需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

利用蛋白A膜吸附剂和简化的操作流程分离与表征表达人源Fc嵌合蛋白

6.4K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/51023

⸱

2014年1月8日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, Ohio University, 2Biomedical Engineering Program, Russ College of Engineering and Technology, Ohio University, 3Department of Dermatology, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School

本文内容

摘要

与使用蛋白A琼脂糖珠填充柱的传统亲和层析相比，蛋白A膜吸附剂可显著加快实验室规模的抗体及其他表达Fc片段蛋白的分离纯化。 采用适当的分析与定量方法可进一步加速蛋白质处理过程，使分离与表征在一天工作时间内完成，而非20多个工作小时。

摘要

从细胞培养上清液和裂解细胞溶液中纯化生物分子，可采用亲和层析法实现从实验室规模到工业规模的过渡。 尽管使用填充在层析柱中的多孔蛋白A琼脂糖微球进行亲和层析，是目前实验室规模分离抗体及表达IgG Fc片段的重组蛋白最常用的方法，但该过程可能耗时且成本较高。 对于必须从稀释溶液中回收数百微克至毫克级蛋白的小型基础科学实验室而言，时间和经费限制尤为严峻，这些实验室往往缺乏高压液体输送系统和/或具备生物分离经验的技术人员。此外，产物的定量与表征过程也可能显著延长处理时间，持续数个工作日，并增加耗材、人力等成本（etc.）。 因此，亟需一种快速、低成本且高效的实验方案，用于实验室规模下含Fc片段的抗体及其他蛋白的分离与表征。 为此，我们设计了一种操作流程，由经验有限的技术人员操作可在9小时以内（约一个工作日）完成，最快仅需4小时，相较传统方法所需的20小时以上工作时间大幅缩短。所需大多数设备在标准的生物医学、生物化学及（生物）化学工程实验室中均可 readily 获得，所有试剂均可商业化采购。 为展示该方案的应用，本文提供了代表性实验结果：利用蛋白A膜吸附器从细胞培养上清液中分离获得嵌合型 鼠源半乳糖凝集素-1与人Fc融合蛋白（Gal-1hFc）。纯化后的Gal-1hFc采用快速Western印迹分析法进行定量，并通过流式细胞术进行表征。该优化流程可适用于其他表达Fc片段的蛋白（如抗体）的纯化，亦可根据需要调整以整合不同的定量与表征方法。 

引言

利用蛋白A亲和层析法，可以从细胞培养上清液和稀释的裂解细胞溶液中分离表达免疫球蛋白G（IgG）Fc片段的抗体和重组蛋白。在基础科学、工程实验室以及工业领域，尽管存在成本高昂和处理时间长的问题1-3，最常用的方法仍是使用填充有孔隙性蛋白A包被的琼脂糖、玻璃或聚合微珠的层析柱进行亲和层析。众所周知，亲和层析在实验室和工业生产中均是成本最高且处理速度最慢的环节2,4。因此，已开发出多种改进方法，旨在降低费用和缩短处理时间，同时不降低整个工艺流程中的产物回收率1,2,5-7。其中，使用蛋白A膜吸附器进行亲和层析在分离抗体及其他表达Fc片段的蛋白方面展现出尤为良好的前景2,5,7-10。与柱层析中Fc片段的捕获受限于扩散（即 表达Fc的蛋白必须扩散进入并穿过内部孔隙才能到达大部分蛋白A结合位点）且柱压降较高不同，膜吸附器中的传质由整体对流驱动，从而避免了扩散限制8,9,11,12。此外，膜吸附器的压降较低，因此相比填充微珠的层析柱可实现更快的灌注流速8,9,11,12。因此，在实验室规模的分离过程中，膜层析预计可比柱层析节省数小时时间，并提高产物捕获效率。此外，已有研究提出了针对膜吸附器中IgG吸附的数学模型8,9,11,12，使终端用户能够在实验前预测其性能表现。

基础科学与工程实验室中的另一个瓶颈是Fc表达蛋白的表征。然而，选择合适的方法来完成表征实验，例如Western blot，可显著缩短产品检测所需的时间。 例如，在非连续缓冲系统中采用半干转法，可在数分钟内完成将蛋白质从SDS-PAGE凝胶电转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜的过程，而相比之下，在连续缓冲系统中采用槽式（湿转）方法则需1-2小时13。

本文描述了一种快速、低成本且高效的方案，用于分离和表征表达人IgG Fc片段的嵌合融合蛋白。大多数设备在标准的基础生物医学、生物学、化学以及（生物）化学工程实验室中均可方便获得，所有试剂均可从商业途径获取。 尽管代表性结果来源于小鼠半乳糖凝集素-1/人Fc嵌合融合蛋白（Gal-1hFc）的分离与表征，但该优化后的方案同样适用于其他含有Fc片段的分子的分离，例如抗体、Fc片段本身或其他Fc融合蛋白。 与传统方法相比，我们的改进显著缩短了处理时间（最短仅需4小时，通常约9小时，而传统方法需20小时以上的工作时间），同时实现了相当甚至更优的产物回收率。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

1. 验证与蛋白A的亲和力

  1. 验证表达 Fc 的蛋白质（重组融合蛋白或 IgG 抗体，下文简称“蛋白质”）对蛋白 A 具有可接受的亲和力14-17 在使用蛋白A膜吸附剂之前，检测储备溶液中该蛋白的存在情况（例如 经1,000 × g离心5分钟以沉淀悬浮细胞，澄清细胞培养上清。采用流式细胞术、蛋白质印迹、ELISA 等等. 根据实验室偏好，检测蛋白功能和/或Fc的存在。理想情况下，对细胞培养上清液中的蛋白进行定量（第6步），以避免超出蛋白A膜吸附剂的载量。若检测到蛋白，则继续进行后续操作。

2. 准备蛋白A膜吸附剂和细胞培养上清液

  1. 按照制造商说明准备膜吸附剂。切勿让空气进入膜吸附剂。所有流经膜吸附剂的溶液均应处于室温，并使用 0.22 µm 滤器预先过滤。用 10 ml 注射器吸取经 0.22 µm 滤器过滤的杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）或所选缓冲液，并排出气泡。在使用前立即用 DPBS 灌流，以去除保存液并平衡膜吸附剂。
  2. 在将细胞培养上清液灌流通过膜吸附剂之前，立即使用真空驱动的 0.22 µm 无菌过滤装置进行过滤。

3. 上样蛋白A膜吸附剂

  1. 用鲁尔锁扣注射器（30 ml 或更大）吸取细胞培养上清液，并排出所有气泡。
  2. 组装材料和设备，如图所示 图1将注射器连接至膜吸附剂的入口。将柔性管路连接至膜吸附剂的出口。如需要，可在注射器与膜吸附剂之间安装一个0.22 µm的注射器滤器。使用烧瓶或瓶子收集来自吸附剂的穿流液（亦称为滤过液）。
  3. 将注射泵设置为所需的体积流速，但不得超过制造商推荐的流速（例如 10 ml/min）。将细胞培养上清液通过膜吸附剂进行灌流，并用烧杯或其他容器收集穿流液。根据需要，重新加载上清液至注射器中。
  4. 如有需要，可使用流式细胞术、蛋白质印迹或酶联免疫吸附测定检测流穿液中是否存在蛋白质， 等等根据实验室偏好而定。通常无需重新灌注流经的液体。

4. 从膜吸附剂中洗脱蛋白质

  1. 用10 ml DPBS洗涤膜吸附剂，以去除任何未结合的蛋白质。
  2. 以所需的流速从膜吸附剂中洗脱蛋白质（例如 1 ml/min）流速，使用10-15 ml洗脱缓冲液（例如 胺类洗脱缓冲液（pH 2.8）。用含有中和缓冲液的离心管收集洗脱液例如 1 M Tris（pH 9.4）按洗脱体积的10%加入（1.0–1.5 ml）。
  3. 或者，用10–15 ml洗脱缓冲液，每次1 ml，分步洗脱蛋白至含有100 µl中和缓冲液的离心管中。采用首选的表征方法检测各组分中蛋白的存在。
  4. 根据制造商的说明再生膜吸附剂。依次灌注10 ml经0.22 µm滤膜过滤的DPBS或所选缓冲液、10 ml经0.22 µm滤膜过滤的含1 N NaCl的50 mM NaOH溶液，最后灌注10 ml经0.22 µm滤膜过滤的DPBS。长期储存时，使用含20%乙醇的DPBS填充膜吸附剂，并于4 ºC保存。

5. 浓缩并透析蛋白质

  1. 将所有洗脱液（或根据步骤4.3确定含有蛋白质的洗脱组分）加入一个分子量截留值为10 kDa的离心过滤装置中。按照制造商说明进行离心操作。
  2. 使用小体积透析装置（分子量截留值为10 kDa），按照制造商说明将截留物在选定缓冲液中进行透析。如果存在蛋白质沉淀的风险，可能需要向透析后的样品中添加缓冲液。如需，可在执行步骤6之前将透析后的样品冷藏保存，但不建议在无防腐剂条件下长期储存。

6. 通过快速 Western 印迹法对纯化产物进行定量与表征

  1. 在选定的凝胶中，通过 SDS-PAGE 电泳分离纯化的蛋白质和 Fc 标准品，根据需要选择还原或非还原条件18-20使用小型凝胶而非中型凝胶以缩短电泳时间。
    1. 若尚不清楚，需确定 Fc 标准品的浓度范围，在该范围内条带信号强度与上样量呈线性关系例如 0.1–1 mg）。使用与定量和表征纯化蛋白时相同的凝胶、电泳条件、转膜条件及试剂。
    2. 加载多种上样量的纯化蛋白，包括用DPBS稀释的样品，以确保纯化蛋白条带信号处于图像分析中Fc标准品的线性信号范围内。
  2. 使用半干式转膜仪，在不连续缓冲系统中将蛋白质从凝胶转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜13，按照印迹膜制造商的说明进行操作。转膜时间通常为5-10分钟。如需验证转膜效率，可在转膜后对凝胶进行考马斯亮蓝染色。21.
  3. 使用碱性磷酸酶（AP）或辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗-Fc或抗-IgG抗体，根据实验室偏好，结合真空辅助的蛋白质检测系统进行免疫印迹。免疫印迹时间通常少于1小时。
  4. 使用选择的底物和方法进行免疫印迹显色（例如 AP底物和增强化学发光
  5. 通过图像分析对纯化蛋白进行定量。对Fc标准品的条带信号进行线性回归分析。如果R2>0.90，使用直线方程根据条带信号计算蛋白质含量。如有必要，需考虑样品稀释因素。由于蛋白质定量基于Fc进行，需根据该蛋白质与Fc之间的分子量差异对数值进行校正。如果R2<0.90，需完整重复步骤6。
  6. 通过流式细胞术、Western 印迹、ELISA 等功能测定或检测 Fc 的方法验证蛋白质 等等根据实验室偏好。
  7. 将纯化的蛋白质溶液稀释至所需浓度，并/或在分装保存（冷冻或其他方式）前加入任何所需的防腐剂或稳定剂。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

用于分离和表征表达Fc蛋白的简化方案通常用于从稀释的细胞培养上清液中纯化人Fc融合小鼠嵌合型半乳糖凝集素-1（Gal-1hFc）。图2中的流程图展示了该方案中各步骤的工作流程及所需时间。对于典型的300 ml上清液批次，若进行可选的洗脱组分流式细胞术检测，总处理时间约为9小时。若因缺乏流式细胞仪或根据实验室个体偏好省略所有流式细胞术分析，则总处理时间可缩短至4小时。通常情况下，处理时间取决于操作人员的经验、所处理上清液的体积以及所采用的定量和表征方法。

流式细胞术用于检测功能性 Gal-1hFc 的存在（即 Gal-1 能够在起始细胞培养上清液中检测到其在乳腺癌细胞上的配体；新鲜细胞培养基作为阴性对照18,22 . 一旦验证了细胞培养上清液中的Gal-1hFc（图3A），使用注射泵以10 ml/min的流速对蛋白A膜吸附剂进行上样（在2 ml膜吸附剂中产生0.5 cm/min的表观流速或体积通量）图1). 膜吸附剂高效捕获并保留了Gal-1h...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

本文所述方案旨在快速分离和表征表达人源Fc的嵌合融合蛋白（Gal-1hFc），同时不显著降低产物回收率或增加成本。 该简化工作流程的关键组分包括：用于分离的蛋白A膜吸附器，以及用于Western blot检测的半干转印和真空辅助免疫印迹法。

从300 ml细胞培养上清液中分离和表征Gal-1hFc的处理时间显著缩短（优化后的方案约需9小时，而传统方案需20小时以上），这主要归因于前述关键组分的引入，尤其是膜吸附器的应用。在推荐的最大流速（10 ml上清液/min）下，膜吸附器的上样可在30分钟内完成。 在我们的实验室中，从蛋白A膜吸附剂中回收Gal-1hFc的得率通常为10-30%，当细胞培养上清液中Gal-1hFc浓度为5-10 mg/ml时，经验丰富的实验人员通常可实现约30%的回收率。 最多仅实现了约50%的回收率。 由于以下原因，完全回收产品几乎是不可能的：(a) 膜吸附剂上的蛋白A对表达Fc的蛋白具有特异性保留作用图3B 和 3C）以及（b）蛋白质在分离过程中非特异...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

致谢

作者谨此感谢 Luis F. Delgadillo 先生（俄亥俄大学化学与生物分子工程系）、Matthew H. Williams 先生（俄亥俄大学化学与生物分子工程系）以及 Filiberto Cedeno-Laurent 博士（布莱根妇女医院与哈佛医学院）提供的专业技术支持。 作者同时感谢俄亥俄大学化学与生物分子工程系及生物医学工程项目 2011 年冬季学期 CHE 404/BME 504 课程和 2012 年秋季学期 CHE 4830/BME 5830 课程的学生们所提供的技术建议与讨论。本研究得到了以下资助：美国国家科学基金会（NSF）重大研究仪器项目 CBET-1039869（MMB）、NSF CBET-1106118（MMB）、皮肤病学基金会研究资助 A050422（SRB）、美国国立卫生研究院（NIH）国家癌症研究所资助 1R15CA161830-01（MMB）、NIH Kirschstein-NRSA 博士后奖学金 F32CA144219-01A1（SRB）、NIH/NCI R01CA173610（CJD）， 以及 NIH NCCAM 资助 R01AT004628（CJD）。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Protein A 膜吸附器（Sartobind Protein A 2 ml） Sartorius-Stedim93PRAP06HB-12--A
Amicon Ultra 离心滤器，10 kDa，4 mlMilliporeUFC801008如需要可使用 15 ml 体积
无菌真空滤器单元，0.22 µm，500 mlMilliporeSCGPU05RE
10 ml 带鲁尔锁扣针头的注射器BD301604
30 ml 带鲁尔锁扣针头的注射器BD309650
Tygon 实验室管路（1/16 英寸 × 1/8 英寸 × 50 英尺）Cole ParmerWU-95903-16
Slide-A-Lyzer MINI 透析装置（10K MWCO）Thermo Scientific69576
Snap i.d. 抗体收集托盘EMD MilliporeWBAVDABTR
Snap i.d. 单孔印迹支架EMD MilliporeWBAVDBH01
洗脱缓冲液Thermo Scientific21004
Tris，超纯Fisher Scientific819623
氯化钠Fisher Scientific7647-14-5
Tween 20Fisher ScientificBP337-100
DPBSThermo ScientificSH30028.02
含 Ca2+/Mg2+ 的 DPBSLife Technologies14080-055
BSASigmaA9647
人源 FcBethyl Research LaboratoriesP80-104
抗人 Fc-APCJackson Immunoresearch109136170
抗人 Fc-APBio-Rad170-5018
碱性磷酸酶底物PromegaS3841
流式细胞术管（5 ml 聚苯乙烯或聚丙烯）BD352054
注射泵Harvard Apparatus55-2226蠕动泵也可接受
蛋白质凝胶电泳系统Bio-Rad Laboratories552BR094876任何凝胶电泳系统均可使用，但小型凝胶系统运行最快
半干转印仪Bio-Rad Laboratories690BR006163任何转印系统均可接受，但非连续性转印系统进行电泳转印速度最快
SNAP i.d. 真空辅助蛋白质检测系统EMD MilliporeWBAVDBASE已有升级型号替代该特定仪器，但两者性能相当

参考文献

  1. Gagnon, P. Technology trends in antibody purification. J. Chromatogr. A. 1221, 57-70 (2012).
  2. Gottschalk, U. Bioseparation in antibody manufacturing: The good, the bad and the ugly. Biotechnol. Prog. 24, 496-503 (2008).
  3. Liu, H. F., Ma, J., Winter, C., Bayer, R. Recovery and purification process development for monoclonal antibody production. MAbs. 2, 480-499 (2010).
  4. Low, D., O'Leary, R., Pujar, N. S. Future of antibody purification. J. Chromatogr. B Anal. Technol. Biomed. Life. Sci. 848, 48-63 (2007).
  5. Boi, C. Membrane adsorbers as purification tools for monoclonal antibody purification. J. Chromatogr. B Anal. Technol. Biomed. Life. Sci. 848, (1016).
  6. Cuatrecasas, P. Protein purification by affinity chromatography. Derivatizations of agarose and polyacrylamide beads. J. Biol. Chem. 245, 3059-3065 (1970).
  7. Shukla, A. A., Gottschalk, U. Single-use disposable technologies for biopharmaceutical manufacturing. Trends Biotechnol. 31, 147-154 (2013).
  8. Boi, C., Dimartino, S., Sarti, G. C. Performance of a new protein a affinity membrane for the primary recovery of antibodies. Biotechnol Prog. 24, 640-647 (2008).
  9. Dancette, O. P., Taboureau, J., Tournier, E., Charcosset, C., Blond, P. Purification of immunoglobulins g by protein a/g afinity membrane chromatography. J. Chromatogr. B. 723, 61-68 (1999).
  10. Thommes, J., Etzel, M. Alternatives to chromatographic separations. Biotechnol. Prog. 23, 42-45 (2007).
  11. Boi, C., Dimartino, S., Sarti, G. C. Modelling and simulation of affinity membrane adsorption. J. Chromatogr. A. 1162, 24-33 (2007).
  12. van Beijeren, P., et al. Computer-aided process design of affinity membrane adsorbers: A case study on antibodies capturing. Chem. Pap. 62, 458-463 (2008).
  13. Lauriere, M. A semidry electroblotting system efficiently transfers both high- and low-molecular-weight proteins separated by sds-page. Anal. Biochem. 212, 206-211 (1993).
  14. Darcy, E., Leonard, P., Fitzgerald, J., Danaher, M., O'Kennedy, R. Purification of antibodies using affinity chromatography. Methods Mol. Biol. 681, 369-382 (2011).
  15. Hjelm, H., Hjelm, K., Sjoquist, J. Protein a from staphylococcus aureus. Its isolation by affinity chromatography and its use as an immunosorbent for isolation of immunoglobulins. FEBS Lett. 28, 73-76 (1972).
  16. Hober, S., Nord, K., Linhult, M. Protein a chromatography for antibody purification. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 848, 40-47 (2007).
  17. Kronvall, G. A surface component in group a, c, and g streptococci with non-immune reactivity for immunoglobulin g. J. Immunol. 111, 1401-1406 (1973).
  18. Cedeno-Laurent, F., et al. Development of a nascent galectin-1 chimeric molecule for studying the role of leukocyte galectin-1 ligands and immune disease modulation. J. Immunol. 185, 4659-4672 (2010).
  19. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage t4. Nature. 227, 680-685 (1970).
  20. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 4350-4354 (1979).
  21. Reisner, A. H., Nemes, P., Bucholtz, C. The use of Coomassie brilliant blue g250 perchloric acid solution for staining in electrophoresis and isoelectric focusing on polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 64, 509-516 (1975).
  22. Cedeno-Laurent, F., et al. Metabolic inhibition of galectin-1-binding carbohydrates accentuates antitumor immunity. J. Invest. Dermatol. 132, 410-420 (2012).
  23. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
  24. Desjardins, P., Hansen, J. B., Allen, M. Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer. J. Vis. Exp. (33), (2009).
  25. Ernst, O., Zor, T. Linearization of the Bradford Protein Assay. J. Vis. Exp. (38), (2010).
  26. Simonian, M. H., Smith, J. A. Spectrophotometric and colorimetric determination of protein concentration. Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter. 10, 10-1002 (2006).
  27. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150, 76-85 (1985).
  28. Gravel, C., Li, C., Wang, J., Hashem, A. M., Jaentschke, B., Van Domselaar, G., et al. Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays. J. Vis. Exp. (50), (2011).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

利用蛋白A膜吸附剂和简化的操作流程分离与表征表达人源Fc嵌合蛋白
联系我们
向图书馆推荐

隐私

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。