该模型系统始于含有肌成纤维细胞的纤维蛋白凝胶，可用于以非破坏性方式实时研究内源性胶原蛋白的（再）组织过程。该模型系统具有高度可调性，可结合不同细胞来源和培养基添加剂使用，并能轻松适应特定研究需求。
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本文内容
摘要
摘要
发育中的胶原组织内，胶原含量及其排列可能受到局部组织应变和组织约束的影响。组织工程研究人员希望利用这些原理来构建具有预设胶原结构的组织。然而，目前对控制最终组织结构的胶原重塑具体机制仍缺乏全面理解。特别是，关于胶原纤维如何响应组织力学加载条件变化而发生的（重）定向过程，所知甚少。我们开发了一种in vitro模型系统，该系统由接种肌成纤维细胞并施加双向约束的纤维蛋白构建体组成，旨在进一步阐明胶原（重）定向行为：i）将双向静态加载转变为单轴静态加载条件下的响应；ii）在加载方向改变前后，利用Flexcell FX4000T加载装置对施加双向约束的构建体进行单轴循环加载。采用延时共聚焦成像技术以非破坏性方式可视化观察胶原（重）定向过程。
可实时观察构建物中的细胞和胶原组织，内部参考系统使我们能够对细胞和胶原结构进行定位，以便进行延时分析。该模型系统的多个方面均可调整，例如细胞来源或使用健康与病变细胞。可通过添加添加剂进一步阐明胶原重塑的潜在机制，例如添加基质金属蛋白酶（MMPs）或阻断整合素。构建物的形状和大小可轻松根据特定需求进行调整，从而形成一个高度可调的模型系统，用于研究细胞和胶原的（再）组织过程。
引言
心血管组织具有显著的承重功能。特别是细胞外基质中胶原纤维的含量和排列方式，对组织的承重性能起着决定性作用，并主导整体组织强度1。在组织工程中，通常采用机械刺激（通常为循环拉伸）对构建物进行力学调控，以增强组织的有序性和力学性能2,3。然而，目前尚未完全理解在复杂组织几何结构中，拉伸如何诱导胶原排列，从而构建具有预设胶原结构的组织。这主要是因为我们对发育过程中胶原重塑的了解仍然有限。现有模型主要基于静态拉伸，仅能提供胶原重塑最终净结果的信息4-6。本文提供了一种高度可调的模型系统，可在三维条件下实时研究静态或循环拉伸影响下的胶原（重）排列过程。该组织构建物基于纤维蛋白，确保其中所有胶原均为内源性产生。通过可视化细胞和胶原在构建物中的排列，并结合内部参照系统，我们能够对细胞和胶原结构进行定位，实现延时分析。在本实验方案中，我们将以人隐静脉细胞（HVSCs）为例说明该模型系统的应用，因为这些细胞具有较强的细胞外基质生成能力以及基质重塑能力，并已在工程化心血管组织中得到广泛应用7，相关工作基于 de Jonge et al.8 的研究。
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方案
1. 人隐静脉细胞的培养
- 根据 Schnell 等9 的方案，按照二次使用材料的相关指南，从供体获取的大隐静脉中分离细胞，并将这些细胞储存于液氮中。取自一位供体的大隐静脉组织切成 2 × 2 mm 的小片，接种于六孔板中进行培养，每孔放入 2 块组织。通常可获得足够细胞，冻存约 3 瓶，每瓶含 0.25 × 106 个细胞于液氮中。人静脉平滑肌样细胞（HVSCs）被表征为肌成纤维细胞，表现为表达波形蛋白（vimentin），不表达结蛋白（desmin），且有一亚群表达 α-平滑肌肌动蛋白10。接下来开始从液氮中复苏细胞的实验流程，以扩增细胞数量。
- 将一 瓶细胞转移至 T75 组织培养瓶中，加入生长培养基（GM），培养基成分为 Advanced DMEM、50 ml 胎牛血清（FBS）、5 ml 青霉素/链霉素和 5 ml L-谷氨酰胺（L-glutamax）。每 2–3 天更换一次培养基。
- 细胞大约在 14 天后达到融合状态。将 0.5 × 106 个细胞分装至一 瓶中，储存于液氮中，记为第 1 代（passage 1）。
注意：收获 HVSCs 时无需冷冻细胞，冷冻仅用于储存。
- 将一个....
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结果
该模型系统可用于培养接种了肌成纤维细胞的纤维蛋白凝胶。图1A显示了在静态双轴约束条件下首先进行的组织培养。通过切断纤维蛋白凝胶的两个约束点，释放组织约束，形成单轴静态约束，随后组织发生收缩和重塑（图1A）。对于周期性应变，组织同样在静态双轴约束条件下培养。5天后可施加周期性单轴应变（图1B）。为了诱导胶原重新取向，可将单轴应变方向改为垂直方向（图1B）。与凝胶混合物共同接种的微球呈现出随机分布模式，可用于在延时成像中重新定位预定义的位置（图2）。图2A和2C展示了细胞、胶原和微球的图像。相同的图像分别在3天后（图2B）和2天后（图2D）再次扫描。细胞和胶原的排列模式已发生变化，但微球的分布模式被用于重新定位细胞和胶原。培养样本12天后，可产生足够量的内源性胶原，能够通过共聚焦显微镜进行可视化观察（图3和.......
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讨论
所述的细胞填充纤维蛋白构建物模型系统在研究细胞和胶原（再）排列方面具有巨大潜力（de Jonge 等15), 例如 用于组织工程目的。通过使用纤维蛋白作为初始的细胞载体，在纤维蛋白降解后，仅由细胞和内源性基质构成的组织得以形成。通过这种方式，可通过施加收缩力，刺激细胞对静态或周期性应变作出响应。16,17，感知边界刚度12或表现出应变回避。
意义： 之前已有研究使用纤维蛋白构建物来观察胶原的（重新）排列18，但无法实现施加周期性应变和/或以延时方式对构建物进行观察，而本方法可同时实现这两种操作。本模型系统中用于提供固定作用的魔术贴条带此前已有应用19，但将该技术与带有柔性膜的培养板结合，可实现长时间施加周期性应变。在此类培养板中进行细胞培养，可方便地添加和更换培养基，并在构建物仍附着且保持无菌的状态下进行实时观察，从而能够以延时或甚至实时方式研究相关的重塑过程。
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
本研究是在生物医学材料（BMM）研究所的研究项目中完成的。BMM 由荷兰经济事务、农业与创新部共同资助。谨此感谢荷兰心脏基金会（Nederlandse Hartstichting）提供的资金支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 培养用塑料器皿 | Greiner | 包括培养瓶和移液管 | |
| 高级DMEM培养基 | Gibco | 12491 | |
| 胎牛血清 | Greiner | 758075 | |
| 青霉素/链霉素 | Gibco | 10378016 | |
| GlutaMax | Gibco | 35050-079 | |
| 弹性体及固化剂 | Dow Corning Corporation | 3097358-1004 | Silastic MDX 4-4210# |
| 魔术贴 | 普通商店 | 可在普通商店购买，仅使用柔软面 | |
| Bioflex培养板 | Flexcell Int | BF-3001U | 未处理 |
| L-抗坏血酸-2-磷酸 | Sigma | A8960 | |
| ε-氨基己酸 | Sigma-Aldrich | D7754 | |
| 牛凝血酶 | Sigma | T4648 | |
| 牛纤维蛋白原 | Sigma | F8630 | |
| 0.45 微米注射器滤器 | Whatmann (Schleicher and Scheul) | 10462100 | |
| 聚苯乙烯微球 | Invitrogen | F-8829 | 蓝色荧光，直径10 μm |
| Flexcell FX-4000T | Flexcell Int | 包括矩形加载柱 | |
| 细胞追踪橙 | Invitrogen Molecular Probes | C2927 | |
| CNA35-OG488 | 由中国台湾埃因霍温理工大学生物医学工程系大分子与有机化学实验室友情提供 | ||
| 共聚焦激光扫描显微镜 | Carl Zeiss | LSM 510 Meta激光扫描显微镜及双光子-LSM模式 | |
| 两性霉素 | Gibco | 15290-018 | 细胞分离所需 |
参考文献
- Beamish, J. A., He, P., Kottke-Marchant, K., Marchant, R. E. Molecular regulation of contractile smooth muscle cell phenotype: implications for vascular tissue engineering. Tissue Eng. Part B Rev. 16, 467-491 (2010).
- Isenberg, B. C., Tranquillo, R. T.
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重印与许可
