啮齿类动物成神经细胞的核转染以研究成神经细胞迁移 体外

摘要

神经母细胞迁移是出生后神经发生过程中的关键步骤。本方案可用于研究候选调控因子在神经母细胞迁移中的作用，方法是利用DNA/短发夹RNA（shRNA）核转染技术，结合从啮齿类动物出生后前脑迁移流中分离的神经母细胞进行三维迁移实验。

摘要

位于侧脑室侧壁的脑室下区（SVZ）在成年神经发生过程中起着至关重要的作用。在这一脑内特定区域，神经干细胞不断增殖并持续产生神经前体细胞，这些神经前体细胞以成链状的形式沿吻侧迁移流（RMS）进行切向迁移，最终到达嗅球（OB）。一旦抵达嗅球，神经前体细胞便转为径向迁移，并进一步分化为成熟的神经元，进而整合到已有的神经网络中。神经前体细胞的正确迁移是神经发生过程中的关键步骤，可确保新生神经元实现正常的功能成熟。鉴于SVZ来源的神经前体细胞具有向脑内损伤区域迁移的能力，研究其运动行为背后的细胞内机制，不仅有助于深入理解神经发生过程，还可能推动神经再生策略的发展。

本文描述了一种针对原代啮齿类动物出生后 RMS 神经母细胞进行转染的详细方案，并介绍了利用三维环境分析其迁移能力的方法 体外 迁移实验重现了所观察到的其迁移模式 体内大鼠和小鼠的神经前体细胞均可通过核转染法快速高效地转染质粒DNA、靶向目的基因的小发夹（sh）RNA或短干扰（si）RNA寡核苷酸。为分析细胞迁移，将转染后的细胞在“悬滴”中重新聚集，随后嵌入三维基质中。核转染 本身 不会显著影响成神经细胞的迁移。也可对核转染并重新聚集的成神经细胞进行药物处理，以研究信号通路在成神经细胞迁移中的作用。

引言

在哺乳动物出生后的脑中，新神经元的生成（神经发生）终生持续进行，并局限于两个神经发生微环境：侧脑室的室下区（SVZ）和海马齿状回的颗粒下区¹。近年来多项研究表明，成年期神经发生在促进学习和记忆任务中具有重要作用^2,3。此外，脑损伤后神经前体细胞增殖与募集的证据^4-7提示，通过药物激活神经发生以促进神经修复具有潜在可能性。

出生后的神经发生过程在其各个阶段均受到严格调控，包括神经前体细胞的增殖、迁移、分化、存活以及新生神经元最终的突触整合⁸。起源于侧脑室下区（SVZ）干细胞的神经前体细胞（即神经母细胞）通过前移迁移流（RMS）长距离迁移至嗅球（OB），并在该处成熟为具有功能的神经元⁹。迁移中的神经母细胞主要呈单极形态，细胞体细长，并延伸出一条单一的前导突起。这些细胞以链状结构进行集体迁移，彼此间相互滑行¹⁰。迁移是SVZ来源前体细胞进一步成熟为功能性神经元的关键步骤¹¹，该过程受多种因子和导向分子调控，包括：多聚唾液酸化神经细胞黏附分子（PSA-NCAM）¹²、Ephrins¹³、整合素（integrins）¹⁴、Slits¹⁵、生长因子¹⁶以及神经递质¹⁷。然而，这一过程背后的分子机制尚未完全阐明。研究调控神经母细胞迁移的细胞内信号通路，不仅有助于深入理解成体神经发生机制，也将为促进脑损伤修复的新疗法开发提供重要依据。

本文描述了一种研究神经母细胞迁移候选调控因子作用的详细实验方案 体外 使用核转染和三维迁移实验。核转染是一种基于改进电穿孔方法的细胞转染技术。通过细胞类型特异性的电流和核转染溶液，可将多聚阴离子大分子（如DNA和shRNA载体以及siRNA寡核苷酸）直接导入细胞核内，从而实现对分裂缓慢或有丝分裂不活跃的细胞（如胚胎细胞和哺乳动物神经元）的转染。¹⁸该方法快速、操作相对简便，可实现多种细胞类型的高效转染，包括原代神经母细胞和神经元，且转染结果具有高度可重复性。^19-21.

RMS 组织的解离可分离出具有迁移能力的成神经细胞，这些细胞可成功转染含目的基因的 DNA/shRNA 载体或靶向特定基因的 siRNA 寡核苷酸。转染后，成神经细胞在悬滴中重新聚集成团，随后包埋于三维 Matrigel 基质中。在此条件下，成神经细胞可从细胞聚集体中迁移而出，重现体内观察到的迁移模式 体内因此为研究神经母细胞迁移相关的信号通路以及评估药理学处理对这些细胞运动能力的影响提供了理想的模型系统。

方案

本操作程序符合英国国内事务部法规（《1986年动物科学程序法案》）。科研人员应遵循其所在机构及国家动物管理机构制定并批准的指导方针。

1. 大鼠 RMS 神经母细胞的解剖与分离

1. 准备 RMS 解剖和解离所需的溶液：

解剖液 (100 ml)
Hank's 平衡盐溶液 (HBSS) - 98.5 ml
5 M HEPES，pH 7.4 - 0.5 ml
青霉素-链霉素溶液（10,000 单位/ml 和 10,000 µg/ml）- 1 ml

解离液（2 ml）
HBSS - 1.760 ml
10x 胰蛋白酶（2.5%）- 200 µl
DNAse1（1 mg/ml）- 40 µl

杜氏改良伊格尔培养基 (DMEM) + 10% 胎牛血清 (FCS) (40 ml)
DMEM - 36 ml
FCS - 4 ml

完全培养基（12 ml）

Neurobasal 培养基 - 11.46 ml
B27 添加剂 - 250 µl
L-谷氨酰胺（200 mM）- 125 µl
葡萄糖（45%）- 165 µl

2. 使用滤器对DMEM + 10% FCS和完全培养基进行除菌过滤，并在37 °C、5% CO₂培养箱中预平衡。

1. 解剖
   1. 通过颈椎脱位处死一窝P6-P7大鼠（约12只幼鼠），并用剪刀断头。
   2. 使用手术刀沿从鼻部至小脑的矢状缝做一条前后方向的皮肤切口。剥离皮肤，并沿颅骨重复做相同的切口。
   3. 用镊子轻轻移除颅骨瓣，再用刮勺小心取出脑组织，注意保留嗅球。
   4. 切除脑组织最尾端的三分之一并弃去。
   5. 将脑组织切成 1.4 mm 使用组织切片机制备厚冠状切片。
   6. 将切片置于含有冷解剖液的培养皿中，并用针小心分离。
   7. RMS在OB切片的中央呈现为一个三角形、半透明的区域，在更靠尾侧的脑切片中则表现为一个小的圆形区域。使用显微外科刀从每一片切片中切下RMS，注意避免包含周围组织。在出生后7天的大鼠幼鼠中，通常最靠头侧的约8个切片（包括OB）含有RMS。
   8. 用塑料巴斯德吸管收集RMS组织碎片，放入盛有冰冷解剖液的小培养皿中，并置于冰上。
   9. 解剖完成后，用塑料移液管将RMS组织碎片转移至15 ml离心管中，静置使碎片沉降至管底。
2. 解离
   1. 用2 ml解离液替换解剖液。
   2. 使用 P1000 移液器轻轻吹打 RMS 组织碎片悬液，上下吹打约 10 次。
   3. 将装有组织碎片的离心管置于37 °C水浴中孵育2 min。
   4. 用移液器再次吹打溶液10次，确保组织块已充分解离（悬液应变得浑浊）。
   5. 加入5 ml预热的DMEM + 10% FCS以灭活胰蛋白酶。
   6. 将细胞悬液在433 x g下离心5分钟。
   7. 同时，将所需量的 siRNA/DNA 分装至 Eppendorf 管中（通常每次核转染使用 3–5 µg DNA/shRNA 或 5–9 µg siRNA 寡核苷酸，但 DNA/siRNA 的用量可能需要优化）。
   8. 吸除多余培养基，用5 ml预热的DMEM + 10% FCS轻柔吹打重悬细胞沉淀。
   9. 进行细胞计数。预期 ~1 × 10⁶ 每只幼鼠大脑的细胞数。至少 2.5 x 10⁶ 每次核转染需要一定数量的细胞，而使用 3-4 x 10⁶ 个细胞可获得最佳结果。⁶ 每次核转染的细胞数。
   10. 将细胞悬液在433 x g下离心5分钟。确保 尽可能移除培养基。

2. 核转染

1. 立即将细胞沉淀重悬于先前在室温下孵育的大鼠（或小鼠，若使用小鼠细胞）神经元核转染溶液中，每次核转染使用 100 µl。注意：通常一窝12只大鼠幼崽足以进行4次核转染，一窝12只小鼠幼崽足以进行2次核转染。
2. 将100 µl细胞悬液转移至各含有siRNA/DNA的Eppendorf管中，并用P200移液器轻柔吹打混合2–3次。
3. 将样品（细胞-DNA/siRNA悬液）加至核转染比色杯底部，注意避免产生气泡。
4. 使用程序G-013（适用于大鼠细胞）或O-005（适用于小鼠细胞）进行核转染。每次核转染约需5秒。
5. 迅速向核转染后的样品中加入1 ml预热的DMEM + 10% FCS。
6. 对所有其他样品重复步骤2.4和2.5。注意：为获得最佳结果，整个核转染过程不应超过5分钟。
7. 使用核转染试剂盒提供的塑料移液管，将每个样品转移至含有5 ml预热DMEM + 10% FCS的15 ml离心管中。避免将任何细胞碎片转移至管中。
8. 以433 × g离心5分钟。
9. 小心去除所有过量培养基，并用P20移液器将沉淀重悬于25–30 µl预热的DMEM + 10% FCS中。所用培养基不得超过30 µl。
10. 用移液器将悬液以液滴形式加至p35培养皿盖内侧壁。
11. 将皿盖倒置，覆盖在含有2 ml完全培养基的p35培养皿上（参见图1）。
12. 置于培养箱（37 °C/5% CO₂）中孵育至少5小时，最长可达7小时。较长的孵育时间有助于细胞簇更好地重新聚集。
13. 使用剪去尖端的P1000移液器，将悬滴从皿盖转移至培养皿中的完全培养基中。
14. 对于DNA核转染，于37 °C/5% CO₂培养24小时；对于siRNA/shRNA核转染，培养48小时。

3. 包埋

1. 准备完全培养基（25 ml），并在 37 °C、5% CO₂ 条件下预平衡数小时。
2. 从 -80 °C 冰箱中取出基底膜基质的冷冻分装样品，在冷室中置于冰上解冻。
3. 每轮核转染准备一个 6 cm 培养皿，内含最多八个 13 mm 无菌盖玻片。
4. 将培养皿放置在覆盖保鲜膜的冰盒上。在包埋过程中保持盖玻片低温至关重要，以防止基质过早凝固。
5. 为维持湿度，将一条湿润的纸巾置于一个 15 cm 培养皿内，该培养皿将用于盛放最多三个含有包埋神经母细胞的 6 cm 培养皿。
6. 按 1:3 的比例将完全培养基加入解冻后的基质中。例如，用移液器将 40 µl 完全培养基与 120 µl 基质混合。此体积的基质足以用于在八个 12 mm 盖玻片上包埋细胞团块。
7. 将重聚集的细胞团转移至 15 ml 离心管中，在 433 × g 条件下离心 5 分钟。
8. 去除多余培养基，将沉淀重悬于 10 µl 完全培养基中。
9. 将 2 µl 细胞团悬液滴加至每个无菌盖玻片上，再加入 18 µl 基质与完全培养基的混合液。使用移液器枪头将基质均匀铺展至整个盖玻片表面。
10. 立即将含有盖玻片的 6 cm 培养皿放入 15 cm 培养皿中，并置于培养箱（37 °C、5% CO₂）内孵育 15–20 分钟。待基质凝固后，小心向每个 6 cm 培养皿中加入 5 ml 完全培养基，注意用移液器枪头压下任何漂浮的盖玻片。
11. 在 37 °C、5% CO₂ 条件下继续孵育 24 小时，使神经母细胞从细胞团块中迁移出来。

4. 三维迁移实验

1. 配制免疫染色所需的溶液。
   1. 配制封闭液：
      山羊封闭液（50 ml）
      磷酸盐缓冲液（PBS）— 5 ml
      山羊血清 - 7.5 ml
      10% Triton X-100 - 1.5 ml
      BSA - 50 mg
      H₂O - 36 ml
   2. 过滤后于 4 °C 保存。
   3. 制备固定液：
      固定液（100 ml）
      多聚甲醛（PFA）— 4 g 注意：操作PFA时务必在通风橱中进行
      蔗糖 - 20 g（可选）
      PBS 定容至 100 ml
   4. 在加热板上，于65 °C的80 ml PBS中持续搅拌，溶解PFA。
   5. 待PFA溶解后，加入20 g蔗糖。
   6. 调节 pH 至 7.4（通常通过添加 ~每100 ml溶液加入60 µl 1 M NaOH。
   7. 用 PBS 定容至 100 ml。
2. 免疫染色
   1. 将盖玻片放入24孔板中。
   2. 用 PBS 冲洗盖玻片 2 次。
   3. 在室温下用固定液固定RMS神经母细胞聚集体45分钟。
   4. 用 PBS 洗涤盖玻片 3 次（每次 5 分钟，置于摇床上）。
   5. 封闭30-60分钟 用山羊封闭液。
   6. 将一抗用山羊封闭液稀释后，于 4 °C 过夜孵育。（如需要，可将荧光标记的鬼笔环肽（1:400）和 Hoechst 染料（1:10,000）一并加入一抗溶液中，以显示丝状肌动蛋白和细胞核）。
   7. 用 PBS 冲洗盖玻片 3 次 （每次洗涤5分钟）
   8. 在山羊封闭液中稀释二抗，室温孵育2小时。
   9. 用 PBS 冲洗盖玻片 3 次 （每次洗涤5分钟）
   10. 用荧光封片剂封固盖玻片，并在室温下静置过夜使其干燥。
3. 迁移分析
   1. 使用10X物镜的荧光显微镜拍摄固定后的RMS神经母细胞聚集体的图像 目标。在样本图像中添加比例尺。
   2. 为建立定量标尺，使用 ImageJ 工具栏中的“直线”工具测量图像中的标尺。
   3. 选择“分析”选项，然后点击“设置比例尺”。
   4. 在比例窗口中设置“已知距离”，并勾选“全局”框，以保持所有测量的设置一致。
   5. 使用 ImageJ 工具栏中的“分段线”工具，测量从类器官边缘到周围 6 个不同扇形区域中迁移最远的神经母细胞之间的距离图3B仅考虑分离的聚集体进行分析。
   6. 根据每个聚集体获得的6个数值计算平均迁移距离。
   7. 每个独立实验中，每种条件下测量10-20个聚集体，并汇总至少三个独立实验的结果。务必包含核转染对照（例如. GFP 或对照 sh/siRNA）。

结果

神经母细胞可成功地从分离的 RMS 组织（图 1A）中分离，并嵌入三维基质中。从大鼠或小鼠出生后 RMS 分离的细胞对迁移性神经母细胞标志物呈免疫阳性，例如双皮质素（DCX）、βIII 微管蛋白或 PSA-NCAM（图 1B-C）。

分离的成神经细胞可高效地通过核转染导入DNA（例如，编码GFP的质粒，图2）或shRNA质粒（图4），以实现蛋白耗竭，其效果可通过Western印迹分析（图4B）或免疫荧光（未展示）进行评估。

转染了编码GFP质粒的细胞从重新聚集的神经母细胞簇中径向迁移出来图3A). 包埋后24小时相对迁移距离的定量分析图3B) 显示GFP阳性细胞与GFP阴性、未核转染细胞之间的迁移无差异（图3C），表明核转染 本身 不会影响迁移。核转染的神经母细胞与直接从RMS外植体迁移出的神经母细胞在迁移程度上亦无显著差异（数据未显示）。

图1. RMS神经母细胞的分离。（A）RMS神经母细胞分离过程的示意图。详细描述请参见正文。（B）分离的大鼠RMS细胞对迁移性神经母细胞标志物DCX和βIII微管蛋白呈免疫阳性。比例尺，20 µm。（C）从小鼠RMS组织块迁移出的细胞表达迁移性神经母细胞标志物DCX和PSA-NCAM。比例尺，20 µm。 点击此处查看高分辨率图像。

图2. 小鼠神经母细胞核转染。 解离的小鼠 RMS 神经母细胞通过pMAX-GFP进行核转染，重新聚集后包埋于三维基质中，并使其迁移6小时。从重新聚集的细胞簇迁移出的神经母细胞（上方，相差图像）显示出高效的转染效率（下方，GFP荧光通道图像）。右列图像为左列图像中所示 inset 区域的高倍放大图。比例尺， 20 µm. 单击此处以查看大图.

图3. 三维迁移实验。（A） 大鼠神经前体细胞通过核转染导入pMAX-GFP（GFP）或pCAG-IRES-EGFP²²（EV），重新聚集后包埋于基质中，并培养24小时以允许细胞迁移。随后固定细胞，并对GFP（绿色）和βIII微管蛋白（红色）进行免疫荧光染色。标尺：50 µm。（B） 使用ImageJ测量迁移距离。将重新聚集的细胞团划分为6个相等的扇形区域，分别测量每个扇形内细胞团边缘（虚线）至最远迁移细胞之间的距离。（C） 对转染细胞（GFP阳性）与对照组未转染细胞（GFP阴性）的相对迁移距离进行定量分析。点击此处查看高分辨率图像。

图4. shRNA核转染后监测神经母细胞迁移。（A） 大鼠神经母细胞通过核转染法转染了对照shRNA载体（pCA-b-EGFPm5 Silencer 3，该载体同时表达EGFP）²³）或含有靶向fascin（一种肌动蛋白成束蛋白）的shRNA的相同载体²⁴细胞经48小时重新聚集后，包埋于基质中并迁移24小时。随后固定聚集体，并对GFP（绿色）和βIII微管蛋白（红色）进行免疫染色。比例尺， 50 µm. (B) 有效fascin shRNA 核转染后 50 小时可通过 Western 印迹分析检测到蛋白耗竭。此处以肌动蛋白作为上样对照。 （C） 相对迁移距离的定量分析显示，fascin 耗竭显著损害神经母细胞迁移（均值 ± 标准误；**p < 0.01，***p < 0.001）<0.01；n=3 次独立实验。 单击此处查看大图.

讨论

神经母细胞沿嗅束迁移路径（RMS）迁移到嗅球（OB）的最终位置，是出生后神经发生过程中的一个基本步骤。然而，调控这一复杂过程的分子机制远未被充分阐明。

此处描述的实验方案可用于研究神经母细胞的迁移 体外我们改进了先前发表的从新生早期小鼠或大鼠中分离纹状体下区神经母细胞的实验方案²⁵为了获得最佳结果，掌握解剖步骤至关重要，因为必须尽量缩短解剖与核转染之间的时间间隔。核转染后，神经母细胞可重新聚集，包埋于三维基质中，并使其迁移24小时。或者，若目的并非研究迁移（例如 免疫荧光或蛋白质印迹分析）后，细胞可立即接种于多聚鸟氨酸/层粘连蛋白包被的盖玻片上，其存活时间可达4-5天。小鼠和大鼠的成神经细胞在Matrigel中的迁移程度相似，但小鼠细胞相较于大鼠细胞更倾向于以链状形式迁移。

根据研究目的，可将编码荧光蛋白或目的野生型/突变型蛋白的不同质粒转染至神经前体细胞。为实现最佳蛋白表达，强烈推荐使用带有CAG启动子（包含CMV增强子的β-actin启动子及β-globin多聚腺苷酸尾）²⁶的质粒。此外，可通过核转染siRNA寡核苷酸或shRNA质粒以敲低目的靶基因。有效的蛋白耗竭可通过免疫荧光或蛋白质印迹进行检测（通常使用50 µl标准裂解缓冲液裂解1只新生大鼠来源的包埋聚集体）。

核转染是一种相对简单的方法，可用于转染原代神经母细胞，相较于病毒载体介导的转染，具有更简便、快速的优势，并可实现较高的转染效率（约70–80%）。在核转染操作过程中必须迅速进行，因为神经母细胞在核转染溶液中停留时间过长会显著降低细胞活力。

P7小鼠RMS分离的平均细胞产量相对较低（~5 × 10⁵ 细胞/脑组织）与P7大鼠相比（~1 × 10⁶ 细胞/脑组织）以及至少 3 x 10⁶ 每次核转染所需的细胞数以实现转染 ~50%的转染效率。此外，与小鼠神经母细胞相比，大鼠神经母细胞似乎对核转染具有更强的耐受性。因此，出生后早期（P6-P7）的大鼠幼崽可能是一种较为理想的神经母细胞来源，尤其考虑到大鼠与小鼠的吻侧迁移流（RMS）结构极为相似。²⁷ 大鼠和小鼠神经母细胞迁移的程度 体外 也具有可比性。建议将核转染后的神经母细胞重聚簇在悬浮状态下培养不超过48小时，以避免对细胞形态和迁移产生异常影响（未发表观察结果）。

此处所述的3D实验可用于在细胞包埋于基质后某一固定时间点定量神经母细胞的迁移例如24小时）。在分析中可使用不同大小的细胞团，因为细胞团大小与迁移距离之间无显著相关性（未发表观察结果）。为可视化并进一步研究神经母细胞迁移的动力学过程，可采用延时成像技术。建议在包埋后24小时内进行迁移分析，因为神经母细胞的迁移速度在更长时间点后似乎显著下降（未发表观察结果）。

该方案存在一些局限性。首先，核转染目前仅可用于早期出生后啮齿类动物的成神经细胞，而对于成年成神经细胞，病毒载体感染仍是转染效率最高的方法。²⁸其次， 体外 迁移实验未能完全重现所观察到的 RMS 复杂结构 体内确实，尽管神经母细胞保持了以类似于其 体内 对应物相比，在本实验设置中，它们缺乏与其他RMS组分（如星形胶质细胞和血管）的相互作用，而这些组分也参与调控其迁移能力^9,29,30这一问题未来可能通过优化三维共培养模型系统来解决。

总之，将核转染与三维迁移实验相结合，是深入理解神经母细胞迁移分子机制的有力工具。该实验方法提供了一种初步、快速且相对简便的手段，用于评估候选调控因子在神经母细胞迁移中的作用，其结果可进一步通过其他方法加以验证。 体内 出生后电穿孔与脑片培养的延时成像^28,31,32.

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
汉克’Hanks 平衡盐溶液 (HBSS)	Invitrogen Life Technologies	14175129
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375-25G
青霉素-链霉素	Invitrogen Life Technologies	15140-122
2.5% 胰蛋白酶-EDTA（10倍浓缩液）	Gibco	15090-046	储存 200 µl 分装于 -20 °C
DNAse I 小瓶 (D2)	沃辛顿	LK003170	≥每瓶1,000单位；储存于50 µl 分装于 -20 °C
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）	Gibco	11960-044
胎牛血清（FCS）	Hyclone	SH3007902
Neurobasal 培养基	Gibco	21103-049
B27添加剂	Invitrogen Life Technologies	17504044
L-谷氨酰胺（200 mM）	Invitrogen Life Technologies	25030-081
D-(+)-葡萄糖溶液（45%）	Sigma-Aldrich	G8769
基底膜基质 Matrigel，生长因子减少型（GFR），无酚红，10 ml，无LDEV	BD 生物科学	356231	准备120 µ4℃下分装保存 °C，然后于 -80 保存 °C
PFA	Sigma-Aldrich	441242
蔗糖	BDH	102745C
山羊血清	Sigma-Aldrich	69023
Triton X-100	VWR International Ltd.	306324N
BSA	Fisher Chemical	BPE9701-100
Dako 荧光封片剂	Dako	S3023
大鼠神经元核转染试剂盒	Lonza	VPG-1003
小鼠神经元核转染试剂盒	Lonza	VPG-1001
显微外科手术刀	Angiotech	7516
McIlwain组织切片机	米克尔实验室工程公司
Nucleofector II	Lonza