大鼠升主动脉缩窄术用于建立压力超负荷性心肌肥厚模型

摘要

我们描述了一种通过使用小型金属夹缩窄升主动脉，在Wistar大鼠中建立压力超负荷及左心室肥厚的逐步操作方法。该模型被广泛用于研究心脏肥厚过程中的心肌重塑变化，以及识别和评估逆转此类变化的策略。

摘要

升主动脉缩窄术是最常用且最成功的手术模型，用于建立压力超负荷诱导的心肌肥厚和心力衰竭。本文中，我们详细描述了一种通过使用小型金属夹缩窄升主动脉，在大鼠中建立压力超负荷和心肌肥厚的外科手术方法。麻醉后，通过在气管软骨环之间做一半切口插入套管进行气管插管。然后在左侧胸壁第二肋间水平做皮肤切口，清除肌层以暴露升主动脉段。使用小型钛夹将升主动脉缩窄至其原始直径的50–60%。完成主动脉缩窄后，用聚丙烯缝线缝合第二和第三肋骨。当自主呼吸恢复后，拔除气管套管。通过逐渐降低麻醉深度，使动物在加热垫上恢复。通过经胸二维多普勒超声心动图记录压力阶差，以评估升主动脉缩窄所造成压力超负荷的程度。总体而言，该方案适用于研究从代偿性心肌肥厚逐步发展至心力衰竭阶段过程中，心脏的重构事件及收缩功能特性。

引言

小型动物模型是研究心脏肥厚发展过程中慢性变化及其向心力衰竭进展的首选工具。通过手术方法建立的心力衰竭模型最初是在大鼠中开发的，因为这些动物最适合进行开胸手术、超声心动图检查以及血流动力学参数的评估。它们还能提供足够的死后组织样本，用于组织、细胞和分子水平的研究¹。升主动脉缩窄是最常见且成功的外科手术模型之一，可用于建立压力超负荷型心力衰竭模型^2,3。该模型非常适合研究心脏从肥厚向心力衰竭转变过程中发生的细胞及亚细胞水平的重构事件以及心肌收缩特性⁴。

该模型的一个主要优势在于心脏所受压力负荷是逐渐增加的^5,6。此模型具有临床相关性，因其可从代偿性心肌肥厚缓慢而稳定地进展至失代偿阶段，最终发展为心力衰竭阶段。心肌肥厚向心力衰竭的进展时间及相关生理变化主要受所造成狭窄程度的影响⁷。升主动脉缩窄可通过两种方式实施，即使用缝线或金属夹^8,9。使用金属夹进行主动脉缩窄的主要优点是手术操作较为简便。该方法只需定位瓣上段升主动脉，并将夹子置于主动脉周围，以达到所需的缩窄程度。此操作无需使用胸腔牵开器。而通过缝线进行主动脉结扎则需要更多的外科操作，包括将测量针置于升主动脉旁侧，并在其周围缝合以实现预期的主动脉缩窄程度。与使用金属夹相比，后一种技术更为耗时。本视频所描述的方法展示了在大鼠中实施升主动脉缩窄的手术步骤，可用于建立压力超负荷诱导的左心室肥厚模型。

方案

动物实验在获得机构动物伦理委员会批准后进行。Wistar大鼠在12小时光照/ 黑暗与光照循环，恒定室温（24 ± 2 °C），自由摄食和饮水（遵循CPCSEA指南）。

1）术前护理与麻醉

1. 保持大鼠（约200 g） 在抗生素保护下24小时的体重 术前通过口服给予阿莫西林（剂量：500 mg/L 水）。
2. 将所有手术器械（如剪刀、镊子、施夹器、缝合针和持针器）在121 °C下高压灭菌15分钟。
3. 使用加热垫将动物体温维持在约 37 °C，以防止心率迅速下降。
4. 注意避免动物在手术前和手术过程中脱水。
5. 在诱导室中使用3%异氟烷与0.5–1.0 L/min的100%氧气混合气体麻醉大鼠；以1.5%异氟烷维持麻醉。
6. 检查足底反射以确认麻醉成功。

2）手术部位准备

1. 将大鼠仰卧于温度可控的加热垫上。
2. 用橡皮筋固定大鼠门齿，以保持动物体位稳定，同时通过鼻罩维持麻醉状态。
3. 去除大鼠颈部及左侧胸部的毛发（建议使用电动剃毛器）。
4. 先用聚维酮碘溶液消毒手术区域，再用70%乙醇进行消毒。
5. 手术过程中使用无菌手术巾仅暴露手术部位。
   注意：作为动物护理的附加措施，可在每处切口前于切口部位皮内注射0.25%布比卡因（2.5 mg/kg），以实现局部麻醉/镇痛。

3) 大鼠气管插管

1. 使用无菌手术刀沿气管方向在皮肤上做一个小切口，小心分离皮下组织，以暴露气管。
2. 在气管下方穿过一根4-0丝线缝合线并打结，轻轻向上提起结扎线。
3. 在两个软骨环之间的中点处做一半切口，将气管插管插入大鼠气管内。
4. 将气管插管连接至啮齿类动物呼吸机，维持呼吸频率为50次/分钟，潮气量为1.70 ml，吸气时间为0.60秒 （适用于体重200 g 的大鼠）。

4) 升主动脉缩窄

1. 用手触摸确定肋骨位置后，在左侧胸壁第二与第三肋骨之间做长约2 cm的皮肤切口。
2. 逐层分离肋间肌，并在第二与第三肋骨之间做长约1.5 cm的切口。（操作时需注意避免损伤肺组织）
3. 撑开肋骨，暴露升主动脉起始段。
4. 借助施夹器在升主动脉周围放置一个小型钛夹，使主动脉管径缩窄至原始直径的50–60%。
5. 完成主动脉缩窄后，使用3.0 Prolene缝线以间断缝合方式对合第二和第三肋骨。同时暂停呼吸机通气约2–4秒 ，以使肺组织重新膨胀。
6. 使用3.0 Prolene缝线间断缝合肌层，4.0丝线间断缝合皮肤。皮肤缝合也可采用合成不可吸收缝线替代丝线。
7. 待大鼠自主呼吸恢复后，拔除气管插管。
8. 使用3.0 Prolene缝线缝合气管切口，4.0丝线缝合皮肤层。
9. 逐渐降低麻醉深度和呼吸机辅助通气，使动物在加热垫上恢复。
10. 在年龄匹配的假手术对照动物中，行气管切开术和开胸术，但不进行升主动脉缩窄。

5) 术后护理

1. 使用聚维酮碘溶液对术区进行消毒。
2. 作为术后镇痛，经腹腔注射曲马多（10 mg/kg 体重/天），持续 1 周。
3. 若术后出现脱水迹象，经腹腔注射无菌生理盐水（约 1 ml）。
4. 口服阿莫西林，与饮用水混合，连续给药七天（剂量：500 mg/L 水）。
5. 术后 10 天在吸入麻醉下拆除皮肤上残留的丝线缝线。

6) 升主动脉缩窄成功的确认

1. 进行经胸二维多普勒超声心动图检查，以确定升主动脉缩窄所引起的压力超负荷程度。
2. 术后一周按照前述方法（步骤1.5）麻醉大鼠。
3. 将超声探头置于胸骨上窝位置，记录升主动脉缩窄段跨壁的压力梯度。
   注意：在主动脉缩窄部位压力梯度约为60 mm Hg的大鼠，术后约8–10周将发展为严重的心脏肥厚。

结果

在我们的实验中，能够实现超过80%的存活率。通过多普勒超声心动图检测确认了主动脉缩窄的有效性。选取6只在主动脉缩窄部位压力梯度约为60 mm Hg的大鼠，观察8周后处死，以分析心脏肥厚的发展情况（图1）。术后8周的超声心动图评估显示，与假手术对照组相比，接受主动脉缩窄处理的动物左心室参数显著增加，包括室间隔厚度、左心室后壁厚度，以及舒张期左心室内径减小（表1，图2）。主动脉缩窄大鼠的心脏重量/体重比值和左心室重量/体重比值也显著升高（表2，图3）。这些数据表明，与假手术对照组相比，术后8周的主动脉缩窄大鼠已发展出显著程度的心脏肥厚。

讨论

有多种手术模型可用于诱导压力超负荷以及心脏肥厚和心力衰竭。在小型动物中，Lorell 及其同事建立了本文所述的模型，并报道在主动脉缩窄术后8周出现代偿性心脏肥厚⁵。心脏的改变逐渐进展为失代偿状态，最终导致心力衰竭。该模型的主要优势在于左心室压力的升高呈渐进性发展，因而类似于慢性高血压的临床情况。此外，该模型也是研究与左心衰竭相关肺动脉高压的合适动物模型¹⁰。

其他用于压力超负荷性心力衰竭的动物模型，例如Dahl盐敏感大鼠、自发性高血压大鼠以及腹主动脉缩窄大鼠，同样可产生慢性压力超负荷。然而，这些模型从心肌肥厚进展为心力衰竭所需时间较长。因此，实验大鼠的维持成本也更高¹。deAlmeida及其同事采用横断性主动脉缩窄法在小鼠中诱导左心室肥厚¹¹。该技术涉及胸骨正中切开术及胸骨牵开，因而操作更具挑战性。

在开胸术前，需迅速将麻醉方式从鼻罩改为气管插管；手术操作结束后，再从气管插管恢复为鼻罩麻醉。大鼠气管插管的另一种替代方法是使用聚乙烯导管进行经...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Wistar 大鼠			在 RGCB 的 ARF 中维持饲养
吸入麻醉系统	VetEquip	AB19276
啮齿类动物呼吸机	CWE 公司	SAR-830/AP
大鼠气管插管	CWE 公司	13-21032
超声系统	Philips	HD7
超声探头	Philips	S 12
钛夹（小型）	Horizon	1204
夹子施加器	Weck	137081
电动剃须刀	Vinverth	VBT0817
手术刀片（型号：11）	Surgeon	REF10111	手术部位准备
曲马多	Orchid Healthcare	OCH043
盐酸阿莫西林	Ranbaxy
异氟烷	Piramal Healthcare	A23M10A
注射器	BD	2015-09
4-0 编织丝线	Diamond
3-0 Prolene 缝线	Johnson&Johnson	NW018
手术胶带	Romsons	SH 6301
聚维酮碘	Win Medicare
温度控制加热垫	Flamingo	HC1003