件进行简要优化。所提供的操作说明可广泛适用于大多数细胞类型和递送材料，因为该系统无需特殊缓冲液或化学修饰/偶联步骤。本研究还提供了提升装置性能的建议，并针对堵塞、递送效率低以及细胞活力差等潜在问题给出了故障排除方案。
引言
将大分子递送至细胞质是治疗和科研应用中的关键步骤。例如，纳米颗粒介导的递送在基因治疗1,2中已显示出潜力，而蛋白质递送则是在临床3和实验室4环境中调控细胞功能的一种有前景的方法。其他材料，如小分子药物、量子点或金纳米颗粒，在从癌症治疗5,6到细胞内标记7,8以及单分子示踪9等多种应用中也备受关注。
细胞膜对大分子物质通常具有高度不通透性。许多现有技术利用聚合物纳米颗粒10,11、脂质体12或化学修饰13来促进膜的破坏或通过内吞作用递送物质。在这些方法中，递送效率和细胞存活率往往依赖于目标分子的结构和细胞类型。这些方法在递送结构均一的物质（如核酸）时可能较为高效，但通常不适用于结构更为多样的物质（如蛋白质14,15和纳米材料7）的递送。此外，大多数此类方法所依赖的内体破裂机制常常效率低下，导致大量物质滞留在囊泡结构中16。最后，许多为常用细胞系开发的方法在应用于原代细胞时效果不佳。
在某些应用中，膜穿孔方法（如电穿孔17,18和声穿孔19）是一种有吸引力的替代方案；然而，这些方法可能导致细胞存活率较低，并且可能受到目标递....
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方案
1. 储存
- 将储液池、支架、O型圈和微流控装置保存在70%乙醇中。使用容器（例如 带盖的广口瓶或烧杯，以防止蒸发以及灰尘或外界颗粒的污染。将装置放入第一个容器（1），储液器和O形圈放入第二个容器（2），支架放入第三个容器（3）。
注意：使用70%乙醇保存的目的是维持无菌状态。如果溶液的唯一组分是乙醇和水（即 无变性剂的情况下，所有系统组分应完全兼容，且不会随时间降解。
- 每次使用前更换容器（2）和（3）中的乙醇溶液，以防止实验间交叉污染，并减少可能导致堵塞的杂质颗粒。
2. 实验准备
- 每次使用前，将容器（2）和（3）放入超声波清洗仪中处理 5–10 分钟 ，以去除先前实验中可能残留的污染颗粒。
- 使用 70% 乙醇溶液清洁生物安全柜内的工作区域。
- 将所有材料（3 个容器和镊子）在放入生物安全柜前喷洒 70% 乙醇溶液进行表面消毒。
3. 组装
- 在工作区域放置 2-3 块低纤维脱落擦拭布。
- 用镊子将塑料储液槽从容器中取出，置于擦拭纸上，以促进内表面乙醇溶液的蒸发。轻轻敲击储液槽表面，或向其中吹气，以促进乙醇溶....
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结果
图1展示了微流控递送系统的示意图。图2a-b展示了在存在荧光标记的3 kDa葡聚糖20的条件下，使用不同装置设计处理HeLa细胞的典型结果。如果操作步骤正确，系统性能将对装置类型和运行速度敏感。因此，在进行更复杂的实验之前，应针对特定应用优化这些条件。在图中所示的操作条件下，细胞存活率保持在80%以上；然而必须注意，次优的递送参数（例如不合适的芯片类型）可能导致存活率低于30%。因此，对于任何此前未报道过的细胞类型，必须同时优化细胞存活率和递送效率。如果装置设计不适合目标细胞类型，结果可能从无递送效果到细胞大量死亡（例如存活率为10%）不等。如果实验条件不合适，例如目标物质结合到细胞表面，则可能无法准确测量递送效果，因为表面结合信号可能掩盖细胞质内的信号。
图2c-d 展示了我们在活细胞群体中测量递送效率的首选方法。图2c 中的对照组旨在反映细胞暴露于递送材料时所产生的全部表面结合和内吞效应.......
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讨论
所述实验步骤的某些方面（即 除了芯片设计和运行速度之外的其他因素可能需要根据系统所应用的细胞类型和递送材料进行优化。以下讨论涉及实验设计时需考虑的一些最常见因素。
为了提高荧光标记化合物的递送信号，需要解决背景荧光的来源问题。例如，可在递送后5–10分钟内洗涤细胞，以在培养或进一步处理前去除多余的物质，从而减少表面结合和内吞作用的影响。如果选择省略洗涤步骤，则最好将处理后的细胞在目标培养基中稀释5–10倍，以降低周围溶液中目标物质的浓度，从而减少内吞速率。在某些情况下（例如蛋白质递送），可能需要主动阻断细胞表面（例如使用未标记的牛血清白蛋白），以最大限度地减少递送材料的非特异性结合。在特定应用中，若通过流式细胞术测得未处理组的荧光强度比内吞对照组低一个数量级以上，则表面结合或内吞作用可能构成干扰因素。需要注意的是，背景信号问题仅与递送材料的直接荧光检测相关；而功能检测（例如细胞重编程）通常不受影响，因为被内吞或表面结合的材料通常不具备活性。
为了提高细胞处理后的存活率，需要.......
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披露
作者 Armon Sharei、Robert Langer 和 Klavs F. Jensen 是 SQZ Biotechnologies 公司的股东，该公司生产本文所使用的微流控设备。
致谢
感谢 T. Shatova 在实验设计和数据分析方面的有益讨论。感谢 G. Paradis、麻省理工学院科赫研究所流式细胞术核心设施的工作人员以及麻省理工学院微系统技术实验室的工作人员提供的帮助和专业技术支持。本研究得到了美国国立卫生研究院资助项目 RC1 EB011187-02、DE013023、DE016516、EB000351 的支持，以及美国国家癌症研究所癌症中心支持（核心）资助项目 P30-CA14051 和 MPP-09Call-Langer-60 的部分支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 设备支架 &和塑料储液槽 | SQZ 生物技术公司 | 支架 | |
| LSRFortessa 分析仪 | Becton Dickinson | N/A | 科赫研究所核心设施所使用的流式细胞仪 |
| 微流控装置 | SQZ 生物技术公司 | 细胞挤压 | |
| O型圈 | 麦克马斯特 | 9452K311 | |
| 操作设备用压力系统 | SQZ 生物技术公司 | 压力系统 | |
| 镊子 | |||
| 超声波清洗机 |
参考文献
- Schaffert, D., Wagner, E. Gene therapy progress and prospects: synthetic polymer-based systems. Gene. Ther. 15, 1131-1138 (2008).
- Whitehead, K. A., Langer, R., Anderson, D. G. Knocking down barriers: advances in siRNA delivery. Nat. Rev. Drug Discov. 8, 129-....
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重印与许可
