通过多光谱成像流式细胞术鉴定富含排核事件的小鼠成红细胞亚群

摘要

本方案描述了一种利用多光谱成像流式细胞术鉴定正在脱核的晚幼红细胞群体的新方法，可实现对红细胞脱核过程的可视化观察。

摘要

哺乳动物的红细胞生成以显著的脱核过程结束，最终形成网织红细胞。目前脱核的机制尚未完全阐明。在通过显微镜研究脱核成红细胞中关键蛋白和结构的定位时，常遇到的一个问题是难以观察到足够数量的正在脱核的细胞。 我们开发了一种新的分析方案，利用流动中的多参数高速细胞成像技术（多光谱成像流式细胞术），该方法结合了免疫荧光显微镜与流式细胞术，能够高效地识别大量脱核事件，从而获取测量数据并进行统计分析。

我们首先在此描述两种 体外 用于同步小鼠成红细胞并提高在评估时捕获脱核事件概率的红细胞生成培养方法。 然后，我们详细描述红细胞前体在固定和透化后的染色步骤，以便通过多光谱成像流式细胞术研究细胞核排出过程中细胞内蛋白质或脂筏的定位。 除了用于鉴定正染色性成红细胞的细胞大小和DNA/Ter119染色外，我们还利用明场通道中的细胞“长宽比”参数，以帮助识别拉长的细胞；同时使用“Ter119/Draq5的XY质心偏移”参数，用于识别Ter119染色信号（新生网织红细胞）的中心与Draq5染色信号（正在脱核的细胞核）的中心相距较远的细胞事件，从而指示即将脱核的细胞。 高delta重心值且低长宽比的正色性成红细胞亚群中，去核细胞高度富集。

引言

哺乳动物红细胞谱系中的终末分化以显著的脱核过程告终，正染色性成红细胞在此过程中排出其被膜包裹的细胞核（即染色质小体）¹，生成网织红细胞²该过程的确切机制，也是红细胞成功大规模生产中的限速步骤 体外，尚未完全阐明。在脱核红细胞前体中，关键蛋白质和结构的定位依赖于荧光显微镜和电子显微镜技术^3-5这一繁琐的过程通常只能鉴定出有限数量的去核事件，且并不总能进行有意义的统计分析。在McGrath先前描述的红系前体细胞鉴定方法基础上进行拓展 等⁶我们开发了一种利用多光谱成像流式细胞术（一种结合荧光显微镜与流式细胞术的多参数高速细胞成像技术）来鉴定和研究去核事件的新方法⁷，可提供足够数量的观测值以进行测量并开展统计分析。

此处，我们首先描述前两个 体外 用于同步红细胞前体并提高在评估时捕获脱核事件概率的红细胞生成培养方法。随后，我们详细描述了红细胞前体在固定和透化后的染色步骤，以便通过多光谱成像流式细胞术研究脱核过程中细胞内蛋白质或脂筏的定位。

样本在成像流式细胞仪上运行，对收集的细胞进行适当的门控以鉴定正染色性成红细胞⁶。随后根据明场成像中测得的长宽比与“Ter119-DNA的X-Y中心偏移差”参数值之间的关系分析正染色性成红细胞，该参数定义为Ter119染色区域中心与DNA染色区域中心之间的距离。长宽比低且Ter119/DNA的X-Y中心偏移差值高的细胞群体中，正在脱核的细胞高度富集。 通过比较野生型（WT）成红细胞与在Rac2^-/-背景或Rac2^-/-; Rac3^-/-双敲除背景下经Mx-Cre介导条件性缺失Rac1的成红细胞，并结合这种新型的多光谱成像流式细胞术分析流程，我们近期证明了脱核过程类似于不对称胞质分裂，且由Rac GTP酶部分调控的肌动球蛋白环的形成对脱核进程至关重要⁷。

方案

长期 体外 红细胞生成培养（离体 由Giarratana提供的红系分化培养方案 等⁸，为小鼠细胞改良与适配

这是一个三步长期方案 体外 红细胞生成方案。第一步（第0-4天）2 x 10⁵ 细胞/ml被置于添加了干细胞因子（SCF）、白细胞介素-3（IL-3）和促红细胞生成素（Epo）的成红细胞生长培养基中。在第二步（第5-6天），细胞被重悬于2 x 10⁵ 细胞/ml，并在仅添加Epo的新鲜成红细胞生长培养基中与贴壁基质细胞（MS5）共培养。第三步（第7-9天），将细胞接种于MS-5细胞层上，在不含细胞因子的新鲜成红细胞生长培养基中继续培养，直至脱核图1A).

所有动物实验方案均经辛辛那提儿童医院医疗中心机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准。

1. 骨骼的采集与低密度骨髓细胞的分离
   1. 在15 ml锥形管中加入2 ml含2%胎牛血清（FBS）的无菌IMDM，并置于冰上保存。
   2. 按照机构批准的方案，处死一只2-6月龄的野生型C57/BL6小鼠（可同时或不同时处死感兴趣的基因靶向小鼠）例如 CO₂ 吸入麻醉，随后进行颈椎脱位。
   3. 使用镊子和手术刀分离骨盆骨、股骨和双侧胫骨，将其加入含有IMDM+2% FBS的离心管中，并置于冰上保存。
   4. 在无菌流式细胞术管中加入1 ml IMDM+2% FBS，使用镊子和带有25 G针头的结核菌素注射器冲洗骨骼 x 5/8" 针头。用 IMDM+2% FBS 缓冲液轻轻冲洗骨骼数次（从细胞悬液中吸取约 500 µl，再通过骨骼冲洗），并将骨髓细胞收集至流式管中。当骨骼呈现白色时，表明冲洗完成。
   5. 将细胞悬液通过置于50 ml锥形管顶部的40 μm细胞筛过滤。用IMDM+2% FBS洗涤细胞筛，并用相同培养基调节细胞悬液终体积至5 毫升
   6. 通过密度梯度离心法制备低密度骨髓细胞（LDBM）：小心地将5 毫升 将细胞悬液置于含5 ml密度梯度细胞分离介质（1.083 g/ml）的15 ml离心管中，于750 × g离心 室温（RT）下25分钟，无刹车/低速加速。
   7. 将上清液（保留至15 ml离心管中约2 ml刻度处，以获取血沉棕黄层）转移至新的15 ml离心管中，用IMDM+2% FBS在525 × g条件下再洗涤一次 5 分钟 室温
   8. 吸弃上清液，将沉淀重悬于3 ml红细胞裂解缓冲液中，裂解残留的红细胞（RBC），室温孵育5分钟 室温。如果在最后一步需要更高纯度的成红细胞（例如 （用于生化研究），在此步骤中进一步将 LDBM 细胞纯化为 Lin^阴性 通过磁分离法分离细胞。
2. 离体 从LDBM或Lin细胞起始的红系分化培养方案^阴性 细胞（图1A)
   1. 加入 7 ml IMDM+2% FBS，以 525 x g 离心 5 分钟 室温下将沉淀的细胞重悬于2 ml红系祖细胞生长培养基（EGM）中，该培养基成分为：
      a. 含有 StemPro-34 培养基，
      b. 2.6% StemPro-34 培养基添加剂，
      c. 20% BIT-9500,
      d. 900 ng/ml 硫酸亚铁，
      e. 90 ng/ml 硝酸铁，
      f. 100 单位/毫升青霉素/链霉素，2 mM L-谷氨酰胺
      g. 10^-6 M 氢化可的松
      h. 并新鲜添加的细胞因子：
      i) 100 ng/ml SCF，
      ii) 5 ng/ml IL-3，以及
      iii) 3 IU/ml Epo。
   2. 使用自动细胞计数器或在显微镜下利用血细胞计数板进行手动计数。
   3. 在6孔细胞培养板中以5 × 10⁵个/孔的浓度接种⁵ 细胞/孔，用EGM补至终体积2.5 ml（2 × 10⁵）⁵ LDBM 细胞/ml），在 37 °C 培养（此为培养的第 0 天）。
   4. 通过吸取1.5 ml上清液更换培养基，于525 × g离心 5 分钟 RT，在第2、3、4天每天将细胞重悬于1.5 ml含有全部3种细胞因子的新鲜培养基中，并将细胞重新接种回培养孔中，以优化增殖阶段。在第3天，收集全部细胞，计数后分种至适当数量的培养孔中，以维持培养孔中的细胞浓度约为2 × 10⁵ 细胞/ml。在37 °C、5% CO₂条件下培养。₂.
   5. 第4天，将MS5细胞（小鼠基质细胞系）接种至新的细胞培养6孔板的各孔中。MS5细胞培养基为含20%胎牛血清、100单位/毫升青霉素/链霉素和2 mM L-谷氨酰胺的α-MEM。
   6. 第5天，使用自动细胞计数器或在显微镜下利用血细胞计数板手动计数原培养板中每个孔的细胞数量（此时细胞已显著富集为成红细胞）。
   7. 从每个孔中收集全部细胞并转移至15 ml锥形管中，于525 × g离心 5 分钟在 室温下吸除上清液，用仅含促红细胞生成素（Epo，3 IU/ml）的新鲜内皮细胞生长培养基重悬沉淀，调整细胞浓度至 2 x 10⁵ 细胞/毫升
   8. 吸弃前一日接种MS-5细胞（共培养时细胞融合度应达到70–80%）孔中的上清液，加入红系细胞，使用仅含Epo的EGM培养基（尽管非其最适培养基，MS-5细胞在EGM中仍可存活数天）。
   9. 第6天更换培养基并加入新鲜EPO。
   10. 第7天更换培养基，使用未添加细胞因子的EGM。在第7至9天，每天使用抗Ter119和Syto-16染色后，通过流式细胞术检测样品的去核情况，并继续进行多光谱成像流式细胞术染色（详见第3节）。
       注意： 在铺板前以及培养的第2、4、6和7天，通过流式细胞术检测细胞表面标志物CD44和Ter119相对于细胞大小（FSC）的表达，以监测培养细胞中成红血球的富集与分化情况。⁹ 也可使用 CD71、Ter119 和 FSC^10,11.

2. 根据吉田等人et al.¹²描述并加以修改的快速去核实验（图1B）

1. 应激性红细胞生成诱导与基质细胞制备 体外 红细胞生成培养
   1. 按照IACUC指南对一只2-6个月大的野生型C57/BL6小鼠进行麻醉（例如 使用异氟烷溶液进行麻醉。通过轻捏后肢足垫以确认小鼠无反射性反应，并在操作过程中观察其呼吸是否规律，以确保麻醉充分。麻醉期间使用兽用眼膏涂抹眼睛，防止角膜干燥。
   2. 通过尾部放血诱导应激性红细胞生成，放血终末体积为500 μl。使用胰岛素注射器向腹腔内注射等体积的生理盐水，以确保动物体液复苏（注射前将动物置于头低脚高位，并在下腹部注射，避免损伤内脏器官）。
   3. 在小鼠恢复运动控制能力之前，不得将其单独留下；运动控制能力恢复的标志是动物开始在笼内活动，并能够站立和行走而不跌倒。采血后的小鼠应单独置于一个无其他小鼠的笼子中。
   4. 2 天后，将 MS-5 细胞接种于 24 孔细胞培养板的孔中。在 37 °C、5% CO₂ 条件下培养 MS-5 细胞₂ 在MS5细胞培养基（含20% FBS、100单位/毫升青霉素/链霉素和2 mM L-谷氨酰胺的a-MEM）中培养，目标是在48小时后使培养板孔中的细胞融合度达到70–80%。
2. 脾脏的收获与脾细胞的制备
   1. 在诱导应激性红细胞生成四天（96 小时）后，按照 IACUC 批准的方案处死先前放血的小鼠（例如 CO₂ 吸入麻醉后颈椎脱位法
   2. 取出脾脏并放入含有 IMDM 2% FBS 的 15 ml 锥形管中，置于冰上保存。
   3. 回到实验室，在超净台内的无菌条件下，将含有脾脏的试管倒置在置于50 ml离心管上方的40 μm细胞筛网上。使用5 ml塑料注射器的推杆研磨脾脏。
   4. 用含2% FBS的IMDM洗涤细胞筛，并用相同培养基将细胞悬液终体积调整至5 ml。
   5. 将5 ml脾细胞悬液小心地铺在装有5 ml密度梯度细胞分离液（1.083 g/ml）的15 ml离心管中，于750 × g离心 25 分钟 无制动/低加速度的实时检测
   6. 将上清液（溶液保留至15 ml离心管约2 ml刻度处，以获取血沉棕黄层）转移至新的15 ml离心管中，用IMDM+2% FBS在525 × g条件下再洗涤一次 5 分钟 室温
   7. 吸弃上清液，加入3 ml红细胞裂解缓冲液重悬沉淀，室温裂解5 min 室温
   8. 加入7 ml IMDM+2% FBS以洗涤细胞，并稀释和中和红细胞裂解缓冲液，随后在525 × g离心 5 分钟 4 °C
   9. 吸弃上清液，将沉淀的细胞重悬于2 ml红系祖细胞生长培养基（EGM）中。
3. 分离的低密度脾细胞（富含成红细胞）在塑料培养皿上的培养（快速红系扩增的第一阶段） 体外 红细胞生成培养
   1. 使用自动细胞计数器或血细胞计数板手动计数细胞。此阶段每只脾脏通常可分离得到约 15 × 10⁶ 个细胞。⁶.
   2. 在含有以下细胞因子（终浓度）的 EGM 培养基中进一步悬浮细胞：SCF 50 ng/ml、IL-3 5 ng/ml 和 Epo 2 U/ml。
   3. 接种 1–5 × 10⁶ 在24孔细胞培养板中，每孔加入1 ml终体积的细胞悬液（根据细胞总数，每孔细胞数量相同），于37 °C、5% CO₂条件下过夜培养。₂.
4. 在MS5细胞上培养红细胞前体细胞（快速方案的第二阶段） 体外 红细胞生成培养
   1. 吸弃塑料孔中的上清液，加入 2 ml 液体以重悬细胞（富含成红血细胞） 在冰上向每孔加入预冷的含10 mM EDTA的PBS溶液5分钟。
   2. 将细胞转移至新的离心管中，用不含细胞因子的EGM洗涤一次，并用相同的培养基重悬。
   3. 接种 5 x 10⁵-1 × 10⁶ 向24孔板中每个包被有MS5细胞的孔加入1-2 ml细胞悬液。如果实验中使用药物抑制剂，此时应加入适当浓度的抑制剂。
   4. 孵育6至8小时 （时间由显微镜观察对照野生型样本中约30%–40%的脱核率确定）。成红细胞与MS-5细胞的结合可加速其脱核过程。
   5. 用预冷的含 10 mM EDTA 的 PBS 2 ml 加入每孔，冰上孵育 5 分钟，使细胞脱落。此过程中除成红血细胞外，MS-5 细胞也会被一并收集，但在后续流式细胞术分析中可通过 FSC 参数轻松排除^你好 Ter119^- 细胞
   6. 此时，细胞可进行固定并染色，用于多光谱成像流式细胞术分析。

3. 通过多光谱成像流式细胞术对红细胞生成过程中细胞内蛋白或脂筏定位的成红细胞染色 

1. 用 PBS 洗涤细胞，525 × g 离心 5 分钟 室温下离心并吸除上清液。
2. 将细胞沉淀重悬于500 μl含3.7%多聚甲醛的PBS溶液中，室温固定15分钟（固定时间可根据待检测抗原的特性适当调整），期间轻柔吹打。
3. 转移至1.5 ml塑料离心管中，在15分钟内孵育 室温
4. 在台式微量离心机中以 2,000 x g 离心 20秒，吸去上清液，向每管中加入500 μl PBS，轻轻吹打，进行一次洗涤。
5. 在台式微量离心机中以 2,000 x g 离心 20 秒，吸去上清液，将离心管置于冰上至少 15 分钟。透化步骤 3.6–3.9 应快速高效地进行，每次室温离心或抽吸后，细胞沉淀应立即放回冰上，以更好地保持细胞完整性。
6. 从 -20 °C 冰箱中取出丙酮溶液并置于冰上。先将细胞沉淀用 500 μl 冰冷的 50% 丙酮（与 dH₂O 1:1 配制）重悬，以透化细胞。₂轻柔地用移液器吸取。
7. 在台式微量离心机中以 2,000 x g 离心 20 秒，吸除上清液，并将细胞沉淀重悬于 500 μl 中 冰冷的 用移液器轻轻加入100%丙酮。
8. 在台式微量离心机中以 2,000 x g 离心 20 秒，吸去上清液，再用 500 μl 重悬细胞沉淀 冰冷的 轻轻用移液器加入50%丙酮。
9. 在台式微量离心机中以2,000 x g离心 20秒后，吸去上清液，用预冷的FACS缓冲液（PBS + 0.5% BSA）轻柔吹打洗涤细胞一次。
10. 制备标记混合液，用于目标分子的抗体或标记物染色：每100 μl中加入0.1 U AF488-鬼笔环肽（AF488-phalloidin）用于F-肌动蛋白染色，以及1 μl/100 μl Ter119-PECy7用于红系细胞染色。也可选用或额外进行以下染色：AF-488-抗β-微管蛋白抗体（1:50）、AF-594标记的霍乱毒素B亚基（1:200）用于脂筏标记、抗磷酸化肌球蛋白调节轻链（pMRLC，Ser19）一抗（1:50），随后使用AF-488标记的抗兔二抗（1:400）；以及抗γ-微管蛋白兔一抗（1:100），随后使用AF-555标记的抗兔二抗（1:300）。
11. 离心后弃去上清液，将细胞沉淀重悬于100 μl标记物混合液中，轻轻吹打混匀，于30分钟内孵育 室温
12. 配制含有2.5 μM核染料Draq5的FACS缓冲液。
13. 用 FACS 缓冲液洗涤细胞，在台式微量离心机中以 2,000 × g 离心沉淀 20 秒后，吸除上清液，并将沉淀重悬于 60 μl 含 Draq5 的 FACS 缓冲液中。
14. 在成像流式细胞仪上运行样本，每个实验至少收集10,000个事件，并对原始数据文件进行补偿，方法参照先前已发表的文献¹³, 并按照所示方法分析结果 图2，使用成像流式细胞仪配套的分析软件。

结果

首先，根据细胞的明场长宽比（短轴与长轴长度之比）和明场面积（反映细胞大小）对其进行分析。明场面积值低于20和高于200的事件分别主要为碎片和细胞聚集体，均被排除在分析之外。图 2A）。随后根据“梯度均方根”（Gradient RMS）参数值对单细胞（门“R1”）进行分析，该参数用于指示图像的清晰度。设定门“R2”，包含梯度均方根值高于50的细胞^th 百分位数，以选择对焦良好的图像（图2B）。然后根据明场面积（Brightfield Area）测量的细胞大小，以及通过Ter119荧光染色-平均像素值（Mean Pixel）参数测定的红系标志物Ter119的表达情况，对细胞进行设门（设门“Ter119阳性”， 图2C）。Ter119 表达极低或极高的细胞分别为非红系细胞或残留的细胞聚集体，均应从分析中排除。下一步，根据细胞的 Draq5 核长宽比强度（细胞核短轴与长轴强度的比值）和 Draq5 强度对细胞进行筛选。图 2DDraq5 阴性细胞（主要为去核细胞，如网织红细胞和红细胞）以及...

讨论

近年来，对红细胞前体脱核的研究日益受到关注 因为这是步骤中的关键环节 体外 最难以高效复制的红细胞生成培养体系，以实现红细胞的大规模成功生产 离体. 直到最近，红细胞前体脱核的研究主要采用荧光显微镜和流式细胞术方法。 荧光显微镜技术尽管有助于鉴定参与的分子，但仍需要 数天的显微镜观察，以鉴定在特定时间点固定的数百个细胞中正在进行脱核的少量嗜碱性晚幼红细胞。 另一方面，流式细胞术在评估培养物中脱核速率以及特定分子的药理学或遗传学操控对该过程的影响方面非常有用，但无法提供这些分子细胞内定位的任何数据。

多光谱成像流式细胞术结合了流式细胞术和免疫荧光显微镜的优点，能够快速获取数千个细胞的流式细胞数据和形态学信息。 在红细胞生成研究中，这一技术相较于传统流式细胞术具有显著优势，因为红系前体细胞分化各阶段（原红细胞、嗜碱性、多色性及正色性红细胞）的界定依赖于形态学标准⁶。然而，多光谱成像流式细胞术更适用于细胞结构的可视化，而在细胞群体数量的相对定量比较方面则存在局限。...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
αMEM 培养基	CellGro	15-012-CV
IMDM 培养基	Hyclone (Thermo Scientific)	SH30228.01
Stempro-34 无血清培养基（SFM）	GIBCO (Life Tech)	10640
Stempro-34 营养补充剂	GIBCO (Life Tech)	10641-025
胎牛血清（FBS）	Atlanta Biologicals	512450
BIT9500	Stemcell Technologies	09500
牛血清白蛋白（BSA）	Fisher Scientific	BP-1600-100
磷酸盐缓冲液（PBS）	Hyclone (Thermo Scientific)	SH30028.02
青霉素/链霉素	Hyclone (Thermo Scientific)	SV30010
L-谷氨酰胺	Hyclone (Thermo Scientific)	SH30590.01
异氟烷（Isoflurane）	Butler-Schein	029405
Histopaque 1.083 mg/ml	Sigma	10831
BD Pharmlyse（红细胞裂解缓冲液）	BD Biosciences	555899
丙酮	Sigma-Aldrich	534064
甲醛	Fisher Scientific	BP 531-500
氢化可的松	Sigma	H4001
干细胞因子（SCF）	Peprotech	250-03
白细胞介素-3（IL-3）	Peprotech	213-13
EPOGEN Epoetin Alfa（促红细胞生成素，EPO）	AMGEN	药房可获取
CD44-FITC 抗体	BD Pharmingen	553133
CD71-FITC 抗体	BD Pharmingen	553266
Ter119-PECy7 抗体	BD Pharmingen	557853
鬼笔环肽-AF488	Invitrogen (Life Technologies)	A12379
β-微管蛋白-AF488 抗体	Cell Signaling	#3623
抗兔 AF488 二抗	Invitrogen (Life Technologies)	A11008
抗兔 AF555 二抗	Invitrogen (Life Technologies)	A21428
AF594-霍乱毒素 B 亚基	Invitrogen (Life Technologies)	C34777
pMRLC（Ser19）抗体	Cell Signaling	#3671
γ-微管蛋白抗体	Sigma	T-3559
Syto16	Invitrogen (Life Technologies)	S7578
Draq5	Biostatus	DR50200
硫酸亚铁	Sigma	F7002
硝酸铁	Sigma	F3002
EDTA	Fisher Scientific	BP120500
15 ml 离心管	BD Falcon	352099
50 ml 离心管	BD Falcon	352098
6 孔板	BD Falcon	353046
24 孔板	BD Falcon	351147
流式管	BD Falcon	352008
结核菌素注射器	BD	309602
胰岛素注射器	BD	329461
25-G 5/8 注射针头	BD	305122
带盖流式管	BD	352058
40-μm 细胞筛	BD Falcon	352340
手术刀（一次性）	Feather	2975#21
FACS Canto 流式细胞仪	BD
ImagestreamX Mark II 成像流式细胞仪	AMNIS (EMD Millipore)
图像数据探索与分析软件（IDEAS）4.0 及以上版本	AMNIS (EMD Millipore)
Hemavet 950 细胞计数仪	Drew Scientific	CDC-9950-002
NAPCO 系列 8000WJ 培养箱	Thermo scientific
Allegra X-15R 离心机	Beckman Coulter	392932
Mini Mouse Bench 离心机	Denville	C0801