本方案描述了一种利用多光谱成像流式细胞术鉴定正在脱核的晚幼红细胞群体的新方法，可实现对红细胞脱核过程的可视化观察。
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摘要
摘要
哺乳动物的红细胞生成以显著的脱核过程结束，最终形成网织红细胞。目前脱核的机制尚未完全阐明。在通过显微镜研究脱核成红细胞中关键蛋白和结构的定位时，常遇到的一个问题是难以观察到足够数量的正在脱核的细胞。 我们开发了一种新的分析方案，利用流动中的多参数高速细胞成像技术（多光谱成像流式细胞术），该方法结合了免疫荧光显微镜与流式细胞术，能够高效地识别大量脱核事件，从而获取测量数据并进行统计分析。
我们首先在此描述两种 体外 用于同步小鼠成红细胞并提高在评估时捕获脱核事件概率的红细胞生成培养方法。 然后，我们详细描述红细胞前体在固定和透化后的染色步骤，以便通过多光谱成像流式细胞术研究细胞核排出过程中细胞内蛋白质或脂筏的定位。 除了用于鉴定正染色性成红细胞的细胞大小和DNA/Ter119染色外，我们还利用明场通道中的细胞“长宽比”参数，以帮助识别拉长的细胞；同时使用“Ter119/Draq5的XY质心偏移”参数，用于识别Ter119染色信号（新生网织红细胞）的中心与Draq5染色信号（正在脱核的细胞核）的中心相距较远的细胞事件，从而指示即将脱核的细胞。 高delta重心值且低长宽比的正色性成红细胞亚群中，去核细胞高度富集。
引言
哺乳动物红细胞谱系中的终末分化以显著的脱核过程告终，正染色性成红细胞在此过程中排出其被膜包裹的细胞核（即染色质小体）1，生成网织红细胞2该过程的确切机制，也是红细胞成功大规模生产中的限速步骤 体外，尚未完全阐明。在脱核红细胞前体中，关键蛋白质和结构的定位依赖于荧光显微镜和电子显微镜技术3-5这一繁琐的过程通常只能鉴定出有限数量的去核事件，且并不总能进行有意义的统计分析。在McGrath先前描述的红系前体细胞鉴定方法基础上进行拓展 等6我们开发了一种利用多光谱成像流式细胞术（一种结合荧光显微镜与流式细胞术的多参数高速细胞成像技术）来鉴定和研究去核事件的新方法7，可提供足够数量的观测值以进行测量并开展统计分析。
此处，我们首先描述前两个 体外 用于同步红细胞前体并提高在评估时捕获脱核事件概率的红细胞生成培养方法。随后，我们详细描述了红细胞前体在固定和透化后的染色步骤，以便通过多光谱成像流式细胞术研究脱核过程中细胞内蛋白质或脂筏的定位。
样本在成像流式细胞仪上运行，对收集的细胞进行适当的门控以鉴定正染色性成红细胞6。随后根据明场成像中测得的长宽比与“Ter119-DNA的X-Y中心偏移差”参数值之间的关系分析正染色性成红细胞，该参数定义为Ter....
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方案
长期 体外 红细胞生成培养（离体 由Giarratana提供的红系分化培养方案 等8，为小鼠细胞改良与适配
这是一个三步长期方案 体外 红细胞生成方案。第一步（第0-4天）2 x 105 细胞/ml被置于添加了干细胞因子（SCF）、白细胞介素-3（IL-3）和促红细胞生成素（Epo）的成红细胞生长培养基中。在第二步（第5-6天），细胞被重悬于2 x 105 细胞/ml，并在仅添加Epo的新鲜成红细胞生长培养基中与贴壁基质细胞（MS5）共培养。第三步（第7-9天），将细胞接种于MS-5细胞层上，在不含细胞因子的新鲜成红细胞生长培养基中继续培养，直至脱核图1A).
所有动物实验方案均经辛辛那提儿童医院医疗中心机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准。
- 骨骼的采集与低密度骨髓细胞的分离
- 在15 ml锥形管中加入2 ml含2%胎牛血清（FBS）的无菌IMDM，并置于冰上保存。
- 按照机构批准的方案，处死一只2-6月龄的野生型C57/BL6小鼠（可同时或不同时处死感兴趣的基因靶向小鼠）例如 CO2 吸入麻醉，随后进行颈椎脱位。
- 使用....
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结果
首先，根据细胞的明场长宽比（短轴与长轴长度之比）和明场面积（反映细胞大小）对其进行分析。明场面积值低于20和高于200的事件分别主要为碎片和细胞聚集体，均被排除在分析之外。图2A）。随后根据单个细胞（门控“R1”）的梯度均方根（Gradient RMS）参数值进行分析，该参数反映图像的清晰度。设置门控“R2”，包含梯度均方根值高于50的细胞th 百分位数，以选择清晰对焦的图像（图2B）。然后根据细胞的明场面积（Brightfield Area）测量值对其大小进行设门，并结合通过Ter119荧光染色-平均像素强度（Mean Pixel）参数测定的红系标志物Ter119的阳性表达情况进行设门（设门标记为“Ter119阳性” 图2C）。Ter119 表达极低或极高的细胞分别为非红系细胞或残留的细胞聚集体，均在分析中予以排除。下一步，根据细胞的 Draq5 形状比强度（细胞核短轴与长轴荧光强度之比）和 Draq5 强度对细胞进行筛选。图 2D)。Draq5 阴性细胞（主要为去核细胞，如网织.......
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讨论
近年来，对红细胞前体脱核的研究日益受到关注 因为这是步骤中的关键环节 体外 最难以高效复制的红细胞生成培养体系，以实现红细胞的大规模成功生产 离体. 直到最近，红细胞前体脱核的研究主要采用荧光显微镜和流式细胞术方法。 荧光显微镜技术尽管有助于鉴定参与的分子，但仍需要 数天的显微镜观察，以鉴定在特定时间点固定的数百个细胞中正在进行脱核的少量嗜碱性晚幼红细胞。 另一方面，流式细胞术在评估培养物中脱核速率以及特定分子的药理学或遗传学操控对该过程的影响方面非常有用，但无法提供这些分子细胞内定位的任何数据。
多光谱成像流式细胞术结合了流式细胞术和免疫荧光显微镜的优点，能够快速获取数千个细胞的流式细胞数据和形态学信息。 在红细胞生成研究中，这一技术相较于传统流式细胞术具有显著优势，因为红系前体细胞分化各阶段（原红细胞、嗜碱性、多色性及正色性红细胞）的界定依赖于形态学标准6。然而，多光谱成像流式细胞术更适用于细胞结构的可视化，而在细胞群体数量的相对定量比较方面则存在局限。.......
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披露
作者声明无竞争性财务利益。
致谢
作者感谢辛辛那提儿童医院研究基金会的研究流式细胞术核心实验室，以及来自EMD Millipore旗下Amnis公司的技术专家Richard Demarco、Sherree Friend和Scott Mordecai提供的专业技术支持。本研究由美国国立卫生研究院资助，基金编号为K08HL088126和R01HL116352（T.A.K.）以及P30 DK090971（Y.Z.）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| αMEM 培养基 | CellGro | 15-012-CV | |
| IMDM 培养基 | Hyclone (Thermo Scientific) | SH30228.01 | |
| Stempro-34 无血清培养基（SFM） | GIBCO (Life Tech) | 10640 | |
| Stempro-34 营养补充剂 | GIBCO (Life Tech) | 10641-025 | |
| 胎牛血清（FBS） | Atlanta Biologicals | 512450 | |
| BIT9500 | Stemcell Technologies | 09500 | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Fisher Scientific | BP-1600-100 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Hyclone (Thermo Scientific) | SH30028.02 | |
| 青霉素/链霉素 | Hyclone (Thermo Scientific) | SV30010 | |
| L-谷氨酰胺 | Hyclone (Thermo Scientific) | SH30590.01 | |
| 异氟烷（Isoflurane） | Butler-Schein | 029405 | |
| Histopaque 1.083 mg/ml | Sigma | 10831 | |
| BD Pharmlyse（红细胞裂解缓冲液） | BD Biosciences | 555899 | |
| 丙酮 | Sigma-Aldrich | 534064 | |
| 甲醛 | Fisher Scientific | BP 531-500 | |
| 氢化可的松 | Sigma | H4001 | |
| 干细胞因子（SCF） | Peprotech | 250-03 | |
| 白细胞介素-3（IL-3） | Peprotech | 213-13 | |
| EPOGEN Epoetin Alfa（促红细胞生成素，EPO） | AMGEN | 药房可获取 | |
| CD44-FITC 抗体 | BD Pharmingen | 553133 | |
| CD71-FITC 抗体 | BD Pharmingen | 553266 | |
| Ter119-PECy7 抗体 | BD Pharmingen | 557853 | |
| 鬼笔环肽-AF488 | Invitrogen (Life Technologies) | A12379 | |
| β-微管蛋白-AF488 抗体 | Cell Signaling | #3623 | |
| 抗兔 AF488 二抗 | Invitrogen (Life Technologies) | A11008 | |
| 抗兔 AF555 二抗 | Invitrogen (Life Technologies) | A21428 | |
| AF594-霍乱毒素 B 亚基 | Invitrogen (Life Technologies) | C34777 | |
| pMRLC（Ser19）抗体 | Cell Signaling | #3671 | |
| γ-微管蛋白抗体 | Sigma | T-3559 | |
| Syto16 | Invitrogen (Life Technologies) | S7578 | |
| Draq5 | Biostatus | DR50200 | |
| 硫酸亚铁 | Sigma | F7002 | |
| 硝酸铁 | Sigma | F3002 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120500 | |
| 15 ml 离心管 | BD Falcon | 352099 | |
| 50 ml 离心管 | BD Falcon | 352098 | |
| 6 孔板 | BD Falcon | 353046 | |
| 24 孔板 | BD Falcon | 351147 | |
| 流式管 | BD Falcon | 352008 | |
| 结核菌素注射器 | BD | 309602 | |
| 胰岛素注射器 | BD | 329461 | |
| 25-G 5/8 注射针头 | BD | 305122 | |
| 带盖流式管 | BD | 352058 | |
| 40-μm 细胞筛 | BD Falcon | 352340 | |
| 手术刀（一次性） | Feather | 2975#21 | |
| FACS Canto 流式细胞仪 | BD | ||
| ImagestreamX Mark II 成像流式细胞仪 | AMNIS (EMD Millipore) | ||
| 图像数据探索与分析软件（IDEAS）4.0 及以上版本 | AMNIS (EMD Millipore) | ||
| Hemavet 950 细胞计数仪 | Drew Scientific | CDC-9950-002 | |
| NAPCO 系列 8000WJ 培养箱 | Thermo scientific | ||
| Allegra X-15R 离心机 | Beckman Coulter | 392932 | |
| Mini Mouse Bench 离心机 | Denville | C0801 |
参考文献
- McGrath, K. E., Kingsley, P. D., Koniski, A. D., Porter, R. L., Bushnell, T. P., Palis, J. Enucleation of primitive erythroid cells generates a transient population of "pyrenocytes" in the mammalian fetus. Blood. 111, 2409-2417 (2008).
- Chasis, J. A., Mohandas, N.
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重印与许可
