Listeria monocytogenes 是一种革兰氏阳性细菌病原体，常被用作研究胞内寄生现象的主要模型。在小干扰RNA筛选背景下对晚期 L. monocytogenes 感染阶段进行成像，可实现对细菌感染靶向宿主细胞所必需的细胞通路进行全局性研究。
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摘要
摘要
细菌胞内病原体可被视为用于解析细胞信号级联的分子工具，因其具有精细操控和颠覆宿主靶组织感染所必需的细胞功能的能力。在这些细菌病原体中，Listeria monocytogenes 是一种革兰氏阳性微生物，已被用作研究胞内寄生的典范，用于表征细胞免疫反应，并在发现调控细胞骨架和膜运输动态的分子通路过程中发挥了关键作用。本文中，我们描述了一种可靠的显微检测方法，用于检测 L. monocytogenes 感染的晚期阶段，该方法基于对分泌型细菌蛋白 InlC 的荧光标记，该蛋白在感染细胞的细胞质中积累；该检测方法可与自动化的高通量小干扰RNA筛选相结合，以鉴定参与感染上调或下调的细胞信号通路。
引言
革兰氏阳性菌Listeria monocytogenes是一种食源性病原体，可侵入宿主细胞，破坏其内化形成的液泡，并在宿主细胞的细胞质中进行复制1。L. monocytogenes在实验室环境中易于操作（生长迅速，对健康个体毒性较低），同时在细胞和动物模型中可稳定保持细菌的毒力特征（如溶血活性、白细胞增多），因此自20世纪60年代起被首次用作研究胞内寄生现象以及建立抗感染细胞免疫理论基础的重要模型2。在20世纪80年代末至90年代初，对细菌胞内生命周期的深入解析3以及对主要细菌毒力因子的分子特征鉴定4-7，进一步推动了L. monocytogenes作为关键分子工具在宿主细胞功能调控与研究中的广泛应用。在Listeria属中存在非致病性（L. innocua）与致病性（L. monocytogenes）物种，这为开展比较基因组学研究8提供了条件；结合近年来L. monocytogenes全转录组的完整解析9，显著加深了我们对L. monocytogenes作为人类病原体的进化过程及其作为感染研究模型系统的理解10。
L. monocytogenes 通过细菌表面蛋白....
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方案
1. 细胞与细菌培养物、转染工具及一抗的制备
- 准备新鲜的琼脂平板，用于从保存在 -80 °C 的细菌甘油 stock（50% 甘油 / 50% 饱和细菌液体过夜培养物）中分离单个 L. monocytogenes 菌落。
- 使用预先置于 -80 °C 的铝制架子运输冷冻的细菌甘油 stock，并将细菌划线接种于脑心浸液（BHI）琼脂平板上。
- 将平板在 37 °C 培养 48 小时（或直至可分离出单个细菌菌落）。
- 此后将该工作平板保存在 4 °C，最长不超过 1 个月（用于接种液体培养物）。
- 在本实验方案中，我们使用的是 L. monocytogenes 血清型 1/2a EGDe.PrfA* 菌株，但如图 1所示，L. monocytogenes 血清型 4b P14.PrfA* 菌株也可获得类似结果。
- HeLa ATCC CCL2 细胞在添加 10% 胎牛血清（FBS）的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中培养，不使用抗生素。
- 将独立的乱序（对照）和抗 Met siRNA 储液加入黑色 384 孔显微镜细胞培养板中。
- 将 160 pmol siRNA 溶于 500 μl 无 RNase 水中，每孔加入 5 μl 该溶液（终浓度：1.6 pm....
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结果
细胞质内 InlC 的荧光标记为单核细胞增生李斯特菌（L. monocytogenes）感染细胞提供了可靠的检测指标，如图1所示：显微照片中的中央细胞被 P14.PrfA*23 菌株高度感染，这一现象可在相差图像中观察到（箭头所示，图1A），并通过 DAPI 信号得到证实，在 DAPI 图像中可清晰分辨单个细菌（图1B）。InlC 染色（与图1C中的 DAPI 染色叠加）显示，该分泌蛋白在感染细胞的细胞质中大量积累，从而能够明确识别感染宿主细胞的形态。使用荧光鬼笔环肽对肌动蛋白细胞骨架进行染色（图1D），可提供整个接种细胞单层的形态学信息，并进一步说明邻近未感染细胞（细胞核以星号标记）不显示任何 InlC 标记。值得注意的是，由于细胞质中 InlC 的水平依赖于细胞内细菌的数量，我们观察到免疫荧光检测到的 InlC 信号与每个细胞内的L. monocytogenes数量之间存在相关性：如图1所示，感染细菌数量较少.......
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讨论
我们的InlC检测方案成功的关键在于多个参数，包括使用状态良好的细胞系，其细胞质需足够大，以便明确检测到InlC信号。本文所介绍的实验方案推荐使用HeLa CCL2细胞，因其胞质空间较大，特别适用于本实验；其他HeLa克隆，如HeLa Kyoto细胞，虽然细胞质较小，但仍可配合我们的感染方案使用（HeLa Kyoto细胞特别适用于分割分析，因为其细胞之间通常不与邻近细胞重叠，而HeLa CCL2细胞则常出现重叠现象）。细胞质非常小的细胞，如多形核细胞或巨噬细胞，不建议与本方案联合使用。
本研究所展示的成像实验方案存在一个局限性，即在对照条件下，单层细胞中应仅有极少量细胞被感染，以确保系统具备足够的分辨能力：否则，若感染细胞数量过少，则难以检测感染率的变化，尤其是在研究预期可降低感染水平的潜在分子功能时。这一局限性在使用HeLa细胞时尤为突出，因为HeLa细胞仅表达Met作为单核细胞增生李斯特菌（L. monocytogenes）蛋白InlB的表面受体，因此大多数L. monocytogenes菌株对其侵袭效率较低。一种替代方案是使用极高的感染复数.......
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披露
我们没有需要披露的内容。
致谢
P. Cossart 实验室的研究工作得到了巴斯德研究所、法国国家健康与医学研究院、法国国家农业研究院、欧洲研究理事会高级资助（233348）、法国国家研究局（资助号 MIE-SignRupVac）、Louis-Jeantet 基金会以及 Le Roch Les Mousquetaires 基金会的支持。A.K. 获得了巴斯德-巴黎大学国际博士项目/传染病 Carnot 研究所研究生奖学金的资助。我们还承蒙瑞士系统生物学研究计划 SystemsX.ch 框架内的研究与技术开发（RTD）项目 InfectX 获得资助 51RT 0_126008 的支持（资助对象：C.D.）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 脑心浸液培养基（Bacto Brain Heart Infusion） | BD | 237500 | 用于液体BHI培养基的配制 |
| 琼脂粉（Bacto Agar） | BD | 214010 | 添加至液体BHI中以制备BHI琼脂平板 |
| 热灭活胎牛血清（Heat-Inactivated Fetal Bovine Serum） | Biowest | 51830-500 | |
| DMEM培养基 | Invitrogen | 61965-026 | |
| Lipofectamine RNAiMax转染试剂 | Invitrogen | 13778-100 | |
| 庆大霉素（Gentamicin） | Sigma | G1397-10ML | |
| 甲醛（16%） | EMS | 15710 | 每次实验前新鲜配制 |
| 抗兔Alexa Fluor 546荧光二抗 | Invitrogen | A-11035 | |
| DAPI染色剂 | Invitrogen | D-1306 | |
| 鬼笔环肽-Dy647（Phalloidin Dy647） | Dyomics | 647-33 | |
| 阴性对照siRNA（siRNA Scramble） | Dharmacon | D-001810-10 | |
| Met基因特异性siRNA（siRNA Met） | Dharmacon | L-003156-00-0005 | |
| 黑色384孔显微细胞培养板 | Corning | 3985 | |
| AxioObserver Z1显微镜 | Zeiss | 431007 9901 | |
| sCMOS相机 | Andor | Neo | |
| Metamorph图像分析软件 | Molecular Devices | 4000 | |
| CellProfiler图像分析软件 | Broad Institute | 公共软件，可从 http://www.cellprofiler.org/ 获取 |
参考文献
- Pizarro-Cerdá, J., Kühbacher, A., Cossart, P. Entry of Listeria monocytogenes in mammalian epithelial cells: an updated view. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2, 1-17 (2012).
- Mackaness, G. B. Cellular resistance to infection. Journal ....
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重印与许可
勘误
Formal Correction: Erratum: Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes
Posted by JoVE Editors on 6/25/2014. Citeable Link.
A correction was made to Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes. Three authors were omitted from the article at the time of publication. The acknowledgments section was also updated. The author list has been updated from:
Andreas Kühbacher1,2,3, Edith Gouin1,2,3, Pascale Cossart1,2,3, Javier Pizarro-Cerdá1,2,3
1Unité des Interactions Bactéries Cellules, Pasteur Institute, 2INSERM U604, 3Institut National de la Recherche Agronomique (INRA), USC2020
to
Andreas Kühbacher1,2,3, Edith Gouin1,2,3, Jason Mercer4, Mario Emmenlauer5, Christoph Dehio5, Pascale Cossart1,2,3, Javier Pizarro-Cerdá1,2,3
1Unité des Interactions Bactéries Cellules, Pasteur Institute,2INSERM U604, 3Institut National de la Recherche Agronomique (INRA), USC2020, 4Institute of Biochemistry, ETH Zürich 5Focal Area Infection Biology, Biozentrum, University of Basel
The acknowledgments where update from:
Research in P. Cossart laboratory is supported by the Pasteur Institute, the Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, the Institut National de la Recherche Agronomique, ERC Advanced Grant (233348), the Agence Nationale de la Recherche (Grant MIE-SignRupVac), the Louis-Jeantet Foundation and the Fondation Le Roch Les Mousquetaires. A.K. is a recipient of a scholarship from the Pasteur-Paris University International Doctoral Program/Institut Carnot Maladies Infectieuses. We thank Jason Mercer for optimizing the cellular transfection protocol.
to
Research in P. Cossart laboratory is supported by the Pasteur Institute, the Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, the Institut National de la Recherche Agronomique, ERC Advanced Grant (233348), the Agence Nationale de la Recherche (Grant MIE-SignRupVac), the Louis-Jeantet Foundation and the Fondation Le Roch Les Mousquetaires. A.K. is a recipient of a scholarship from the Pasteur-Paris University International Doctoral Program/Institut Carnot Maladies Infectieuses. We acknowledge support by grant 51RT 0_126008 for the Research and Technology Development (RTD) project InfectX in the frame of SystemsX.ch, the Swiss Initiative for Systems Biology (to C.D.).
