与使用蛋白A琼脂糖珠填充柱的传统亲和层析相比，蛋白A膜吸附剂可显著加快实验室规模的抗体及其他表达Fc片段蛋白的分离纯化。 采用适当的分析与定量方法可进一步加速蛋白质处理过程，使分离与表征在一天工作时间内完成，而非20多个工作小时。
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摘要
摘要
从细胞培养上清液和裂解细胞溶液中纯化生物分子，可采用亲和层析法实现从实验室规模到工业规模的过渡。 尽管使用填充在层析柱中的多孔蛋白A琼脂糖微球进行亲和层析，是目前实验室规模分离抗体及表达IgG Fc片段的重组蛋白最常用的方法，但该过程可能耗时且成本较高。 对于必须从稀释溶液中回收数百微克至毫克级蛋白的小型基础科学实验室而言，时间和经费限制尤为严峻，这些实验室往往缺乏高压液体输送系统和/或具备生物分离经验的技术人员。此外，产物的定量与表征过程也可能显著延长处理时间，持续数个工作日，并增加耗材、人力等成本（etc.）。 因此，亟需一种快速、低成本且高效的实验方案，用于实验室规模下含Fc片段的抗体及其他蛋白的分离与表征。 为此，我们设计了一种操作流程，由经验有限的技术人员操作可在9小时以内（约一个工作日）完成，最快仅需4小时，相较传统方法所需的20小时以上工作时间大幅缩短。所需大多数设备在标准的生物医学、生物化学及（生物）化学工程实验室中均可 readily 获得，所有试剂均可商业化采购。 为展示该方案的应用，本文提供了代表性实验结果：利用蛋白A膜吸附器从细胞培养上清液中分离获得嵌合型 鼠源半乳糖凝集素-1与人Fc融合蛋白（Gal-1hFc）。纯化后的Gal-1hFc采用快速Western印迹分析法进行定量，并通过流式细胞术进行表征。该优化流程可适用于其他表达Fc片段的蛋白（如抗体）的纯化，亦可根据需要调整以整合不同的定量与表征方法。
引言
利用蛋白A亲和层析法，可以从细胞培养上清液和稀释的裂解细胞溶液中分离表达免疫球蛋白G（IgG）Fc片段的抗体和重组蛋白。在基础科学、工程实验室以及工业领域，尽管存在成本高昂和处理时间长的问题1-3，最常用的方法仍是使用填充有孔隙性蛋白A包被的琼脂糖、玻璃或聚合微珠的层析柱进行亲和层析。众所周知，亲和层析在实验室和工业生产中均是成本最高且处理速度最慢的环节2,4。因此，已开发出多种改进方法，旨在降低费用和缩短处理时间，同时不降低整个工艺流程中的产物回收率1,2,5-7。其中，使用蛋白A膜吸附器进行亲和层析在分离抗体及其他表达Fc片段的蛋白方面展现出尤为良好的前景2,5,7-10。与柱层析中Fc片段的捕获受限于扩散（即 表达Fc的蛋白必须扩散进入并穿过内部孔隙才能到达大部分蛋白A结合位点）且柱压降较高不同，膜吸附器中的传质由整体对流驱动，从而避免了扩散限制8,9,11,12。此外，膜吸附器的压降较低，因此相比填充微珠的层析柱可实现更快的灌注流速8,9,11,12。因此，在实验室规模的分离过程中，膜层析预计可比柱层析节省数小时时间，并提高产物捕获效率。此外，已有研究提出了针对膜吸附器中IgG吸附的数学模型8,9,11,12，使终端用户能够在实验前预测其性能表现。
基础科学与工程实验室中的另一个瓶颈是Fc....
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方案
1. 验证与蛋白A的亲和力
- 验证表达 Fc 的蛋白质（重组融合蛋白或 IgG 抗体，下文简称“蛋白质”）对蛋白 A 具有可接受的亲和力14-17 在使用蛋白A膜吸附剂之前，检测储备溶液中该蛋白的存在情况（例如 经1,000 × g离心5分钟以沉淀悬浮细胞，澄清细胞培养上清。采用流式细胞术、蛋白质印迹、ELISA 等等. 根据实验室偏好，检测蛋白功能和/或Fc的存在。理想情况下，对细胞培养上清液中的蛋白进行定量（第6步），以避免超出蛋白A膜吸附剂的载量。若检测到蛋白，则继续进行后续操作。
2. 准备蛋白A膜吸附剂和细胞培养上清液
- 按照制造商说明准备膜吸附剂。切勿让空气进入膜吸附剂。所有流经膜吸附剂的溶液均应处于室温，并使用 0.22 µm 滤器预先过滤。用 10 ml 注射器吸取经 0.22 µm 滤器过滤的杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）或所选缓冲液，并排出气泡。在使用前立即用 DPBS 灌流，以去除保存液并平衡膜吸附剂。
- 在将细胞培养上清液灌流通过膜吸附剂之前，立即使用真空驱动的 0.22 µm 无菌过滤装置进行过滤。
3. 上样蛋白A膜吸附剂
- 用鲁尔锁扣注射器（30 ml 或更大）吸取细胞培养上清液，并排出所有气....
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结果
用于分离和表征表达Fc蛋白的简化方案通常用于从稀释的细胞培养上清液中纯化人Fc融合小鼠嵌合型半乳糖凝集素-1（Gal-1hFc）。图2中的流程图展示了该方案中各步骤的工作流程及所需时间。对于典型的300 ml上清液批次，若进行可选的洗脱组分流式细胞术检测，总处理时间约为9小时。若因缺乏流式细胞仪或根据实验室个体偏好省略所有流式细胞术分析，则总处理时间可缩短至4小时。通常情况下，处理时间取决于操作人员的经验、所处理上清液的体积以及所采用的定量和表征方法。
流式细胞术用于检测功能性 Gal-1hFc 的存在（即 Gal-1 能够在起始细胞培养上清液中检测到其在乳腺癌细胞上的配体；新鲜细胞培养基作为阴性对照18,22 . 一旦验证了细胞培养上清液中的Gal-1hFc（图3A），使用注射泵以10 ml/min的流速对蛋白A膜吸附剂进行上样（在2 ml膜吸附剂中产生0.5 cm/min的表观流速或体积通量）图1). 膜吸附剂高效捕获并保留了Gal-1h.......
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讨论
本文所述方案旨在快速分离和表征表达人源Fc的嵌合融合蛋白（Gal-1hFc），同时不显著降低产物回收率或增加成本。 该简化工作流程的关键组分包括：用于分离的蛋白A膜吸附器，以及用于Western blot检测的半干转印和真空辅助免疫印迹法。
从300 ml细胞培养上清液中分离和表征Gal-1hFc的处理时间显著缩短（优化后的方案约需9小时，而传统方案需20小时以上），这主要归因于前述关键组分的引入，尤其是膜吸附器的应用。在推荐的最大流速（10 ml上清液/min）下，膜吸附器的上样可在30分钟内完成。 在我们的实验室中，从蛋白A膜吸附剂中回收Gal-1hFc的得率通常为10-30%，当细胞培养上清液中Gal-1hFc浓度为5-10 mg/ml时，经验丰富的实验人员通常可实现约30%的回收率。 最多仅实现了约50%的回收率。 由于以下原因，完全回收产品几乎是不可能的：(a) 膜吸附剂上的蛋白A对表达Fc的蛋白具有特异性保留作用图3B 和 3C）以及（b）蛋白质在分离过程中非特异.......
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致谢
作者谨此感谢 Luis F. Delgadillo 先生（俄亥俄大学化学与生物分子工程系）、Matthew H. Williams 先生（俄亥俄大学化学与生物分子工程系）以及 Filiberto Cedeno-Laurent 博士（布莱根妇女医院与哈佛医学院）提供的专业技术支持。 作者同时感谢俄亥俄大学化学与生物分子工程系及生物医学工程项目 2011 年冬季学期 CHE 404/BME 504 课程和 2012 年秋季学期 CHE 4830/BME 5830 课程的学生们所提供的技术建议与讨论。本研究得到了以下资助：美国国家科学基金会（NSF）重大研究仪器项目 CBET-1039869（MMB）、NSF CBET-1106118（MMB）、皮肤病学基金会研究资助 A050422（SRB）、美国国立卫生研究院（NIH）国家癌症研究所资助 1R15CA161830-01（MMB）、NIH Kirschstein-NRSA 博士后奖学金 F32CA144219-01A1（SRB）、NIH/NCI R01CA173610（CJD）， 以及 NIH NCCAM 资助 R01AT004628（CJD）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Protein A 膜吸附器（Sartobind Protein A 2 ml） | Sartorius-Stedim | 93PRAP06HB-12--A | |
| Amicon Ultra 离心滤器，10 kDa，4 ml | Millipore | UFC801008 | 如需要可使用 15 ml 体积 |
| 无菌真空滤器单元，0.22 µm，500 ml | Millipore | SCGPU05RE | |
| 10 ml 带鲁尔锁扣针头的注射器 | BD | 301604 | |
| 30 ml 带鲁尔锁扣针头的注射器 | BD | 309650 | |
| Tygon 实验室管路（1/16 英寸 × 1/8 英寸 × 50 英尺） | Cole Parmer | WU-95903-16 | |
| Slide-A-Lyzer MINI 透析装置（10K MWCO） | Thermo Scientific | 69576 | |
| Snap i.d. 抗体收集托盘 | EMD Millipore | WBAVDABTR | |
| Snap i.d. 单孔印迹支架 | EMD Millipore | WBAVDBH01 | |
| 洗脱缓冲液 | Thermo Scientific | 21004 | |
| Tris，超纯 | Fisher Scientific | 819623 | |
| 氯化钠 | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| DPBS | Thermo Scientific | SH30028.02 | |
| 含 Ca2+/Mg2+ 的 DPBS | Life Technologies | 14080-055 | |
| BSA | Sigma | A9647 | |
| 人源 Fc | Bethyl Research Laboratories | P80-104 | |
| 抗人 Fc-APC | Jackson Immunoresearch | 109136170 | |
| 抗人 Fc-AP | Bio-Rad | 170-5018 | |
| 碱性磷酸酶底物 | Promega | S3841 | |
| 流式细胞术管（5 ml 聚苯乙烯或聚丙烯） | BD | 352054 | |
| 注射泵 | Harvard Apparatus | 55-2226 | 蠕动泵也可接受 |
| 蛋白质凝胶电泳系统 | Bio-Rad Laboratories | 552BR094876 | 任何凝胶电泳系统均可使用，但小型凝胶系统运行最快 |
| 半干转印仪 | Bio-Rad Laboratories | 690BR006163 | 任何转印系统均可接受，但非连续性转印系统进行电泳转印速度最快 |
| SNAP i.d. 真空辅助蛋白质检测系统 | EMD Millipore | WBAVDBASE | 已有升级型号替代该特定仪器，但两者性能相当 |
参考文献
- Gagnon, P. Technology trends in antibody purification. J. Chromatogr. A. 1221, 57-70 (2012).
- Gottschalk, U. Bioseparation in antibody manufacturing: The good, the bad and the ugly. Biotechnol. Prog. 24, 496-503 (2008).
- Liu, H. F., Ma, J., Winter, C., Ba....
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重印与许可
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