淋巴结内注射可生物降解聚合物颗粒

摘要

淋巴结是协调免疫反应的免疫组织，也是疫苗的关键靶点。生物材料已被用于更有效地靶向淋巴结，并控制抗原或佐剂的递送。本文介绍了一种结合上述理念的技术，即将生物相容性聚合物颗粒注射至淋巴结中。

摘要

适应性免疫应答的产生依赖于抗原向淋巴结的有效引流或转运，以便将这些外来分子加工并呈递给T细胞和B淋巴细胞。因此，淋巴结已成为新型疫苗和免疫疗法的关键靶点。近年来一种靶向这些组织的策略是直接向淋巴结注射可溶性疫苗组分，采用该技术的临床试验已显示出良好前景。此外，已有多种生物材料策略被探索以提高对淋巴结的靶向性，例如调节生物材料疫苗颗粒的粒径以实现最佳引流效果。本文介绍一种新方法，该方法结合了直接淋巴结注射与可生物降解聚合物颗粒，后者可负载抗原、佐剂或其他疫苗组分。在此方法中，通过一种改良的双重乳化法合成聚合物微粒或纳米颗粒，并引入脂质稳定剂。颗粒特性（例如 粒径、载药量）分别通过激光衍射和荧光显微镜进行确认。随后，通过外周注射无毒示踪染料定位小鼠淋巴结，从而可视化目标注射部位，并观察聚合物颗粒在淋巴结中的沉积情况。该技术可直接控制递送至淋巴结的生物材料与疫苗组分的剂量及组合，有望应用于新型生物材料基疫苗的研发。

引言

淋巴结（LNs）是免疫系统的指挥中心。在这一免疫学位点，抗原呈递细胞针对特定外来抗原激活初始淋巴细胞，从而启动细胞免疫和体液免疫应答。因此，淋巴结已成为疫苗和免疫疗法递送的理想靶标。然而，目前大多数疫苗策略导致抗原和佐剂向淋巴组织的递送效率低下且作用短暂¹。 因此，提高疫苗组分在淋巴结中的靶向性和滞留能力的方法，有望显著增强新型疫苗的效力和效率。

一种在新近临床试验中备受关注的、用于克服淋巴结靶向难题的策略是直接进行淋巴结内注射（intra-LN）i.LN.注射^2-4. 这些试验采用超声引导将疫苗递送至淋巴结，作为一种简单的门诊操作。与传统的外周注射途径相比，该方法在过敏和癌症等治疗场景中显著减少了剂量需求，并提高了疗效^2-4. 这些研究采用了 i.LN. 可溶性疫苗注射（即 生物材料无关）会通过淋巴引流被迅速清除。因此，需要进行多次注射或多个周期的多次注射才能实现这些显著的治疗效果。提高在淋巴结中的滞留能力可增强抗原和/或佐剂与免疫细胞之间的相互作用，从而进一步提升免疫细胞的活化效率。这一潜力得到了近期研究的支持，这些研究表明抗原和佐剂递送的动力学在决定所产生特异性免疫应答方面起着关键作用。^5-7. 此外，通过将药物和疫苗剂量局部化并减少用量，可降低或消除全身性效应，例如慢性炎症。

生物材料已被广泛研究，以提高疫苗的效力和效率^1,8,9。将有效成分包封或吸附于生物材料载体中，可物理性地防止其降解，并克服溶解度限制。另一项显著特性是生物材料载体（如聚合物微粒或纳米颗粒）能够共载多种类的有效成分，并在可控的时间间隔内逐步释放这些有效成分。然而，一个持续存在的显著局限是生物材料疫苗和免疫疗法在体内的免疫细胞靶向效率低下，以及向淋巴结迁移的能力有限。in vivo 例如，通过常规途径（如 皮内、肌内）进行外周注射时，生物材料疫苗通常难以有效靶向淋巴结，高达99%的注射物质滞留在注射部位^4,10。近年来，研究人员已通过调控生物材料疫苗载体的尺寸，以改善其通过组织间隙流动向淋巴结的优先迁移或引流效果^8,10。 这些进展已显著增强了细胞免疫和体液免疫应答，凸显了靶向并工程化改造淋巴结微环境在新型疫苗开发中的重要性。

本文介绍了一种结合脂质稳定聚合物颗粒与i.LN.递送方式的疫苗接种方案，以生成可控释放的疫苗储库^5,11。 在近期采用手术技术对小鼠进行i.LN.注射的研究基础上^6,7,12,13， 我们开发出一种快速、非手术性的方法，用于在小型动物中注射生物材料疫苗⁵。将i.LN.递送与生物材料疫苗载体相结合，可在单次注射可控释放疫苗储库后7天内显著增强CD8 T细胞反应⁵。 同时诱导了强烈的体液免疫反应（即. 抗体滴度）；这两种增强效应均与疫苗成分在淋巴结中的滞留增加有关，而这种滞留是由生物材料载体的可控释放所介导的。有趣的是，疫苗颗粒的尺寸会影响这些材料进入淋巴结后的命运：纳米级颗粒表现出更高的细胞直接摄取，而较大的微米颗粒则保留在淋巴结的细胞外环境中，并释放被淋巴结内驻留的抗原呈递细胞所摄取的货物（例如. 佐剂）⁵。 这些数据表明，通过调控注射至i.LN.的生物材料尺寸，可利用两种不同途径来设计新型疫苗。

本文采用改良的双重乳化法合成了可生物降解的脂质稳定型聚合物颗粒（微米级和纳米级）^5,11。 通过激光衍射和显微镜技术对颗粒的特性进行表征。随后，将这些颗粒直接注射到通过无创方式使用一种常见且无毒的示踪染料所定位的腹股沟淋巴结中¹⁴。注射后，可通过组织学或流式细胞术对淋巴结进行分析，以验证颗粒在淋巴结内的分布情况，并监测细胞对颗粒的摄取和滞留随时间的变化。有关组织学处理和流式细胞术的详细方案，读者可参考近期的 JoVE 文章及期刊报道^15-22。典型实验结果表明，这些颗粒能够实现对局部淋巴结的有效靶向，该特性可用于诱导强效且高效的免疫应答，或针对特定病原体定制免疫反应。

方案

本方案中的所有动物研究均遵循联邦、州和地方的指导方针，并采用经马里兰大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）审查和批准的方案进行。

1. 脂质稳定微纳米颗粒的合成

1. 在7 ml 玻璃小瓶中，按60:20:20的摩尔比混合DOPC、DSPE-PEG和DOTAP脂质，制备母脂质混合物。
   1. 合成单个样品：使用2 ml移液器，将242.9 μl DOPC、287.4 μl DSPE-PEG和71.9 μl DOTAP分别转移至小瓶中 玻璃血清移液管
   2. 合成多个样品时：将上述每种脂质体积乘以样品数量，合并至一个容器中，然后将该脂质混合物等量分装至对应待制备样品数量的各个容器中。
   3. 在氮气流下干燥脂质10分钟，或置于真空烘箱中过夜。
2. 在单个空的 20 ml 玻璃小瓶，将80 mg PLGA溶于5 ml 每次粒子样品使用二氯甲烷，制备成 16 mg/ml 的溶液 聚合物储备溶液
3. 加入 5 ml 将聚合物溶液加入含有干燥脂质的样品瓶中，盖紧瓶盖，涡旋振荡30秒。
4. 合成微粒：
   1. 将含有聚合物、脂质及其他水不溶性货物的有机相置于冰上，使用超声波破碎仪以12 W功率进行超声处理。
   2. 使用移液器加入500 µl，制备水包油（w/o）乳液 蒸馏水₂O 或 H₂含1 mg肽、蛋白质或其他水溶性货物的O。
   3. 继续超声处理30秒 在冰上以12 W功率，轻轻上下左右摇动离心管，使其围绕超声波破碎仪探头充分乳化。
   4. 通过将w/o乳液倒入40 ml的H中，制备水/油/水（w/o/w）乳液­₂O 在 150 ml 中 烧杯
   5. 匀浆处理3分钟 使用数位均质机在16,000 rpm条件下进行处理。
   6. 加入磁力搅拌子，将烧杯置于搅拌器上，使水/油/水乳液持续搅拌过夜，以去除过量溶剂。
5. 合成纳米颗粒：
   1. 在冰上以14 W功率开始超声处理含有聚合物、脂质及其他水不溶性货物的有机相。
   2. 使用移液管加入 500 µl 制备水/油乳液 蒸馏水₂O 或 H₂O 含有1 mg 肽、蛋白质或其他水溶性货物。
   3. 继续超声处理30秒 在冰上以14 W处理。
   4. 通过将w/o乳液倒入40 ml水中制备w/o/w乳液 的 H­₂O 在 150 ml 中 烧杯中并超声处理5分钟 在冰上以16 W功率超声处理。轻轻上下及左右摇动离心管，使其围绕超声探头充分乳化。
   5. 加入磁力搅拌子，将烧瓶置于搅拌板上，使w/o/w乳液持续搅拌过夜，以除去多余的溶剂。
6. 次日早晨，洗涤并收集颗粒：
   1. 将乳浊液经40 µm尼龙网细胞滤筛倒入50 ml离心管中 锥形管
   2. 离心颗粒5分钟 在5,000 × g条件下离心，适用于微粒；或离心5分钟 在24,000 × g条件下用于纳米颗粒。
   3. 倒出上清液，加入1 ml溶液重悬颗粒以洗涤 H的­₂O.
   4. 将悬浮颗粒转移至1.5 ml离心管中 微量离心管
   5. 离心5分钟 在5,000 × g条件下离心微粒或离心5分钟 在24,500 × g条件下用于纳米颗粒。
   6. 再用移除上清液并重悬于1 ml溶液中的方法洗涤颗粒两次 H₂O，并按照步骤1.6.5进行离心。洗涤后，将颗粒重悬于1 ml H₂立即使用，或进行冻干以长期保存。

2. 合成产率的测定

1. 预先称量一个空的 20 ml 玻璃小瓶。用移液器将颗粒悬浮液上下吹打混匀后，取 100 µl 加入已称重的小瓶中。
2. 将颗粒进行冻干或在温和的氮气流下干燥。
3. 称量含有干燥聚合物的小瓶。通过从含干燥颗粒的小瓶质量中减去小瓶的原始质量，计算小瓶中的颗粒产率。
4. 将小瓶中的颗粒质量乘以稀释倍数，计算总颗粒产率。为计算产率百分比，将颗粒质量除以理论最大投入质量，再乘以 100%。

3. 粒径测定

1. 用去离子水填充提供的比色皿式玻璃分馏池，并用棉签擦拭清洁。将10 ml 蒸馏H₂O转移至清洁后的分馏池中，加入磁力微型搅拌子，然后将分馏池装入粒径分析仪的样品池架中。
2. 调节粒径分析仪中的磁力搅拌速度，使分馏池内样品充分混合，然后关闭仪器舱门。
3. 使用仪器软件界面将激光对准分馏池。
4. 使用仪器软件界面记录仅含蒸馏H­₂O的分馏池的基线读数。
5. 用微量移液器反复吹打原始颗粒悬浮液以混匀。
6. 向分馏池中加入10 µl 颗粒悬浮液（通常约为0.5 mg）。确保加入分馏池的颗粒样品体积足以在仪器软件界面上指示的合适范围内产生足够的信号强度。所需颗粒的实际质量取决于产率百分比及颗粒样品的光学特性。
7. 关闭粒径分析仪舱门，使用PLGA的折射率为1.60的条件测量颗粒粒径。
8. 使用软件界面以数量为基础计算颗粒直径。

4. 颗粒的可视化

1. 用移液器反复吹打颗粒悬浮液以混匀。用去离子水将颗粒悬浮液稀释至 1 mg/ml 。
2. 取 3 µl 稀释后的颗粒悬浮液滴加到显微镜载玻片上，以 45° 角盖上盖玻片，避免产生气泡。将载玻片置于显微镜载物台上，使用适用于每种荧光载荷的滤光片组进行成像。

5. 小鼠的制备 i.LN. 注射

1. 制备示踪染料溶液：
   1. 通过将10 mg染料粉末溶于10 ml溶剂中，配制0.1%（w/v）的示踪染料溶液 蒸馏水。
   2. 使用 0.2 µm 注射器滤器将染料溶液灭菌至玻璃小瓶中。
2. 注射前一天，根据IACUC批准的动物实验方案，使用异氟烷对小鼠进行麻醉。为评估麻醉深度，实施脚趾夹捏反射测试，并监测呼吸频率，确保呼吸频率维持在约100-140次/分钟。
3. 使用电推剪在小鼠麻醉状态下剃除尾部基部及后肢部位的毛发。移除 从动物腹侧的毛发开始，向侧方延伸，直至后腿关节（髋部）上方的背侧区域。
4. 注射示踪染料。
   1. 每次染料注射时，使用微量移液器转移 10 μl 将染料溶液加入微量离心管中，并吸取全部10 μl 进入31G 连接至1 ml的针头 注射器
   2. 注射 10 μl 在尾部基底两侧的剪毛处皮下注射染料溶液，每次注射之间重新加样。
5. 使用棉签涂抹温和的脱毛膏以去除残留的毛发。注意涂抹后肢大腿与腹部之间的区域。
6. 让脱毛膏在皮肤上孵育 3 min。孵育结束后，用温水浸湿戴手套的手₂O型，并将脱毛膏轻轻揉入皮肤。
7. 立即用温水润湿戴手套的手，去除脱毛膏₂O形按摩并揉搓尾部基部和后躯，重复操作直至去除多余的脱毛剂，注意保持手部湿润以避免刺激。
8. 用温水浸湿柔软的布或纸巾，擦去小鼠身上的残留脱毛剂₂O型，单次动作擦拭小鼠下部，避免摩擦动作，以防小鼠皮肤磨损或损伤。
9. 让小鼠在加热灯下恢复，然后放回饲养环境。

6. i.LN. 颗粒注射

1. 次日，根据经 IACUC 批准的动物实验方案，使用异氟烷对小鼠进行麻醉。
2. 检查小鼠，确认示踪染料已引流至每个腹股沟淋巴结。淋巴结应表现为靠近后肢大腿与腹部交界处的深色斑点。
3. 制备颗粒注射液：
   1. 将颗粒重悬于蒸馏 H₂O 中，调整至所需注射浓度。每次注射前，使用微量移液器将 10 µl 颗粒溶液转移至微量离心管中。
   2. 用连接 1 ml 注射器的 31G 胰岛素针头吸取全部 10 µl 溶液。
4. 注射颗粒剂量：
   1. 在观察到淋巴结后，用拇指、食指和中指绷紧淋巴结周围的皮肤，使皮肤拉紧，以便精确控制注射位置和注射体积。
   2. 将针头以 90° 角垂直刺入染色淋巴结上方的皮肤，进针深度为 1 mm。
   3. 缓慢注入全部液体。注射过程中，通过皮肤观察淋巴结体积变化，以确认注射成功（可见淋巴结明显肿胀）。
5. 将小鼠置于加热灯下使其恢复，随后送回饲养笼或进行其他实验操作。

有关分析技术（例如 组织学、流式细胞术），请参见JoVE 文章 265、1743 和 3054，以及免疫学实验方案Current Protocols in Immunology第5章和第21章^15-22。

结果

本文所述方案的预期结果可分为三类：颗粒合成、动物准备和颗粒注射。

图 1 展示了由两亲性脂质稳定的可生物降解聚合物颗粒的合成与表征。乳液/溶剂蒸发法合成方案的结果（图 1A）可通过观察所形成的终末乳液进行定性评估；颗粒批次应为均匀、稳定的乳液，呈不透明外观。可能出现的问题包括乳液分层或絮凝，通常源于脂质稳定剂储存不当。为避免此类不稳定性，脂质应保存在 -80 °C 的干燥状态，或置于用氮气吹扫并密封的样品瓶中。颗粒合成的定量评估可通过激光衍射或动态光散射分析粒径分布来完成（图 1B）。预期结果为分布集中、单峰的颗粒尺寸，表明颗粒群体均一。本文所述的合成参数可分别获得数均粒径分布集中在约 100 nm（纳米颗粒）或 3 µm（微米颗粒）的颗粒。还可通过修改上述方案，引入多种荧光负载物，以进一步进行颗粒合成的定性评估。在 图 1C 中，载有荧光肽（FITC，绿色）、疏水性染料（DiD，红色）的微米颗粒显微图像及其叠加图像（黄色）证实了在目标尺寸范围内成功生成颗粒，并实现了肽在颗粒内部的包封。

图 2 的前两幅图板总结了本文所述 i.LN. 注射策略中动物准备的预期结果。该方法包括通过外周注射无毒示踪剂标记腹股沟淋巴结，以确定后续颗粒物 i.LN. 注射的位置（图 2A）⁵。如前所述，在尾基部皮下注射示踪染料后，染料引流可实现腹股沟淋巴结的可视化（图 2B）⁵。使用获批的脱毛膏可能对小鼠构成风险。因此，应特别注意彻底清除所有已涂抹的脱毛膏，尤其注意爪部和小鼠腹侧。应使用湿润的软布或湿纸巾以单次、平滑的动作清除脱毛膏。避免用力擦拭去除脱毛膏，以免造成小鼠暴露皮肤的擦伤。

可通过观察或组织学方法评估局部递送至腹股沟淋巴结（LN）的情况。注射过程中可通过肉眼监测淋巴结体积变化，作为注射是否成功的指标。预期结果包括递送物质在淋巴结结构内高效分布，且无明显泄漏至邻近组织或细胞。此外，由于注射液体置换或稀释了淋巴结内的示踪剂，注射后染料浓度或着色应有所减弱。对组织的观察应显示淋巴结结构完整但体积增大，这是由于液体注入所致。可能遇到的挑战包括注射速度过快或未准确进入淋巴结，这两种情况均可能导致液体渗入周围皮下组织。这些不良结果可通过尸检或组织学检查加以确认，此时可见颗粒悬浮液扩散至非靶向淋巴结以外的细胞和组织。相反，预期结果应为观察到因颗粒滞留在淋巴结内部结构中而导致的腹股沟淋巴结肿大。如图2C和2D所示，通过对切除的淋巴结进行组织学处理，可明确证实递送物质已成功到达淋巴组织。需要注意的是，图2中的颗粒含有荧光标记的载荷，以便在注射过程、组织学处理以及荧光显微镜观察期间实现载荷的可视化。

图1. 脂质稳定颗粒的合成与表征。 A) 通过乳化/溶剂蒸发法制备脂质稳定颗粒的合成过程示意图。 B) 微粒（实线，直径 = 2.8 μm）和纳米颗粒（虚线，直径 = 113 nm）的粒径分布。 C) 载有荧光标记肽和荧光颗粒染料的颗粒的荧光显微镜图像。标签：肽（绿色）和颗粒（红色）。 点击此处查看高分辨率图像。

图2. 淋巴结内注射（i.LN.）及可降解颗粒在淋巴结（LN）内的分布。 A) 淋巴结内注射（i.LN.）的操作方法。 B) 通过皮肤观察小鼠淋巴结（上图）以及解剖后观察淋巴结（下图）⁵。 C) 淋巴结的组织学染色结果，证实荧光标记的聚合物微粒在淋巴结内的沉积与分布情况（颗粒，绿色；T细胞，红色；B细胞，蓝色）。 D) 注射后24小时，淋巴结中荧光标记的纳米颗粒（50 nm，左图）和微粒（6 µm，右图）的分布情况。 点击此处查看高清图像。

讨论

本方案所述技术可实现向淋巴结及淋巴结内抗原呈递细胞的可控递送疫苗。通过生物材料包封的载荷可定位于淋巴结内，从而调控递送至淋巴结微环境中的单种或多种载荷的剂量。聚合物颗粒的定位与可控释放已被证实可在显著低于传统方法的剂量下诱导强烈的细胞免疫和体液免疫反应。此外，通过调控生物材料载体的尺寸，可调节细胞处理的主要模式，即在纳米颗粒的直接摄取与较大微粒的胞外载荷释放之间进行调控。⁵. 这些结果证实了该方法的可行性 i.LN. 作为一种治疗性疫苗递送平台的生物材料递送

采用乳化/溶剂蒸发法制备PLGA颗粒已在药物递送应用中被广泛使用^23,24因此，该技术相关的潜在挑战主要在于能否成功识别并准确将疫苗递送至淋巴结靶向部位。尽管示踪染料的使用有助于可视化目标腹股沟淋巴结，但其体积较小且位于皮下较深位置。因此，作者建议预留充足的时间和实验小鼠用于练习动物准备及注射操作。在动物准备过程中即 剃毛和使用脱毛剂时，应避免在小鼠腹部进行操作，因为四肢与腹部之间的角度使得该区域的皮肤更容易被剪毛工具损伤。此外，需用温水彻底清除所有脱毛剂残留，以防止小鼠在日常理毛行为中摄入脱毛膏。为练习淋巴结注射，可使用较高浓度的示踪染料，并对练习用动物实施安乐死后再进行多次注射操作。注射后可对小鼠进行解剖，比较注射侧淋巴结的大小与未注射对照侧淋巴结的差异。该技术的一个局限性在于淋巴结结构所能容纳的注射体积存在物理限制。本方案建议注射体积为10 µl 在小鼠中，尽管其他研究报道的注射体积更大，至少可达20 µl。¹³ 然而，通过直接递送疫苗的方式 i.LN. 注射可实现显著的剂量节约，因此这些疫苗的功能通常不应受体积限制的影响。

如前所述，改变颗粒的物理特性（即 尺寸）是一种有效机制，可改变生物材料及其包载货物在淋巴结组织中诱导的途径或结果。乳化/溶剂蒸发法可轻松进行修改，以调节颗粒的物理或化学性质，例如表面电荷或功能基团，以及生物降解/货物释放速率^23,24。例如，可通过改变聚合物组成来调节释放动力学，也可通过使用改性脂质组成或聚乙烯醇来改变颗粒表面功能。颗粒中所载货物可方便地进行调控，以包含针对特定病原体的不同抗原或佐剂。该策略的优势在于将 i.LN.递送与生物材料在局部的可控释放相结合。这种协同作用构建了一个可被利用的平台，能够以极低剂量高效诱导适应性免疫应答，并减少非特异性或全身性副作用。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱 1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱 (DOPC)	Avanti Polar Lipids	850375	氯仿中储存液浓度为 10 mg/ml
1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-[氨基(聚乙二醇)-2000] 铵盐 (DSPE-PEG)	Avanti Polar Lipids	880128	氯仿中储存液浓度为 10 mg/ml
1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷氯化物 (DOTAP)	Avanti Polar Lipids	890890	氯仿中储存液浓度为 10 mg/ml
聚乳酸-共-乙醇酸 (PLGA)	Sigma-Aldrich	P2191	乳酸:乙醇酸 (50:50)，分子量 30,000–60,000
二氯甲烷 (DCM)	VWR	BDH1113
异氟烷	Vetone	502017
Nair	Nair
伊文思蓝示踪染料	VWR	AAA16774-09
U-100 BD 超细短型胰岛素注射器，31 G，针长 5/16 英寸	VWR	BD328418
一次性针头，BD 医疗，21 G，针长 1.5 英寸	VWR	BD305167
带 BD 鲁尔锁扣接头的注射器，BD 医疗，1 ml	VWR	BD309628
Falcon 细胞筛，无菌，Corning，40 µm	VWR	21008-949
Vybrant DiD 细胞标记溶液	Invitrogen	V-22887
Fluoresbrite YG 荧光微球，6.00 µm	Polysciences	17149
Fluoresbrite YG 荧光微球，0.05 µm	Polysciences	17156
卵清蛋白，纯化	Worthington Biochemical	LS003056
Qsonica 超声波破碎仪 Q125	Qsonica	Q125	直径 1/8 英寸的微尖探头
Ultra-Turrax T 25 数字化匀浆机	IKA	YO-04739-22	10 G 分散元件
荧光显微镜	Olympus	IX-83
激光衍射粒径分布分析仪	Horiba	LA-950	包含配套的比色皿式玻璃分级池
Wahl Professional 8685 经典花生式电推剪	Wahl