我们描述了用于研究转染的荧光蛋白在内质网（ER）中分布与移动性的成像方法，该方法通过共聚焦成像技术对活细胞进行观察。同时，我们还从超微结构层面分析了这些蛋白表达对该亚细胞区室结构的影响。
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摘要
摘要
真核细胞中的脂质和蛋白质在细胞器之间持续交换，尽管各细胞器在频繁的分子运输过程中仍保持其独特的组成和功能。本文所述技术是研究蛋白质和脂质流动性及运输的有力手段 体内 及其生理环境中的动态过程。光漂白后荧光恢复（FRAP）和光漂白中荧光丢失（FLIP）是广泛应用于活细胞成像的技术，可用于研究通过胞吐-胞吞途径的细胞内转运、细胞器或亚区室之间的连续性、蛋白质复合物的形成以及蛋白质在脂质微区中的定位，这些过程均可在生理和病理条件下进行观察。这些方法的主要局限性源于使用荧光融合蛋白，其潜在缺点包括在细胞中人为过表达，以及标记蛋白与天然蛋白在折叠和定位上可能存在差异。最后，由于光学显微镜的分辨率极限（约200 nm），无法对内质网的精细结构或细胞在应激条件下可能形成的特定亚区室进行深入研究即 缺氧、药物给药、跨膜内质网驻留蛋白的过表达）或在病理条件下，我们结合转染培养细胞的活细胞成像与基于透射电子显微镜的超微结构分析。
引言
绿色荧光蛋白（GFP）及其光谱变体的发现，以及荧光显微镜技术的同步发展，为研究蛋白质在细胞内的行为开辟了全新的途径。荧光漂白后恢复（FRAP）和荧光漂白损失（FLIP）等技术正是基于荧光分子在强光照射下可逆地熄灭其荧光的内在特性而建立的，这些技术依赖于共聚焦活细胞成像和转染表达的荧光融合蛋白1-3。这些方法不仅广泛用于评估蛋白质的亚细胞定位，还可用于研究其移动性和囊泡运输过程，从而揭示有关其功能的重要线索4。
真核细胞的独特特征在于其具有特定脂质和蛋白质组成的细胞内区室。尽管细胞器在物理上相互隔离，但它们需要彼此间进行通讯并共享分子组分，以维持细胞稳态。分泌途径可确保在内质网中合成的蛋白质和脂质被准确地运送至其发挥功能的最终目的地。细胞内细胞器还可通过动态的接触位点相互连接，从而允许分子（如脂质）在不同区室之间直接交换。此外，许多蛋白质需要组装成大型异源复合物，或与特定种类的脂质（如脂筏/微区）结合，才能获得功能活性或被运输至其最终定位位置。上述这些生物学过程显著影响蛋白质的动力学特性，因此可通过下述技术进行恰当研究。
我们的研究团队已广泛采用荧光漂白恢复技术（FRAP）和荧光损失法（FLIP）结合电子显微镜，用于研究内质网的结构及其不同亚区域。内质网是分泌途径的第一站，在蛋白质和脂质分选过程中发挥关键作用5。它是一种高度动态的细胞器，其不同的亚结构区域反....
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方案
1. 质粒、细胞培养及内质网荧光蛋白转染
- 本研究中使用的质粒包含一种增强型绿色荧光蛋白（GFP），其C末端通过一段连接序列与大鼠细胞色素b(5)内质网亚型（本文简称为b(5)）的尾部区域融合。该尾部区域含有在胰蛋白酶切割天然b(5)后仍与膜结合的完整序列（Pro94-Asp134），其中包括17个氨基酸残基的跨膜结构域（TMD），其上下游分别由极性序列（UPS和DPS）包围。连接序列由myc表位和[(Gly)4Ser]3组成，整个cDNA插入哺乳动物表达载体pCDNA3的Hind3-Xba1位点。该质粒构建的详细信息已在先前发表的研究中描述，其中将其命名为GFP-ER16。
- 在37 °C、10% CO2的培养箱中，使用添加10%胎牛血清、2 mM L-谷氨酰胺和1%青霉素/链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）培养COS-7细胞。
- 转染。将3 × 105个细胞接种于6孔板中的圆形玻璃盖玻片上，次日按照制造商说明使用JetPEI系统进行转染。请注意，已针对不同质粒和细胞系优化了JetPEI/DNA的最佳比例以实现最高转染效率：在本实验条件下，JetPEI:DNA比例为2:1时，转染效率可达70–80%。
2. 活细胞荧光扫描共聚焦显微镜
- 活细胞成像。将转染细胞接种....
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结果
图2展示了一项蛋白质移动性的荧光漂白后恢复（FRAP）研究示例。dEGFP-ER蛋白的移动性通过在被漂白的OSER区域中荧光信号的快速恢复得以体现。为进行定量分析，通过拟合以下单指数方程，从实验测得的数据中推导出半恢复时间与可移动组分比例：
F(t) = Fpost + (Frec-Fpost)(1-e-t/τ)
其中 Fpost 为光漂白后的荧光信号，Frec 为漂白后达到的最大荧光恢复值，t 为记录时间， τ 为时间常数。
请注意，在图像采集过程中必须避免像素饱和，因为饱和可能改变荧光恢复，从而影响蛋白质迁移率的分析。此外，必须始终将漂白区域（ROI）内的荧光信号归一化为同一细胞的总荧光强度，以校.......
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讨论
本文所述的实验方案和成像方法已被用于研究转染后定位于活细胞内质网中的TA荧光蛋白的分布与移动性。我们还通过超微结构分析，研究了这些蛋白过表达对该细胞器亚细胞结构的影响。
活细胞共聚焦成像与电子显微镜技术的结合是研究蛋白质动态特性的强有力手段，可为蛋白质功能提供重要信息。所述方法耗时较短（通常需三天工作时间），且随着大量用户友好型图像采集与分析软件的开发，基于光漂白的活细胞成像已变得相对简便。
这些技术的主要局限性在于使用荧光融合蛋白，因为荧光标签可能影响目标蛋白的正确折叠和/或组装。此外，过表达可能改变转染后荧光标记蛋白的行为，因而无法真实反映内源性蛋白的实际特性；然而，通过使用可诱导且稳定转染的细胞系，可精确调控表达水平，使其与内源性蛋白的表达水平相当，从而克服这一问题1,7。荧光蛋白（FPs）易于发生寡聚化的倾向已有广泛报道，可能显著改变嵌合蛋白的行为（即 动力学特性、非预期的蛋白质-蛋白质相互作用以及聚集体的形成）。因此，应考虑使用经过优化的单体荧光蛋白17。.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢Fondazione Filarete在本文发表过程中提供的帮助与支持。我们还要感谢Centro Europeo di Nanomedicina提供TECNAI G2透射电子显微镜的使用。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 杜尔贝科’s 改良伊格尔培养基（DMEM） | Invitrogen | 41966029 | |
| 杜尔贝科’不含酚红的改良型伊格尔培养基（DMEM） | Invitrogen | 31053028 | |
| 胎牛血清（FBS） | Invitrogen | 10270106 | |
| 青霉素/链霉素 | Invitrogen | 15140-122 | |
| L-谷氨酰胺 200 mM 溶液 | Invitrogen | 25030-024 | |
| jetPEI | Polyplus 转染 | PP10110 | |
| OxyFluor | Oxyrase 公司 | OF-0005 | |
| 戊二醛 I 级 | Sigma Aldrich | G5882 | |
| 三水合二甲胂酸钠 | Sigma Aldrich | C0250 | |
| 四氧化锇 4% 溶液 | 电子显微镜科学 | 19150 | |
| 乙酸铀酰二水合物 | Sigma Aldrich | 73943 | 微弱放射性 |
| 环氧丙烷 | Sigma-Aldrich | 82320 | |
| EPON包埋介质试剂盒 | Sigma-Aldrich | 45359-1EA-F | |
| 柠檬酸铅 | 电子显微镜科学 | 17800 | |
| 台式离心机 | Eppendorf | 5415 D | |
| 共聚焦光谱显微镜 | 徕卡显微系统 | TCS SP5 | |
| CO2 显微镜培养箱孵育系统 | OkoLab | ||
| 超薄切片机 | Leica Microsystems | UC6 | |
| 金刚石刀 | 硅藻 | Ultra 45 ° | |
| 透射电子显微镜 | FEI | Tecnai G2 | |
| GraphPad Prism 软件 | GraphPad Software, Inc | ||
| 用于24 mm盖玻片的钢制培养细胞腔室 | 生物科学工具 | CSC-25 | |
| 电子显微镜载网 | 电子显微镜科学 | G300Cu |
参考文献
- Fasana, E., et al. A VAPB mutant linked to amyotrophic lateral sclerosis generates a novel form of organized smooth endoplasmic reticulum. FASEB J. 24, 1419-1430 (2010).
- Borgese, N., Francolini, M., Snapp, E. Endoplasmic reticulum....
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