电池挤压作为一种强大的，微流控细胞内传送平台

Summary

细胞的快速机械变形已成为细胞内输送大分子和纳米材料的一种很有前途的，矢量-free方法。这个协议提供了关于如何使用该系统进行范围广泛的应用中的详细步骤。

Abstract

细胞的快速机械变形已成为细胞内输送大分子和纳米材料的一种很有前途的，矢量-free方法。这种技术已经显示潜在解决先前具有挑战性的应用;包括，输送到初级免疫细胞，细胞重编程，碳纳米管，量子点传递。这个矢量的无微流体平台依赖于细胞膜的机械破坏，以促进胞内递送的靶材料制成的。本文中，我们描述了用于这些微流体装置，包括装置组件中，细胞制剂，和系统操作的详细方法。这种交付方式需要的设备类型和操作条件对以前未报告应用程序的简短优化。提供的说明书是一般化到大多数细胞类型和传递材料作为本系统不需要专门的缓冲器或化学修饰/共轭的步骤。这项工作也提供的建议，关于如何提高设备的性能和无故障的拍摄与堵塞，低输送效率和细胞活力的潜在问题。

Introduction

递送大分子到细胞的细胞质中的治疗和研究应用中的关键步骤。纳米颗粒介导的递送，例如，已经显示出在基因治疗^1,2潜力，而蛋白质递送是在临床³和实验⁴的设置影响细胞功能的一个有希望的途径。其他材料，如小分子药物，量子点，或金的纳米粒子，是在应用范围从癌症治疗^5,6至细胞内标记^7,8，和单分子跟踪⁹的兴趣。

细胞膜主要是不可渗透的大分子。许多现有技术使用的聚合物纳米颗粒^10,11，脂质体^12，或化学修饰^13，以促进膜破裂或内吞递送。在这些方法中，输送效率和细胞存活率通常是依赖于次结构Ë目标分子和细胞类型。这些方法可以在结构均匀的材料，例如核酸的递送是有效的，但通常不适合用于多结构不同的材料，如蛋白质^14,15和纳米材料⁷的交付。而且，大多数这些方法依赖于核内体破坏机理是经常效率不高，因而留下被困在囊泡结构¹⁶多的材料。最后，往往与建立的细胞系使用而开发的方法并不很好的转化为原代细胞。

膜穿孔的方法，如电穿孔^17,18和¹⁹声孔效应，在某些应用中有吸引力的选择，但是，它们是已知会引起低细胞存活率，并且可以通过目标传递材料的电荷来....

Protocol

1。存储

1. 存储水库，持有人，O型圈和微流体装置中70％的乙醇。使用容器（ 如瓶子或烧杯中），有一个盖子，以防止蒸发和污染的灰尘或颗粒外。放置设备在一个容器（1），水库和O形环在第二容器（2），和持有者在第三（3）。

注意:对于存储的使用70％乙醇中的是保持无菌。如果溶液的唯一成分是乙醇和水（ 即没有变性剂），所有的系统组件应该是完全兼容的，并且不会随时间降解。

2. 改变容器（2）乙醇溶液（3）每次使用，以避免交叉污染整个实验和最大限度地减少不必要的颗粒，可能会导致堵塞的面前。

2。实验准备

1. 这里的容器（2）和（3）在超声浴中FO每次使用前ř5-10分钟。这有助于从以前的实验中去除任何污染颗粒。
2. 干净的工作空间在生物安全柜中，用70％乙醇溶液。
3. 将它们放置在生物安全柜内进行喷涂之前的所有材料（3容器和镊子），用70％乙醇溶液。

3。装配

1. 在工作​​区设置下2-3低皮棉湿巾。
2. 从他们用镊子取出容器塑料水库和设置他们的湿巾，方便的从内表面乙醇溶液蒸发。轻轻敲击表面上的储器或吹空气通过它们，以便除去乙醇溶液中。
3. 将O形圈到他们对水库相....

Results

图1包含微流体输送系统的一个说明性示意图。 图2A-B示出了从在荧光共轭3 kDa的葡聚糖²⁰的存在下处理的HeLa细胞与不同设备设计的典型结果。如果程序正确执行，系统的性能将是设备类型和运行速度敏感。因此，人们必须在更复杂的实验之前，优化这些条件，对于给定的应用程序。在图中所示的操作条件的范围内，细胞活力保持在80％以上，但是，必须注意的是次优的输送参数（ 例如不适当的芯片类型）可能导致低于30％的存活率。因此，可行性和交付效率必须同时优化了任何以前未报告的细胞类型。如果设备的设计是不恰当的靶细胞类型，一会看到结果轻则无法传递到高CELL死亡（ 如 10％的可行性）。如果该实验条件不合适，例如结合至细胞表面上的靶材料，人们可能不能够测量准确递送作为表面结合信号可以掩盖胞质信号。

图2c-D示出了用于测量活细胞群内递送效率优选方法。控制的情况下在图2c是为了反映所有表面结合和内吞作用的细.......

Discussion

所描述的实验程序（ 即因子大于芯片的设计和操作速度等）的某些方面，可能需要根据系统被应用到的细胞类型和传递材料进行优化。下面地址的一些设计实验时要考虑的最常见因素的讨论。

改善对荧光标记的化合物的输送信号，需要解决的背景荧光源。表面结合和内吞作用，例如，可以通过分娩后清洗细胞5-10分钟培养或进一步加工之前去除多余的材料解决。如果选出放弃一个洗涤步骤，这将是最好的由5至10倍于所需介质进行稀释处理后的细胞，以降低靶材料的浓度在周围的溶液中，从而减少细胞内吞率。在某些情况下，例如蛋白质递送，人们可能发现有必要积极地阻断细胞surfaCE（ 例如，使用未标记的牛血清白蛋白），以尽量减少输送物质的非特异性结合。在一个给定的应用中，如果与未处理的情况下的荧光强度，如通过流式细胞术测定，比内吞控制一个十年低级然后面结合/内吞作用可能是一个问题。需要注意的是与背景信号问题只与直接荧光检测交付材料，功能性检测（ 如细胞重编程）通常是不受影响的内吞或表面结合的物质通常是无效的。

以改善细胞.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
设备支架 &塑料储液器	SQZ 生物技术	支架
LSRFortessa 分析仪	Becton Dickinson	N/A	科赫研究所使用的流式细胞仪 核心设施
微流式	SQZ 生物技术	细胞挤压
O 形圈	麦克马斯特	9452K311
作装置的压力系统	SQZ 生物技术	压力系统
镊子
超声波浴