采用切开式凡士林间隙法可对表达于Xenopus卵母细胞中的电压门控离子通道进行离子电流和门控电流的低噪声记录，从而高分辨率地研究通道的快速动力学特性。经过少量修改后，电压钳位荧光法可与切开式卵母细胞记录方案相结合。
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摘要
摘要
切开式卵母细胞石蜡封隔（COVG）电压钳技术可用于分析异源表达离子通道的电生理学和动力学特性。利用切开式装置进行记录特别有助于解析微弱的门控电流、快速的离子电流激活与去激活过程。与双电极电压钳（TEVC）技术相比，其主要优势包括更快的钳制速度、更高的信噪比，以及能够调控细胞内和细胞外环境。
在此，我们采用在非洲爪蟾卵母细胞（Xenopus oocytes）中表达的人心脏钠离子通道（hNaV1.5），演示切开口式记录装置及其操作流程，并介绍为实现电压钳位荧光测量功能所需进行的改进。
使用双电极电压钳（TEVC）技术在接近室温条件下难以完全解析快速激活的离子通道（如hNaV1.5）的特性，因为该方法会对卵母细胞的整个膜进行钳制，导致电压控制困难。然而，在切开式电压钳技术中，仅隔离细胞膜的一小部分即可实现快速钳制，从而精确记录快速动力学过程，同时避免了膜片钳技术中常见的通道功能衰减问题。
结合COVG技术，还可通过电压钳位荧光法进一步检测离子通道的动力学特性及电生理学性质。该方法通过将荧光染料经细胞外施加并与半胱氨酸共价结合、插入基因编码的荧光蛋白，或在目标区域引入非天然氨基酸来追踪蛋白质的运动1。这些额外的数据可通过荧光分子周围微环境的变化，提供有关蛋白质电压依赖性构象重排的动力学信息。
引言
特化的电压钳制技术能够在受控的膜电位下记录离子电流。广泛应用的双电极电压钳（TEVC）和膜片钳技术可提供有关多种离子通道特性的可靠电生理学信息。然而，这两种方法均存在局限性，导致难以获取在非洲爪蟾（Xenopus）卵母细胞等膜系统中快速激活的电压门控钠通道及其他快速激活通道的可靠数据。因此，Bezanilla 和 Stefani 实验室开发了卵母细胞的切口式凡士林间隙电压钳技术（COVG）2。该技术已被广泛应用于记录 Na+、K+ 和 Ca2+ 通道3-8。
在进行COVG记录时，表达异源蛋白的卵母细胞膜被分为三个区域。离子电流数据从卵母细胞的顶部区域记录，该区域周围的浴液被钳制在指令电位，且该电位可轻松快速地改变。中间区域通过与顶部区域保持相同的钳制电位，防止漏电流的干扰9。底部区域则通过皂苷溶液或套管实现卵母细胞的开放（切开）。在底部区域对膜进行化学或手动打开，可控制细胞内电位（该电位被钳制在接地电位），并使细胞内部与下室溶液连通。向下方腔室灌注溶液可调节细胞内环境的性质，而更换上方腔室的溶液则可改变细胞外环境。
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方案
1. 初始设备设置
- 将显微操作仪和微电极操纵器放置在隔振系统上（例如 配备周围法拉第笼的气浮台，以防止电和机械噪声。
- 将六个 Ag/AgCl 小球焊接到六英寸长的 24 AWG 导线上。其中一根导线（将连接至 P1）需拼接第二根导线，形成“Y”形。在每根导线的末端焊上放大器附带的镀金 BNC 插针。
- 将焊接在24 AWG导线上的五个Ag/AgCl颗粒连接至浴槽/保护电极头级（Bath/Guard headstage）的P1、P2、CC、GS1和GS2接口。将标记为“I”的Ag/AgCl颗粒连接至“I”头级，并将从P1引出的第二根导线连接至V2头级。
- 根据设备说明书中的指示，将放大器连接到数据采集单元。
- 放置并用环氧树脂固定温度控制器的热敏电阻。将模块热敏电阻穿过金属支架上的一个孔，该孔位于加热/冷却元件正上方的中心位置。在导温底室本体上钻出的一个孔中放置浴槽热敏电阻，位置应非常靠近但不接触溶液，并用环氧树脂固定。
2. 卵母细胞及初步准备
- 记录异源表达的通道（如 hNa）V1.5，合成mRNA（源自hSCN5a）并将其注入 非洲爪蟾 卵母细胞在执行方案4前约4-5天进行操作。对于hSCN5a，于4-5天孵育后可获得峰值表达 19 °C参考 Richards 和 Dempski
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结果
图4展示了向卵母细胞底部施加皂苷溶液后，卵母细胞通透性的变化。图5展示了皂苷透化后，细胞内溶液通过扩散进行交换的速率。达到稳态需要20-40分钟2,18。
图6A展示了由记录程序生成的电流轨迹。该图显示了经过P/-8漏电流减除后的离子电流对电压程序（插图）的响应。图中每条轨迹代表不同的施加电压。动力学最慢的轨迹代表钠通道能够开放的最低电位。通常情况下，使用传统方法难以在这些较低电位下维持电压控制，因为内向电流会使膜去极化。这种去极化反过来会激活更多通道，形成正反馈环路。而切开式技术改进的钳制速度使得即使在这些困难的电位下也能实现记录通道所需的电压控制。
图6B 显示了由 图6A 中的记录生成的电流/电压曲线。若未采用上述电压控制，最早电位（约 -60 mV）下的峰值电流将被高估，从而导致无法准确描述电流-电压关系。
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讨论
切开式卵母细胞石蜡封隔电压钳技术能够实现数据的快速解析、低噪声、对胞内液和胞外液成分的更好控制，并在相对较长的实验方案中保持稳定的记录19。这些优势使该技术区别于标准的双电极电压钳和膜片钳技术。尽管该技术需要专用设备且操作流程相对复杂，但一旦系统经过优化，极少出现问题。这使得钠离子通道（hNaV1.5）及其他快速激活通道的可重复记录成为可能。
该实验方案中最关键的步骤是将上室放置于卵母细胞上以及使用 V1 电极进行穿刺。细胞与上室孔边缘之间密封的紧密程度对记录质量有重大影响。必须将上室向下压紧细胞，以获得尽可能高的电阻，同时不损伤卵母细胞。此过程将导致卵母细胞隆起并变平，但需要根据经验并结合细胞质量来判断最佳压力，以防止细胞破裂。快速记录要求使用尽可能大的移液管开口，但必须确保在不损伤细胞的前提下能够稳定使用。应特别注意移液管的锥度，其倾斜程度应足够平缓，以避免在插入移液管尖端时显著扩大创口。穿刺操作应缓慢轻柔，一旦出现膜电位读数，应立即停止推进电极。
卵母细胞膜的损伤以及卵母细胞与.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
圣路易斯华盛顿大学心脏分子工程实验室全体成员。科学界面伯勒斯威康基金职业奖 - 1010299（授予 J.S.）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 外部溶液 | 品牌 | 货号 | [终浓度]、重量或体积 |
| N-甲基-D-葡萄糖胺（NMDG） | Sigma-Aldrich | M2004 | 25mM |
| MES 钠盐 | Sigma-Aldrich | M5057 | 90mM |
| HEPES | Research Products International | H75030 | 20mM |
| 氢氧化钙 | Sigma-Aldrich | 239232 | 2mM |
| MES 水合物 | Sigma-Aldrich | M8250 | 可变（调至 pH 7.4） |
| 内部溶液 | |||
| N-甲基-D-葡萄糖胺（NMDG） | Sigma-Aldrich | M2004 | 105mM |
| MES 钠盐 | Sigma-Aldrich | M5057 | 10mM |
| HEPES | Research Products International | H75030 | 20mM |
| 乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸（EGTA） | Sigma-Aldrich | E4378 | 2mM |
| MES 水合物 | Sigma-Aldrich | M8250 | 可变（调至 pH 7.4） |
| 去极化溶液 | |||
| KCl | Sigma-Aldrich | 221473 | 110mM |
| 氯化镁 | Sigma-Aldrich | M8266 | 1.5mM |
| 氯化钙 | Caisson | C021 | 0.8mM |
| HEPES | Research Products International | H75030 | 10mM |
| 移液管溶液 | |||
| KCl | Sigma-Aldrich | 221473 | 3M |
| 皂苷溶液 | |||
| 皂苷 | Sigma-Aldrich | 47036 | 0.125g |
| 内部溶液 | 见上文 | 50mL | |
| 琼脂桥溶液 | |||
| N-甲基-D-葡萄糖胺（NMDG） | Sigma-Aldrich | M2004 | 100ml 的 1M 溶液 |
| HEPES | Research Products International | H75030 | 1.2g |
| MES 水合物 | Sigma-Aldrich | M8250 | 可变（调至 pH 7.4） |
| 颗粒状琼脂 | Research Products International | A20250 | 3% |
| NMDG 储存溶液 | |||
| NMDG、HEPES、MES 水合物溶液 | 见上文 | 40ml | |
| 水 | 60ml | ||
| 材料/设备名称 | 公司 | 货号 | 备注/描述 |
| 高性能卵母细胞钳 | Dagan | CA-1B | |
| 数据采集系统 | Axon CNS | Digidata 1440A | |
| 示波器 | Tektronix | TDS 210 | |
| 机架式电源滤波器 | APC | G5 | |
| 加热/冷却浴温控器 | Dagan | HCC-100A | |
| PC | Dell | Optiplex 990 | |
| pCLAMP 10.3 电压钳软件 | Molecular Devices, LLC | pCLAMP10.3 | |
| TMC 振动控制台面平台 | TMC | 64 SERIES | |
| TMC 振动控制气浮台 | TMC | 20 Series | |
| V1/I 电极数据采集器 | Dagan | CA-1B 的组成部分 | |
| MX10L 微操纵器 | Siskiyou | MX10L | |
| 浴槽/屏蔽（I/V）前置放大器（含适当连接器） | Dagan | CA-1B 的组成部分 | |
| 显微镜 | Omano | OM2300S-JW11 | |
| 温控浴槽 | 定制或 Dagan | 定制或 HE-204C | 使用 Cool Polymers（D系列）材料自制的定制腔室。Dagan 也提供预制平台（HE-204C）。 |
| 定制 AgCl 颗粒容器 | 定制 | 定制 | 定制加工 |
| Ag/AgCl 电极颗粒，2.0 mm | Warner | E-206 | |
| 外部卵母细胞浴槽 | 定制或 Dagan | 定制或 CC-1-T-LB | 定制加工或从 Dagan 购买 |
| 内部卵母细胞浴槽 | 定制或 Dagan | 定制或 CC-TG-ND | 定制加工或从 Dagan 购买 |
| 用于琼脂桥和拉制电极的毛细管 | Warner | G150T-4 | |
| 显微镜、微操纵器和浴槽的可旋转支架 | Siskiyou | SD-1280P | |
| Fiber-Lite | Dolan-Jenner | LMI-600 | |
| 普通漂白剂 | Clorox | 470174-764 | |
| 非洲爪蟾卵母细胞（Xenopus laevis Oocytes） | Nasco | LM535M（性成熟雌性） | |
| 90 Na+ 外部溶液 | 参见溶液表 | ||
| 10 Na+ 内部溶液 | 参见溶液表 | ||
| 3 M KCl | 参见溶液表 | ||
| 皂苷 | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| NMDG 储存溶液 | 参见溶液表 | ||
| 5mL 移液管 | SciMart | GS-52 | |
| 改良 KCl 电极注射器 | BD | 309659 | 塑料注射器头端熔化以允许向电极内注入溶液。也可购买 WPI 的 Microfil。 |
| 微型真空装置 | 定制 | 定制 | |
| 镊子 | VWR | 63040-458 | |
| 卵母细胞操作工具（移液泵） | VWR | 53502-222 | |
| 去离子水冲洗瓶 | VWR | 16649-911 | |
| 凡士林软膏 | Fisher Scientific | 19-086-291 | |
| 进行 VCF 记录所需的额外材料： | |||
| VCF 显微镜 | Nikon | Eclipse FN1 | |
| Nikon CFI APO 40XW NIR 物镜 | Nikon | N40X-NIR | |
| 用于固定式直立显微镜的 X-Y 平移系统 | Sutter Instruments | MT500-586 | |
| 外部 VCF 卵母细胞浴槽 | 定制 | 定制加工。腔室尺寸为 2.7 × 1.9 × 0.4 cm。 | |
| 内部 VCF 卵母细胞浴槽 | 定制 | 定制加工。腔室尺寸为 1.6 × 1.6 × 0.4 cm。 | |
| 改良型温控浴槽 | 定制 | 使用 Cool Polymers（D系列）材料制成的定制腔室。改良温控器浴槽的水平腔室尺寸为 2.7 × 1.9 × 0.3 cm，垂直腔室尺寸为 1 × 2.5 × 0.5 cm。 |
参考文献
- Kalstrup, T., Blunck, R. Dynamics of internal pore opening in KV channels probed by a fluorescent unnatural amino acid. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 8272-8277 (2013).
- Stefani, E., Bezanilla, F. Cut-open oocyte voltage-clamp technique. Methods Enzymol
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