用于成像和免疫组织化学的视网膜全层铺片制备的优化方案

摘要

本文所述方案用于整体视网膜标本的结构评估。内容包括组织解剖、将标本贴附于亲水化处理的聚四氟乙烯（PTFE）膜插片上、通过团注方式加载荧光标记物，以及比较碳二亚胺与多聚甲醛固定在细胞和突触组分免疫组织化学分析中的应用效果。

摘要

在进行免疫组织化学检测时，处理 delicate 组织可能带来一定困难。本文介绍一种方法，利用环状支撑的亲水化聚四氟乙烯（PTFE）膜，在免疫组织化学处理过程中为活体和固定组织提供结构支撑，从而可采用多种原本可能对组织造成损伤的实验方案。首先，本方法通过将荧光标记物批量加载至活体视网膜组织中进行演示。该方法可快速可视化靶向结构，同时膜支撑能够维持组织在注射过程中的完整性，并便于将样品轻松转移以进行后续成像或处理。

其次，描述了一种使用碳二亚胺固定的组织进行抗体染色的步骤。尽管多聚甲醛固定更为常见，但碳二亚胺固定能为突触蛋白的可视化提供更优的底物。碳二亚胺的一个局限性在于，所固定的组织相对脆弱；然而，通过使用支撑膜可克服这一问题。本实验以视网膜组织为例来演示这些技术，但这些方法同样适用于其他任何脆弱的组织。

引言

在完整且脆弱的组织中进行免疫组织化学染色时，操作和转移过程可能导致组织损伤。这种情况可能发生在脑切片或其他薄组织（如退化的视网膜）中。此外，某些组织固定方法虽有利于神经结构的免疫染色，但会导致组织结构稳定性下降，从而限制其应用。一个典型的例子是基于碳二亚胺的固定方法，该方法在受体和激素染色方面效果更优^1-7，但由于固定后组织稳定性差，通常被避免使用。

本文介绍一种利用亲水化聚四氟乙烯（PTFE）膜作为结构支撑，以支持固定或未固定的脆弱组织进行多种染色技术的方法。该支撑膜可在组织固定前后对其进行操作，从而在最大限度降低组织损伤风险的同时，完成多个处理步骤。总体而言，这种简单的方法可有效保持组织完整性，使原本可能因组织脆弱而难以实施的技术得以应用。因此，该方法也可成功用于制备多种类型的组织，例如在切片后易变脆弱的脑片组织。

方案

所有实验操作均按照《ARVO眼科与视觉研究中动物使用声明》的规定进行，并符合威尔康奈尔医学院批准的实验方案。动物通过二氧化碳安乐死后，继而进行颈椎脱位处理。

1. 全层视网膜的解剖

1. 处死小鼠后，摘除其眼球并置于充氧的 HEPES 缓冲 Ringer 溶液中（表 1）。
2. 用小剪刀在角巩膜缘处沿 ora serrata 环形剪开，用镊子夹住角膜缘，移除角膜。再用镊子取出晶状体。
3. 使用钝头镊尽可能去除玻璃体。此步骤对于团注注射和电生理记录至关重要；但若仅进行免疫组织化学实验，则无需执行此步。
4. 将镊子插入视网膜与眼杯之间，沿眼球周向缓慢移动，以分离视网膜与眼杯。用另一把镊子牢固夹住巩膜以固定眼杯。在视网膜与眼杯之间的位置剪断视神经，以利于视网膜与眼杯的分离。
5. 视网膜可被分割成若干部分（例如 四等分）或整体使用。若需分割，可用剪刀从视网膜周边一直剪至视神经处；若保留整个视网膜，则从周边剪至视神经中途位置。这些切口有助于制备平坦的视网膜样本。

2. 固定到亲水化PTFE膜插件上

1. 按以下方法制备膜。当进行生理记录或染料注射实验时，使用车床或手锯将支架缩短，使剩余的环高度为1 mm。
   注意：培养板插入物可以是未修饰的或经修饰的（图1A）。具体配置的选择取决于实验目的。对于免疫染色，使用未修饰的插入物即可。
2. 使用细砂纸（300目或更高）打磨粗糙表面。
3. （可选）用剪刀剪除环下方的支脚。
4. 为去除任何碎屑，用蒸馏水冲洗或超声处理膜2-3分钟。
5. 将组织贴附到膜上（图1A）。用塑料移液管吸取含有组织的溶液并滴加至膜表面。如有必要，可剪去移液管的细尖端，以避免组织在转移过程中黏附于移液管上。
6. 将视网膜的神经节细胞层（GCs）朝上放置于膜上，同时用镊子逐步去除溶液，并展开视网膜的皱褶。
7. 在膜的另一侧，将一支空注射器（1 ml）置于组织正下方。通过向后拉动活塞至0.2–0.3 ml体积处施加吸力。使用前可预先剪切注射器的持握尖端，以增大吸力作用面积。组织无需进一步处理即可牢固附着，因其已物理性嵌入膜中。

3. 伊索莱克素 Alexa 488 的团注注射

1. 制备膜片钳电极和染色液。使用Flaming/Brown拉制仪从硼硅酸盐毛细玻璃管拉制膜片钳电极，电极电阻约为1 MΩ。轻轻震断电极尖端。
2. 通过将0.3 μl的Isolectin Alexa 488储备液加入10 μl步骤1.2中所述的HEPES缓冲Ringer's溶液中，配制染色液。
3. 将样品转移至膜片钳装置进行注射（图1C）。将带有附着组织的膜置于记录室中，并用预热（37 °C）且充氧的HEPES缓冲Ringer's溶液持续灌流。
4. 将含有染料的电极置于内界膜（ILM，图2A）处。使用显微操作器进一步推进电极，使其接触并穿透内界膜。使用微点注射仪以10–20 psi的压力注射染色液，持续1秒。可选择单个或多个位置进行注射（图2B）。若无微点注射仪，可使用10 ml注射器提供正压进行注射。
5. 注射后将组织孵育10分钟。孵育期间可在落射荧光照明下观察注射组织。
6. 标记完成后，可将样品转移至显微镜进行成像。将插入物转移至玻璃底培养皿中，使视网膜面朝下（图1C）。
7. 滴加一滴HEPES溶液以保持样本湿润。
8. 在塑料环边缘涂抹2–3处真空脂，以牢固地将插入物固定在培养皿底部。
9. 将培养皿转移至显微镜载物台上。

4. 多聚甲醛和碳二亚胺固定

1. 通过将组织插入固定液中固定15分钟来固定样本。根据具体应用，可使用更长或更短的固定时间。两种固定液均可有效用于固定GFP、凝集素或荧光Alexa酰肼（e.g. 用于膜片钳记录中细胞的填充）。
   注意：固定时可使用4% 碳二亚胺或4% 多聚甲醛溶液。为保持组织粘附性，应在组织已贴附于膜上后进行固定。组织可在贴片后立即固定，或在生理记录和/或团状注射后固定。
2. 用磷酸盐缓冲液（PB）冲洗组织30分钟。此后，可将组织直接作为整体封片处理（步骤5），或切成垂直切片后再进行处理（步骤6和7）。

5. 视网膜铺片的免疫染色

1. 在24孔板（图1D）中，将视网膜组织块置于膜上，用染色液在室温下封闭1小时。
2. 用染色液将小鼠抗PSD-95一抗按1:300稀释，每孔加入约100–150 μl抗体溶液覆盖组织，于室温避光孵育48小时。为防止干燥，将未使用的孔中加入蒸馏水。
3. 用PB缓冲液漂洗20分钟，重复3次。
4. 加入用染色液按1:500稀释的驴抗小鼠Alexa 568二抗，于室温孵育24小时。
5. 用PB缓冲液漂洗20分钟，重复3次。
6. 将带有染色组织的插入膜转移至盛有PB溶液的标准3 cm培养皿中。用小剪刀将带有视网膜的部分从环状结构上剪下。
7. 将带有视网膜的膜转移至载玻片上，使视网膜朝上。吸除PB溶液，加入封片介质。在载玻片与盖玻片之间放置少量破碎的盖玻片碎片，以避免过度挤压导致视网膜损伤，然后盖上盖玻片。
8. 用指甲油密封盖玻片边缘。将载玻片置于冰箱中避光保存。

6. 膜上固定组织的垂直切片

1. 固定后，将膜上的组织依次浸入10%、20%和30%的蔗糖梯度溶液中，分别放置30分钟、1小时和过夜。过夜步骤在4 °C冰箱中进行，其余步骤均在室温下进行。
2. 使用剪刀将带有组织的膜从塑料插入环中取出。
3. 将切下的膜放置在Parafilm上，切面朝上，用Kimwipes尽量吸除多余液体。
4. 将带有组织的Parafilm放入冷冻切片机舱内，并加入一滴OCT包埋剂。使用快速冷冻装置以加速冷冻过程。
5. 取下已冻结的样本并翻转。
6. 切除多余的冻结OCT，样本三侧保留约2 mm，与持样器连接的一侧保留5–6 mm。
7. 在暴露的视网膜侧（膜侧）加一滴OCT，但连接区域保持无OCT。
8. 使带有视网膜组织的膜完全冻结。此时样本已可准备安装至切片持样器。
9. 在预冷的持样器环上加一滴OCT，立即将冻结的样本插入该液滴中。
10. 切割厚度为10–20 μm的切片，冷冻切片机温度设为-19 °C。使用预温（室温）的多聚赖氨酸黏附载玻片。将贴有切片的载玻片置于黑暗环境中41 °C加热台上约2–3分钟，以确保切片牢固黏附。
11. 将载玻片放入储存盒中，于-20 °C保存备用。

7. 视网膜切片的免疫染色

1. 从冷冻箱中取出带有切片的载玻片，室温放置1分钟，以去除冷凝水。
2. 用液态阻断剂围绕切片画圈，形成后续孵育的屏障。
3. 将载玻片放入孵育盒中，盒底加入水以防止抗体溶液蒸发。
4. 用PB缓冲液冲洗5分钟。
5. 配制相同的染色液，并按照步骤5的操作进行。一抗孵育过夜，二抗孵育1小时。盖玻片与载玻片之间不得使用破损的玻璃。

结果

本文展示了两种具有代表性的实验，这些实验通过使用亲水化处理的聚四氟乙烯（PTFE）膜来支撑视网膜全层组织，从而在染色过程中获益。第一个实验阐述了一种快速且简便的视网膜血管系统表征方法，该系统是由跨越多个视网膜层次的复杂血管网络构成的（图2）。该方法结合了异凝集素（isolectin）的团注标记与SRH的浸入式标记。这是一种高效的活体组织标记方法，可在标记后几乎立即进行成像和扫描。在视网膜中，血管可从浅层至深层被完整标记（图2E）。与扩散性较好的SRH相比，异凝集素难以有效穿透内界膜（ILM）。这一局限性可通过使用玻璃移液管将含异凝集素的溶液注射至内界膜下方加以克服。对于SRH的血管标记，建议在将组织置于插入膜上之前完成染色步骤。SRH仅标记活体组织，且在使用多聚甲醛或碳二亚胺固定后，其标记信号会消失。

第二个实验（图3）展示了使用碳二亚胺固定相较于传统的多聚甲醛固定在标记突触蛋白方面的优势。通常，由于碳二亚胺固定会导致组织相对脆弱，因此其应用受到限制。然而，将组织固定在膜上可提供足...

讨论

经过亲水化处理的聚四氟乙烯（PTFE）膜在溶液中具有高生物相容性和良好的透明度，这在处理活体组织时具有显著优势。该制备方法此前已成功用于膜片钳记录光反应的研究^8-10。本文展示了如何将该方法应用于视网膜全层标本的结构分析。

团注加载技术可有效用于标记活体组织。该技术借助膜插件的结构支撑实现。应用包括加载钙离子指示剂⁹、用荧光标记物对组织进行染色¹¹，或使用标记配体¹²。

固定组织处理也可受益于使用支撑膜。突触后密度蛋白的形态表现取决于固定时间以及固定剂的性质⁵。较长的固定时间可实现优异的组织保存效果，但会导致固定剂交联的突触蛋白抗体识别能力下降；较短的固定时间则组织保存效果较差，但可获得明亮的点状标记信号。不同研究团队对多种其他突触结构蛋白和离子通道的研究也获得了类似结果^1-7。使用膜提供结构支持，可利用碳二亚胺同时实现短时间固定，既获得突触结构清晰明亮的标记，又保证整体组织质量适用于全组织铺片和...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Millipore 细胞培养小室，12 mm， 亲水性聚四氟乙烯（Biopore），0.4 μm	Millipore	PICM01250
胰岛素注射器，1 ml	Beckton Dickinson	309659
剪刀	精细科学工具公司	15003-08	解剖用
镊子，Dumont #55，不锈钢	精细科学工具公司	11255-20	解剖用
冷冻切片机	Leica	多种型号
共聚焦显微镜系统	Nikon	多种型号
毛细玻璃管	世界精密仪器公司	1B150F-4
P-97 Flaming/Brown 微量移液器拉制仪	Sutter Instrument Co.
Picospritzer III 压力注射系统	Parker Hannifin
玻璃底培养皿	MatTek 公司	P35G-0-14-C
培养皿	Falcon	1008
一次性刻度移液管	VWR	16001-180
多孔板，24 孔	Beckton Dickinson	351147
盖玻片，#1	电子显微镜科学公司	72200-30
Polysine 黏附载玻片	电子显微镜科学公司	63412-01
显微镜载玻片	Globe	1301
液体阻断剂	电子显微镜科学公司	71312
VECTASHIELD 封片介质	Vector Laboratories	H-1000
OCT 包埋介质	Sakura	4583
Parafilm 实验室封口膜	Fisher	13-374-10
道康宁高真空润滑脂	Sigma-Aldrich	Z273554
小鼠抗 PSD95 抗体	Millipore	MABN68	抗体
驴抗小鼠 Alexa 568 抗体	Invitrogen	A10037	抗体
Isolectin Alexa 488	Invitrogen	I21411
Chemiblocker	Chemicon	2170S
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284
磺基罗丹明	Sigma-Aldrich	341738
碳二亚胺	Thermo Scientific	22980	EDC
多聚甲醛	Sigma-Aldrich	P6148