视网膜平片准备成像和免疫组化优化方案

摘要

此处描述的协议用于整体视网膜准备的结构评估。这包括组织解剖、贴样到亲水聚四氟乙烯 （PTFE） 膜插入物、荧光标记物推注负载的描述，以及用碳二亚胺和多聚甲醛固定细胞和突触成分免疫组织化学分析的比较。

摘要

在进行免疫组化评估时，处理脆弱的组织可能是一个复杂的因素。在这里，我们提出了一种方法，该方法利用环状支撑的亲水 PTFE 膜在免疫组织化学处理过程中为活组织和固定组织提供结构支撑，这允许使用各种方案，否则会对组织造成损害。首先，通过将荧光标记物推注到活的视网膜组织中来证明这一点。这种方法允许快速观察目标结构，而膜支撑物在注射过程中保持组织完整性，并允许轻松转移制剂以进行进一步成像或处理。

其次，描述了在用碳二亚胺固定的组织中进行抗体染色的程序。虽然多聚甲醛固定更常见，但碳二亚胺固定为突触蛋白的可视化提供了优越的底物。碳二亚胺的一个局限性是所得的固定组织相对脆弱;然而，这可以通过使用支撑膜来克服。视网膜组织用于演示这些技术，但它们可以应用于任何脆弱的组织。

引言

在脆弱的完整组织中进行免疫组化在处理和转移过程中存在损伤风险。这可能发生在脑切片或其他薄组织中，例如退化的视网膜。此外，有一些组织固定方法可能有利于神经元结构的免疫染色，但会导致结构稳定性受损，从而排除了它们的使用。一个特别的例子是基于碳二亚胺的固定，它优于受体和激素^1-7 的染色，但由于固定组织的不稳定性，通常避免使用。

在这里，我们描述了一种程序，该程序利用亲水 PTFE 膜在结构上支撑各种染色技术的固定或未固定的脆弱组织。支撑膜允许在固定前后作脆弱的组织，允许进行多个处理步骤，同时最大限度地降低组织损伤的风险。总体而言，这种保持组织完整性的简单方法为使用可能避免的技术提供了机会。因此，这种方法也可以成功地用于制备各种组织，例如在切片程序后变得脆弱的脑切片。

方案

在所有实验程序中，根据 ARVO 关于在眼科和视觉研究中使用动物的声明中的规定和威尔康奈尔医学院批准的方案对动物进行治疗。动物被二氧化碳安乐死，随后的宫颈脱位。

1. 整体视网膜解剖

1. 对小鼠实施安乐死后，将其眼睛摘除并放入含氧 HEPES 缓冲林格溶液中（表 1）。
2. 用小剪刀沿着锯齿叶圆周路径切割，用镊子将眼睛固定在角膜缘处，从而去除角膜。用镊子拉出镜头。
3. 使用钝边镊子尽可能多地去除玻璃体。此步骤对于推注注射和电生理记录很重要;单独进行免疫组化时没有必要。
4. 通过将镊子放在视网膜和眼罩之间，将镊子绕圆周缓慢移动，将视网膜从眼罩上分离。用第二组镊子牢牢握住巩膜，以稳定眼罩。在视网膜和眼罩之间的位置切断视神经，以缓解视网膜与眼罩的分离。
5. 视网膜可以被解剖成碎片（例如四分之一）或作为一个整体使用。要切成小块，请用剪刀从视网膜周边一直到视神经切开。或者，要使用整个视网膜，请从视神经的中间从外围切开。切口将有助于进行平坦的准备。

2. 安装在亲水 PTFE 膜插件上

1. 如下所述准备膜。进行生理记录或染料注射实验时，使用车床或手锯缩短支架，使剩余的环高度为 1 mm
   注意：培养板插入物可以是未修饰的或修饰的（图 1A）。配置的选择取决于实验的目的。对于免疫染色，未修饰的插入片段是合适的。
2. 用细（300 粒度或更高）砂纸抛光粗糙的表面。
3. （可选）用剪刀取下环下方的支脚。
4. 要去除任何碎屑，请在蒸馏水中冲洗或超声处理膜 2-3 分钟。
5. 将组织安装到膜上（图 1A）。用塑料移液管将带有一些溶液的组织放在膜的顶部。如有必要，请剪掉移液器的窄尖端，以避免组织样品在转移过程中粘附在移液器上。
6. 用神经节细胞 （GCs） 连接视网膜：在膜上，逐渐去除溶液，同时展开视网膜并用镊子展开褶皱。
7. 在膜的另一侧，将空注射器 （1 ml） 直接放在组织下方。通过向后拉柱塞至 0.2-0.3 ml 的体积来施加吸力。使用前通过切割注射器的固定尖端来增加吸力表面积。组织不需要进一步的粘附处理，因为它物理地缠绕在膜内。

3. 推注异凝集素 Alexa 488

1. 准备贴剂移液器和染色溶液。使用电阻为 ~1 MΩ 的 Flaming/Brown 拉拔器从硼硅酸盐毛细管玻璃中拉出贴片移液器。轻轻折断移液器的尖端。
2. 通过将 0.3 μl 异凝集素 Alexa 488 储备溶液加入 10 μl 步骤 1.2 中描述的 HEPES 缓冲林格溶液中来制备染色溶液。
3. 将样品转移到膜片钳设置中进行注射（图 1C）。将带有附着组织的膜放入用加热 （37 °C） 和含氧的 HEPES 缓冲林格溶液灌注的记录室中。
4. 将含有染料的移液器靠在内限制膜上（ILM，图 2A）。使用显微作器，进一步将移液器推进到 ILM 上，直到它穿透它。使用 picospritzer 以 10-20 psi 的压力注入染色溶液 1 秒。单个或多个位置可能成为注射目标（图 2B）。如果没有 picospritzer，可以使用 10 ml 注射器提供注射用正气压。
5. 孵育注射的组织 10 分钟。在孵育过程中，可以在落射荧光照明下观察注射的组织。
6. 标记后，可以将制剂带到显微镜下进行成像。将插入物转移到玻璃底培养皿中，将视网膜面朝下（图 1C）。
7. 加入一滴 HEPES 溶液以保持标本湿润。
8. 在塑料环的周边放置 2-3 点真空润滑脂，以将插入物牢固地固定在培养皿底部。
9. 将培养皿转移到显微镜载物台上。

4. 多聚甲醛和碳二亚胺固定

1. 通过将插入物转移到固定剂中 15 分钟来固定样品。根据应用，可以使用更长或更短的固定时间。两种固定剂均可有效用于固定 GFP、异凝集素或荧光 Alexa 酰肼（例如，用于填充膜片钳记录中的细胞><）。 注意：对于固定，可以使用 4% 碳二亚胺或 4% 多聚甲醛溶液。为了保持粘附性，应在组织已经附着到膜上后进行固定。组织可以在安装后立即固定，也可以在生理记录和/或推注注射后立即固定。
2. 在磷酸盐缓冲液 （PB） 中冲洗组织 30 分钟。在此之后，可以将组织加工为整体（步骤 5）或切割成垂直切片，然后进行处理（步骤 6 和 7）。

5. 视网膜整体的免疫染色

1. 在 24 孔培养皿（图 1D）中，在染色溶液中将视网膜碎片封闭在膜上 1 小时。
2. 在染色溶液中以 1：300 的比例稀释小鼠抗 PSD-95 一抗，并在室温下避光应用 48 小时。在每个孔中加入 ~100-150 μl 抗体溶液和组织。为防止变干，请在未使用的井中加入蒸馏水。
3. 在 PB 中冲洗 20 分钟，3 次。
4. 在驴抗小鼠 Alexa 568 二抗中孵育 24 小时，该二抗以 1：500 的比例溶解在染色溶液中。
5. 在 PB 中冲洗 20 分钟，3 次。
6. 将带有染色组织的插入物放入装有 PB 溶液的标准 3 cm 培养皿中。用小剪刀从环上剪下包含视网膜的膜部分。
7. 将膜上的视网膜转移到向上滑动的视网膜上。去除 PB，添加封固剂。将小块破损的盖玻片玻璃放在载玻片和盖玻片玻璃之间，以避免对视网膜进行大面积挤压和损伤。放置盖玻片。
8. 用指甲油将盖玻片密封到位。将玻片放在黑暗中，放在冰箱中。

6. 膜安装组织的垂直切片

1. 固定后，将膜上的组织浸入 10%、20% 和 30% 蔗糖的蔗糖梯度溶液中，分别浸泡 30 分钟、1 小时和过夜。过夜步骤在 4 °C 下在冰箱中进行，所有其他步骤在室温下进行。
2. 用剪刀从塑料插入环上取下带有组织的膜。
3. 将切下的膜放在视网膜向上的石蜡膜上，并用 Kimwipes 去除尽可能多的溶液。
4. 将带有组织的封口膜放入低温恒温器室中，并加入一滴 OCT 培养基。使用速冻装置加速冷冻。
5. 分离冷冻样品并将其翻转过来。
6. 切开多余的冷冻 OCT。在样品的三个侧面周围留出约 2 mm 的距离，并在连接到支架的一侧留出 5-6 mm。
7. 用一滴 OCT 覆盖暴露的视网膜侧（膜侧），保持附着区域空闲。
8. 用视网膜组织冷冻膜。现在样品已准备好放置在切割架上。
9. 将一滴 OCT 滴在保冷环上。立即将冷冻样品插入液滴中。
10. 切割 10-20 μm 厚的切片，将低温恒温器温度设置为 -19 °C。使用温暖的（室温）聚苷粘附载玻片。将带有附着切片的载玻片在黑暗中放在加热平台上 ~2-3 分钟 （41 °C），以确保切片牢固粘附。
11. 将载玻片放入储存盒中，并保持在 -20 °C 直至使用。

7. 视网膜切片的免疫染色

将
1. 载玻片和切片从冰箱中取出。让它们在室温下放置 1 分钟以去除冷凝水。
2. 用液体阻滞剂包围切片，为进一步孵育创造屏障。
3. 将玻片放入孵育盒中。用水盖住盒子底部，以防止抗体溶液蒸发。
4. 用 PB 冲洗 5 分钟。
5. 准备相同的染色溶液，并按照步骤 5 中的步骤进行作。与一抗孵育过夜，与二抗孵育 1 小时。不要在盖玻片和载玻片之间使用碎玻璃。

结果

这里演示了两个具有代表性的实验，它们受益于在染色过程中使用亲水 PTFE 膜来支持整个视网膜。第一个实验说明了快速简单地表征视网膜脉管系统的方法，视网膜脉管系统是一个跨越多个视网膜层的复杂血管网络（图 2）。这种方法将异凝集素的推注负载与 SRH 的浸没标记相结合。这是一种标记活组织的有效方法，几乎可以立即进行可视化和扫描。在视网膜中，可以从浅层到深层标记血管（图 2E）。与相对良好的扩散性 SRH 相比，异凝集素不能很好地渗透穿过内限制膜 （ILM）。通过用玻璃移液管将含有异凝集素的溶液注入 ILM 下方来克服这一限制。对于 SRH 血管标记，最好在贴样到插入物上之前对组织进行染色。SRH 仅对活组织进行染色，用多聚甲醛或碳二亚胺固定后标记消失。

第二个实验（图 3）显示了在标记突触蛋白时，用碳二亚胺固定优于用多聚甲醛常规固定的优势。通常，避免使用碳二亚胺固定剂，因为它会导致组织相对脆弱。然而，将组织安装在膜上可确保足够的结构支撑，从而缓解了这个问题。用碳二亚胺短暂固定，然后对突...

讨论

亲水PTFE膜的高生物相容性和溶液透明度在处理活组织时具有优势。该制剂已成功用于早期工作中，用于光响应^8-10 的膜片钳记录。在这里，我们展示了如何采用这种方法对整个安装视网膜进行结构分析。

推注加载技术可以有效地用于标记活组织。该技术得到了膜插入物的结构支撑的帮助。应用包括钙指示剂⁹的加载，用荧光标记^物11或标记配体¹²对组织进行染色。

固定组织处理也可以受益于使用支撑膜。突触后密度蛋白外观的差异取决于固定时间和固定剂的性质⁵.较长的固定时间导致出色的组织保存，但对由固定剂交联的突触蛋白的抗体识别较差。较短的固定时间会导致组织保存不良，但点状标记明亮。不同组^1-7 的许多其他突触结构蛋白和离子通道也获得了类似的结果。使用膜作为结构支撑，可以使用碳二亚胺同时实现较短的固定时间、突触结构的明确明亮标记以及全安装和低温恒温器切片制备的足够整体组织质量。制剂稳定且易于处理，结果可重复。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Millicell 细胞培养小室，12 mm， 亲水性 PTFE （Biopore），0.4 &μ;m	Millipore	PICM01250
胰岛素注射器，1 ml	Beckton Dickinson	309659
剪刀	Fine Science Tools	15003-08	解剖
钳，Dumont #55，inox	Fine Science Tools	11255-20	解剖
低温恒温	Leica	各种
共聚焦显微镜系统	Nikon	各种
毛细管玻璃	World Precision Instruments	1B150F-4
P-97 火焰/棕色微量移液器拉拔器	Sutter Instrument Co.
Picospritzer III	派克汉尼汾
玻璃底培养皿	MatTek Corporation	P35G-0-14-C
培养皿	Falcon	1008
一次性刻度移液管	VWR	16001-180
多孔板，24 孔	贝克顿狄金森	351147
盖玻片，#1	电子显微镜科学	72200-30
聚苷粘附玻片	电子显微镜科学	63412-01
显微镜载玻	地球	1301
液体阻滞剂	电子显微镜科学	71312
VECTASHIELD 封固剂	Vector Laboratories	H-1000
OCT培养基	Sakura	4583
石蜡膜实验室胶片	Fisher	13-374-10
道康宁高真空润滑脂	Sigma-Aldrich	Z273554
小鼠抗 PSD95	Millipore	MABN68	抗体
驴抗小鼠 Alexa 568	Invitrogen	A10037	抗体
异凝集素 Alexa 488	Invitrogen	I21411
阻滞剂	Chemicon	2170S
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284
磺酰罗丹明	Sigma-Aldrich	341738
碳二亚胺	Thermo Scientific	22980	EDC
多聚甲醛	Sigma-Aldrich	P6148