用于成像和免疫组织化学的视网膜全层铺片制备的优化方案

摘要

本文所述方案用于整体视网膜标本的结构评估。内容包括组织解剖、将标本贴附于亲水化处理的聚四氟乙烯（PTFE）膜插片上、通过团注方式加载荧光标记物，以及比较碳二亚胺与多聚甲醛固定在细胞和突触组分免疫组织化学分析中的应用效果。

摘要

在进行免疫组织化学检测时，处理 delicate 组织可能带来一定困难。本文介绍一种方法，利用环状支撑的亲水化聚四氟乙烯（PTFE）膜，在免疫组织化学处理过程中为活体和固定组织提供结构支撑，从而可采用多种原本可能对组织造成损伤的实验方案。首先，本方法通过将荧光标记物批量加载至活体视网膜组织中进行演示。该方法可快速可视化靶向结构，同时膜支撑能够维持组织在注射过程中的完整性，并便于将样品轻松转移以进行后续成像或处理。

其次，描述了一种使用碳二亚胺固定的组织进行抗体染色的步骤。尽管多聚甲醛固定更为常见，但碳二亚胺固定能为突触蛋白的可视化提供更优的底物。碳二亚胺的一个局限性在于，所固定的组织相对脆弱；然而，通过使用支撑膜可克服这一问题。本实验以视网膜组织为例来演示这些技术，但这些方法同样适用于其他任何脆弱的组织。

引言

在完整且脆弱的组织中进行免疫组织化学染色时，操作和转移过程可能导致组织损伤。这种情况可能发生在脑切片或其他薄组织（如退化的视网膜）中。此外，某些组织固定方法虽有利于神经结构的免疫染色，但会导致组织结构稳定性下降，从而限制其应用。一个典型的例子是基于碳二亚胺的固定方法，该方法在受体和激素染色方面效果更优^1-7，但由于固定后组织稳定性差，通常被避免使用。

本文介绍一种利用亲水化聚四氟乙烯（PTFE）膜作为结构支撑，以支持固定或未固定的脆弱组织进行多种染色技术的方法。该支撑膜可在组织固定前后对其进行操作，从而在最大限度降低组织损伤风险的同时，完成多个处理步骤。总体而言，这种简单的方法可有效保持组织完整性，使原本可能因组织脆弱而难以实施的技术得以应用。因此，该方法也可成功用于制备多种类型的组织，例如在切片后易变脆弱的脑片组织。

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方案

所有实验操作均按照《ARVO眼科与视觉研究中动物使用声明》的规定进行，并符合威尔康奈尔医学院批准的实验方案。动物通过二氧化碳安乐死后，继而进行颈椎脱位处理。

1. 全层视网膜的解剖

1. 处死小鼠后，摘除其眼球并置于充氧的 HEPES 缓冲 Ringer 溶液中（表 1）。
2. 用小剪刀在角巩膜缘处沿 ora serrata 环形剪开，用镊子夹住角膜缘，移除角膜。再用镊子取出晶状体。
3. 使用钝头镊尽可能去除玻璃体。此步骤对于团注注射和电生理记录至关重要；但若仅进行免疫组织化学实验，则无需执行此步。
4. 将镊子插入视网膜与眼杯之间，沿眼球周向缓慢移动，以分离视网膜与眼杯。用另一把镊子牢固夹住巩膜以固定眼杯。在视网膜与眼杯之间的位置剪断视神经，以利于视网膜与眼杯的分离。
5. 视网膜可被分割成若干部分（例如 四等分）或整体使用。若需分割，可用剪刀从视网膜周边一直剪至视神经处；若保留整个视网膜，则从周边剪至视神经中途位置。这些切口有助于制备平坦的视网膜样本。

2. 固定到亲水化PTFE膜插件上

1. 按以下方法制备膜。当进行生理记录或染料注射实验时，使用车床或手锯将支架缩短，使剩余的环高度为1 mm。
   注意：培养板插入物可以是未修饰....

结果

本文展示了两种具有代表性的实验，这些实验通过使用亲水化处理的聚四氟乙烯（PTFE）膜来支撑视网膜全层组织，从而在染色过程中获益。第一个实验阐述了一种快速且简便的视网膜血管系统表征方法，该系统是由跨越多个视网膜层次的复杂血管网络构成的（图2）。该方法结合了异凝集素（isolectin）的团注标记与SRH的浸入式标记。这是一种高效的活体组织标记方法，可在标记后几乎立即进行成像和扫描。在视网膜中，血管可从浅层至深层被完整标记（图2E）。与扩散性较好的SRH相比，异凝集素难以有效穿透内界膜（ILM）。这一局限性可通过使用玻璃移液管将含异凝集素的溶液注射至内界膜下方加以克服。对于SRH的血管标记，建议在将组织置于插入膜上之前完成染色步骤。SRH仅标记活体组织，且在使用多聚甲醛或碳二亚胺固定后，其标记信号会消失。

第二个实验（图3）展示了使用碳二亚胺固定相较于传统的多聚甲醛固定在标记突触蛋白方面的优势。通常，由于碳二亚胺固定会导致组织相对脆弱，因此其应用受到限制。然而，将组织固定在膜上可提供足.......

讨论

经过亲水化处理的聚四氟乙烯（PTFE）膜在溶液中具有高生物相容性和良好的透明度，这在处理活体组织时具有显著优势。该制备方法此前已成功用于膜片钳记录光反应的研究^8-10。本文展示了如何将该方法应用于视网膜全层标本的结构分析。

团注加载技术可有效用于标记活体组织。该技术借助膜插件的结构支撑实现。应用包括加载钙离子指示剂⁹、用荧光标记物对组织进行染色¹¹，或使用标记配体¹²。

固定组织处理也可受益于使用支撑膜。突触后密度蛋白的形态表现取决于固定时间以及固定剂的性质⁵。较长的固定时间可实现优异的组织保存效果，但会导致固定剂交联的突触蛋白抗体识别能力下降；较短的固定时间则组织保存效果较差，但可获得明亮的点状标记信号。不同研究团队对多种其他突触结构蛋白和离子通道的研究也获得了类似结果^1-7。使用膜提供结构支持，可利用碳二亚胺同时实现短时间固定，既获得突触结构清晰明亮的标记，又保证整体组织质量适用于全组织铺片和.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Millipore 细胞培养小室，12 mm， 亲水性聚四氟乙烯（Biopore），0.4 μm	Millipore	PICM01250
胰岛素注射器，1 ml	Beckton Dickinson	309659
剪刀	精细科学工具公司	15003-08	解剖用
镊子，Dumont #55，不锈钢	精细科学工具公司	11255-20	解剖用
冷冻切片机	Leica	多种型号
共聚焦显微镜系统	Nikon	多种型号
毛细玻璃管	世界精密仪器公司	1B150F-4
P-97 Flaming/Brown 微量移液器拉制仪	Sutter Instrument Co.
Picospritzer III 压力注射系统	Parker Hannifin
玻璃底培养皿	MatTek 公司	P35G-0-14-C
培养皿	Falcon	1008
一次性刻度移液管	VWR	16001-180
多孔板，24 孔	Beckton Dickinson	351147
盖玻片，#1	电子显微镜科学公司	72200-30
Polysine 黏附载玻片	电子显微镜科学公司	63412-01
显微镜载玻片	Globe	1301
液体阻断剂	电子显微镜科学公司	71312
VECTASHIELD 封片介质	Vector Laboratories	H-1000
OCT 包埋介质	Sakura	4583
Parafilm 实验室封口膜	Fisher	13-374-10
道康宁高真空润滑脂	Sigma-Aldrich	Z273554
小鼠抗 PSD95 抗体	Millipore	MABN68	抗体
驴抗小鼠 Alexa 568 抗体	Invitrogen	A10037	抗体
Isolectin Alexa 488	Invitrogen	I21411
Chemiblocker	Chemicon	2170S
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284
磺基罗丹明	Sigma-Aldrich	341738
碳二亚胺	Thermo Scientific	22980	EDC
多聚甲醛	Sigma-Aldrich	P6148