in utero 通过无创M型超声心动图测量小鼠心率

摘要

超高频超声是一种强大的活体成像工具，可用于检测小型动物的心脏异常。其非侵入性特点有助于维持胚胎的生理状态。本文展示了利用M型超声在E18.5阶段测量胚胎心率的方法。 在子宫内.

摘要

先天性心脏病（CHD）是出生时最常见的非传染性死亡原因。CHD 的发病率范围为每 1,000 名新生儿中 4 至 50 例（世界卫生组织，2004 年疾病与伤害区域估计数据）。矫正心脏缺陷通常需要手术，而这些手术往往会影响患者的生活质量，这提醒我们寻找 CHD 病因的重要性。突变小鼠模型和活体成像技术已成为研究该疾病病因的关键工具。尽管先进方法能够对胚胎中的异常心脏进行活体成像，但由于手术操作和/或耗时较长的流程，胚胎的生理状态和血流动力学状态常常受到影响。然而，非侵入性超声成像可以在不进行手术暴露胚胎的情况下使用，从而维持其生理状态。在此，我们采用简单的 M 模式超声在子宫内评估 E18.5 胚胎的心率。in utero 异常心率的检出确实是心脏功能障碍的一个良好指标，因此是识别可能导致心力衰竭的发育缺陷的第一步。

引言

先天性心脏病是出生时最常见的非感染性死亡原因¹通常需要进行多次手术来矫正结构缺陷，而患者的生存质量可能仍然受到影响¹患有先天性心脏病（CHD）的儿童即使未接受手术，也常出现神经系统疾病，表明其具有重要意义 在子宫内 对发育的影响^2,3先天性心脏病（CHD）由遗传因素和环境因素（如孕期接触病毒或化学物质（酒精））共同引起。目前对遗传因素的研究尚处于初期阶段，但发展迅速。为了鉴定这些遗传因素并阐明其在心脏发育中的作用，利用一种简单而强大的工具对突变小鼠进行表型分析将具有重要意义。

小鼠确实是研究先天性心脏病（CHD）的首选动物模型，大多数人类病例均可在小鼠中复制^4,5。因此，胎鼠心脏表型分析在探究人类CHD病因方面变得日益重要，且需要配备适当的工具。尽管对固定标本进行组织学研究具有不可替代的价值，但对活体动物进行实时成像对于理解心脏生理功能至关重要。视频显微镜可实现活体成像，但需要通过剖腹手术暴露胚胎，从而会干扰其生理状态和血流动力学状态。近年来，超声心动图已成为临床及小鼠心脏评估的标准影像学技术。

小鼠胎儿超声心动图检查可采用标准的临床超声系统以及超高频超声系统进行。后者提供频率为30 MHz或更高的换能器，能够生成二维图像，并允许对早期胚胎阶段进行评估。这些换能器的穿透深度相对较浅（约13 mm），但已足以获取适当的成像切面，并在无需开腹手术的情况下测定基本的心脏参数，如心率、舒张期和收缩期的左右心室内径，以及室间隔和心壁厚度。

在本研究中，我们采用超高频超声系统评估胚胎发育第18.5天（E18.5）小鼠胚胎的心率。我们选用频率为30 MHz的探头，其视野范围为20 mm × 20 mm，适合胎儿大小，焦距为12.7 mm。然而，若需分析更早期的发育阶段，可选择更高频率的探头。所选的M型模式凭借每秒1,000帧的高时间分辨率，可实现对运动组织的可视化观察。整个操作流程简便，应尽可能快速完成，以避免对胎儿的生理及血流动力学状态造成干扰。分析约8个胚胎大约需要1小时。

方案

本方案中展示的所有操作均已获得 IRCM 动物护理委员会的批准。

1. 超声系统与工作站准备

1. 根据制造商的说明启动超声成像系统，并连接扫描头和生理控制器单元（图1）。选择心脏测量程序以及对应于30 MHz换能器的扫描头。
2. 用去离子水完全填充扫描头的鼻部，避免产生气泡，因为气泡会影响成像分辨率。将扫描头手柄朝上放置在其支架上，靠近成像平台（图1A）。
3. 对成像平台及工作区域进行消毒。
4. 将超声耦合剂瓶完全装满，以避免气泡形成，并将其倒置放入预热容器中，温度设定为37 °C（图1B）。
5. 检查氧气和异氟烷的供应量以及麻醉气体管路系统。一次约包含8个胚胎的实验大约需要15–20 L氧气。
6. 将眼用软膏、脱毛膏和电极凝胶的瓶子放置在成像平台附近（图1B）。
7. 确认红外加热灯正常工作。在培训过程中，调节加热档位、灯的位置以及灯与小鼠之间的距离，以维持恒定的体温和心率。
   注意：系统的充分准备和材料的完备至关重要。操作时间过长可能会影响胎儿的生理和血流动力学特征，因为长时间麻醉会通过降低心率、血压和血氧水平来抑制心脏功能。处理约8个胎儿（C57BL/6小鼠的平均窝仔数）所需时间应约为1小时。其他品系的小鼠可能产生更多的胎儿，雌鼠体型也可能更大。充分的培训对于优化操作时间至关重要。

2. 小鼠准备

1. 将怀孕雌鼠置于麻醉室中，持续供给含2%异氟烷的氧气（流速200 ml/min），直至其失去反应。
2. 将小鼠仰卧位放置于成像平台上，调节导管以持续吸入含1.5%异氟烷的氧气（流速200 ml/min），并用胶带固定吸入管（图2A）。操作过程中应通过小鼠体态松弛且对尾部和脚趾夹捏无反应来确认麻醉充分。
3. 仅在左上和右下电极片（即右前肢和左后肢，也称为II导联位置）涂抹导电胶，用于心电图记录。II导联位置可提供更清晰直立的正向P波和QRS复合波，便于确定心率。使用胶带将四只脚爪分别固定在对应电极片上（图2A）。为防止眼睛干涩，每眼滴入1滴眼用软膏。
4. 使用毛发修剪器将腹部从胸部至膀胱区域的毛发剃除。随后涂抹脱毛膏2分钟，再用纱布和/或棉签轻轻擦拭以彻底清除残留毛发。注意避免割伤乳头。
5. 将预先涂有导电胶的体温计插入雌鼠直肠内，以监测体温（通过调节平台上方的红外加热灯维持在37±0.5 °C）。心率应维持在450±50 次/分钟（bpm）。体温和心率均显示在生理监测控制器上（图1B）。
   注意：长时间麻醉、脱毛以及超声耦合剂（即使已预热）可能导致低体温，进而影响雌鼠心率。若体温低于36.5 °C，应暂停操作，调整加热灯位置以恢复体温和心率，等待数分钟后方可继续。

3. 胚胎鉴定

1. 轻轻按压裸露的腹部以定位胚胎。缓慢而轻柔地将胚胎摊开，使大多数胚胎在腹壁下方呈单层排列。每个子宫角中的胎囊呈线性连接。摊开时应尽量保持这一顺序。
2. 使用永久性标记笔在雌鼠裸露的腹部标记每个胚胎的头尾方向和背腹方向。明确方位有助于后续使用探头定位心脏。从宫颈开始，对左右两个子宫角的胚胎分别编号（1、2、3… 和 1'、2'、3'…；图2B）。
   注意：(i) 避免用力过度摊开胚胎。可在纸上草图记录胚胎位置以便追踪（图2C）。(ii) C57BL/6雌鼠每窝约有8个胎儿。但每窝中可能有0–2个胚胎位于其他胚胎下方，无法成像。应将这些胚胎排除在分析之外，必要时增加检测的窝数。

4. 心率测量

1. 在裸露的腹部上涂抹少量预热的超声耦合剂，并均匀涂抹，避免产生气泡。在需要成像的特定区域添加较多的耦合剂（约 5 ml）。
2. 将探头接触约 10 mm 厚的耦合剂层，然后逐渐将探头移向皮肤，同时在屏幕上寻找跳动的心脏。一旦在屏幕上观察到跳动的心脏，调整探头角度，使两个心室在成像平面中均呈现最大截面（图 2D）。
3. 开始采集图像。前臂置于操作台面上，将换能器放置在超声耦合剂上，以在显示屏上获得实时图像（图 2D）。保持换能器的凸起边缘朝上，并点击图像左上角的扫描头方向标记，以协调手部移动与屏幕上显示区域的对应关系。
4. 从宫颈开始，移动至最近的胚胎位置（分别在右侧或左侧子宫角标记为 1 或 1'），在屏幕上观察跳动的心脏。由于焦深固定，需轻柔地上下或左右移动探头，同时保持与耦合剂的接触，以获得理想的成像平面。
5. 将跳动的心脏置于屏幕中央，位于黄色虚线所示的焦区范围内，以获得更佳的数据采集效果。
6. 开始实时录像。获取定位图像后继续录像（图 3A）。当获得至少 10 秒的稳定录像后，停止录像并保存。
7. 继续对下一个胚胎进行操作。
8. 完成所有胚胎的分析后，按下键盘上的 "Browse" 键以查看录像列表。播放每段记录的 M 型图像，对相邻波峰之间的间距（时间/血流周期）进行多次测量（每段至少 5 次），以计算平均心率（图 3B）。
   注意：部分方案建议使用换能器固定支架以避免抖动。然而，这会限制分析角度，使侧方胚胎的观察变得困难。此外，由于每次更换胚胎时都需要调整支架，会降低分析速度。在前臂置于操作台面的同时手持换能器，可有效减少抖动。建议对 5–10 只妊娠雌鼠进行训练，以优化操作结果。

5. 基因分型

1. 使用洁净的手术剪和镊子，沿腹壁纵向切开皮肤和肌肉层。找到每个子宫角内的胎囊并核对编号。按照上述顺序切开卵黄囊以暴露胚胎。若胚胎排列并非线性，应在皮肤标记消失前，将胚胎位置草图绘制在纸上，以便后续参考。
2. 仅剪取约 4 mm 尾尖用于基因分型，因为胚胎尾部可高效提取基因组 DNA。
   注意：(i) 手术操作可能需要在成像室以外的区域进行。但为准确追踪编号胚胎，应避免移动小鼠，并尽量在成像平台上完成手术操作。请咨询动物设施管理人员以优化手术流程。(ii) 孕鼠在成像后因取出胎儿进行基因分型而导致失血，会迅速死亡。剪取尾尖后，建议将胎儿置于冰上 3 分钟，通过低温实现麻醉，随后按本机构动物护理委员会推荐的方法用剪刀断头处死。

结果

上述方法用于评估丝氨酸蛋白酶弗林蛋白酶（furin）在内皮细胞中的存在或缺失对中国台湾小鼠胚胎 E18.5 时期心率的体内（in utero）影响。弗林蛋白酶属于前体蛋白转化酶（proprotein convertases, PCs）家族，可切割位于碱性氨基酸残基后的蛋白质前体。弗林蛋白酶及其底物均为分泌蛋白，切割过程可发生在高尔基体、内体或细胞膜表面。弗林蛋白酶的关键底物包括转化生长因子β（TGFβ）及TGFβ样因子，例如在心脏发育中发挥重要作用的骨形态发生蛋白（BMPs）。PC家族的其他成员也可通过体外（in vitro）切割激活弗林蛋白酶的典型底物⁶。弗林蛋白酶在发育过程中的关键且独特作用，体现在弗林蛋白酶缺失的胚胎在胚胎第11天即出现早期死亡⁷。

由于furin缺陷型胚胎表现出的多种缺陷提示furin在内皮细胞中具有重要功能，因此在内皮细胞特异性敲除（ecKO）小鼠中研究了该酶的作用。Furin^flox/flox 小鼠携带Furin基因的...

讨论

M 型超声心动图是一种有效且简便的方法，用于测量小鼠胚胎的宫内心率。in utero 心率的测量可通过商用换能器实现，其分辨率足以清晰显示微小的跳动心脏。因此，与脉搏测量等其他方法相比，该技术可实现高精度的心率测定，并可替代高分辨率视频显微镜。然而，现有工具无法同时分析所有胚胎，因而需要逐一观察每个胚胎，操作较为繁琐。此外，由于视野相对较窄且缺乏景深（二维图像），必须通过手动调节来定位，而这一操作仅能由经过训练的操作者熟练完成。事实上，充分的培训可显著提高该方法的效率。

体内测量胚胎心率（E18.5）可通过无创活体成像对心脏功能进行生理学评估，与以往方法不同，该方法无需进行剖腹手术。相反，通过在怀孕雌性动物的腹部标记胚胎位置，可实现准确追踪并维持其生理状态。因此，该方法克服了其他成像技术（如计算机断层扫描和磁共振成像）的主要缺陷。最后但同样重要的是，该方法成本较低。

该方法中一些关键步骤包括：通过调节加热灯的位置和维持适当的异氟烷产生速率，保持怀孕小鼠的体温和心率稳定，以维持胚胎的生理状态并...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
异氟烷	Pharmaceutical Partners of Canada Inc.	CP0406v2	1-氯-2,2,2-三氟乙基二氟甲基醚
超声耦合剂	Parker Laboratories Inc.	Aquasonic Clear
电极凝胶	Parker Laboratories Inc.	Spectra 360
眼科凝胶	诺华公司	Tear-Gel
脱毛膏	Church Dwight Co., Inc.	Nair
毛发剪
纱布/棉签	Q-tips
永久性记号笔
高分辨率 体内 超声成像系统	Visual Sonics	Vevo770
30 MHz 换能器	Visual Sonics	RMV707B
成像平台及生理控制单元	Visual Sonics
麻醉系统	Cyprane North America Inc.	312462
红外加热灯