超高频超声是一种强大的活体成像工具，可用于检测小型动物的心脏异常。其非侵入性特点有助于维持胚胎的生理状态。本文展示了利用M型超声在E18.5阶段测量胚胎心率的方法。 在子宫内.
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摘要
摘要
先天性心脏病（CHD）是出生时最常见的非传染性死亡原因。CHD 的发病率范围为每 1,000 名新生儿中 4 至 50 例（世界卫生组织，2004 年疾病与伤害区域估计数据）。矫正心脏缺陷通常需要手术，而这些手术往往会影响患者的生活质量，这提醒我们寻找 CHD 病因的重要性。突变小鼠模型和活体成像技术已成为研究该疾病病因的关键工具。尽管先进方法能够对胚胎中的异常心脏进行活体成像，但由于手术操作和/或耗时较长的流程，胚胎的生理状态和血流动力学状态常常受到影响。然而，非侵入性超声成像可以在不进行手术暴露胚胎的情况下使用，从而维持其生理状态。在此，我们采用简单的 M 模式超声在子宫内评估 E18.5 胚胎的心率。in utero 异常心率的检出确实是心脏功能障碍的一个良好指标，因此是识别可能导致心力衰竭的发育缺陷的第一步。
引言
先天性心脏病是出生时最常见的非感染性死亡原因1通常需要进行多次手术来矫正结构缺陷，而患者的生存质量可能仍然受到影响1患有先天性心脏病（CHD）的儿童即使未接受手术，也常出现神经系统疾病，表明其具有重要意义 在子宫内 对发育的影响2,3先天性心脏病（CHD）由遗传因素和环境因素（如孕期接触病毒或化学物质（酒精））共同引起。目前对遗传因素的研究尚处于初期阶段，但发展迅速。为了鉴定这些遗传因素并阐明其在心脏发育中的作用，利用一种简单而强大的工具对突变小鼠进行表型分析将具有重要意义。
小鼠确实是研究先天性心脏病（CHD）的首选动物模型，大多数人类病例均可在小鼠中复制4,5。因此，胎鼠心脏表型分析在探究人类CHD病因方面变得日益重要，且需要配备适当的工具。尽管对固定标本进行组织学研究具有不可替代的价值，但对活体动物进行实时成像对于理解心脏生理功能至关重要。视频显微镜可实现活体成像，但需要通过剖腹手术暴露胚胎，从而会干扰其生理状态和血流动力学状态。近年来，超声心动图已成为临床及小鼠心脏评估的标准影像学技术。
小鼠胎儿超声心动图检查可采用标准的临床超声系统以及超高频超声系统进行。后者提供频率为30 MHz或更高的换能器，能够生成二维图像，并允许对早期胚胎阶段进行评估。这些换能器的穿透深度相对较浅（约13 mm），但已足以获取适当的....
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方案
本方案中展示的所有操作均已获得 IRCM 动物护理委员会的批准。
1. 超声系统与工作站准备
- 根据制造商的说明启动超声成像系统，并连接扫描头和生理控制器单元（图1）。选择心脏测量程序以及对应于30 MHz换能器的扫描头。
- 用去离子水完全填充扫描头的鼻部，避免产生气泡，因为气泡会影响成像分辨率。将扫描头手柄朝上放置在其支架上，靠近成像平台（图1A）。
- 对成像平台及工作区域进行消毒。
- 将超声耦合剂瓶完全装满，以避免气泡形成，并将其倒置放入预热容器中，温度设定为37 °C（图1B）。
- 检查氧气和异氟烷的供应量以及麻醉气体管路系统。一次约包含8个胚胎的实验大约需要15–20 L氧气。
- 将眼用软膏、脱毛膏和电极凝胶的瓶子放置在成像平台附近（图1B）。
- 确认红外加热灯正常工作。在培训过程中，调节加热档位、灯的位置以及灯与小鼠之间的距离，以维持恒定的体温和心率。
注意：系统的充分准备和材料的完备至关重要。操作时间过长可能会影响胎儿的生理和血流动力学特征，因为长时间麻醉会通过降低心率、血压和血氧水平来抑制心脏功能。处理约8个胎儿（C57BL/6小鼠的平均窝仔数）所需时间应约为1小时。其他品系的小鼠可能产....
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结果
上述方法用于评估丝氨酸蛋白酶弗林蛋白酶（furin）在内皮细胞中的存在或缺失对中国台湾小鼠胚胎 E18.5 时期心率的体内（in utero）影响。弗林蛋白酶属于前体蛋白转化酶（proprotein convertases, PCs）家族，可切割位于碱性氨基酸残基后的蛋白质前体。弗林蛋白酶及其底物均为分泌蛋白，切割过程可发生在高尔基体、内体或细胞膜表面。弗林蛋白酶的关键底物包括转化生长因子β（TGFβ）及TGFβ样因子，例如在心脏发育中发挥重要作用的骨形态发生蛋白（BMPs）。PC家族的其他成员也可通过体外（in vitro）切割激活弗林蛋白酶的典型底物6。弗林蛋白酶在发育过程中的关键且独特作用，体现在弗林蛋白酶缺失的胚胎在胚胎第11天即出现早期死亡7。
由于furin缺陷型胚胎表现出的多种缺陷提示furin在内皮细胞中具有重要功能，因此在内皮细胞特异性敲除（ecKO）小鼠中研究了该酶的作用。Furinflox/flox 小鼠携带Furin基因的.......
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讨论
M 型超声心动图是一种有效且简便的方法，用于测量小鼠胚胎的宫内心率。in utero 心率的测量可通过商用换能器实现，其分辨率足以清晰显示微小的跳动心脏。因此，与脉搏测量等其他方法相比，该技术可实现高精度的心率测定，并可替代高分辨率视频显微镜。然而，现有工具无法同时分析所有胚胎，因而需要逐一观察每个胚胎，操作较为繁琐。此外，由于视野相对较窄且缺乏景深（二维图像），必须通过手动调节来定位，而这一操作仅能由经过训练的操作者熟练完成。事实上，充分的培训可显著提高该方法的效率。
体内测量胚胎心率（E18.5）可通过无创活体成像对心脏功能进行生理学评估，与以往方法不同，该方法无需进行剖腹手术。相反，通过在怀孕雌性动物的腹部标记胚胎位置，可实现准确追踪并维持其生理状态。因此，该方法克服了其他成像技术（如计算机断层扫描和磁共振成像）的主要缺陷。最后但同样重要的是，该方法成本较低。
该方法中一些关键步骤包括：通过调节加热灯的位置和维持适当的异氟烷产生速率，保持怀孕小鼠的体温和心率稳定，以维持胚胎的生理状态并.......
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致谢
感谢 Manon Laprise 在超声心动图方面的培训，以及 Ann Chamberland 拍摄了图 1和图 2中所示的照片。本研究由加拿大卫生研究院基金 MOP 44363 和加拿大讲席 950-216684 资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 异氟烷 | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | CP0406v2 | 1-氯-2,2,2-三氟乙基二氟甲基醚 |
| 超声耦合剂 | Parker Laboratories Inc. | Aquasonic Clear | |
| 电极凝胶 | Parker Laboratories Inc. | Spectra 360 | |
| 眼科凝胶 | 诺华公司 | Tear-Gel | |
| 脱毛膏 | Church Dwight Co., Inc. | Nair | |
| 毛发剪 | |||
| 纱布/棉签 | Q-tips | ||
| 永久性记号笔 | |||
| 高分辨率 体内 超声成像系统 | Visual Sonics | Vevo770 | |
| 30 MHz 换能器 | Visual Sonics | RMV707B | |
| 成像平台及生理控制单元 | Visual Sonics | ||
| 麻醉系统 | Cyprane North America Inc. | 312462 | |
| 红外加热灯 |
参考文献
- Hoffman, J. I., Kaplan, S. The incidence of congenital heart disease. J. Am. Coll. Cardiol. 39, 1890-1900 (2002).
- Miller, S. P., et al. Abnormal brain development in newborns with congenital heart disease. N. Engl. J. Med. 357, 1928-1938 (2007).
- Bru....
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