为了构建高度有序的复杂组织结构，必须将多种材料和细胞类型组装成一个整体复合物。这种组合设计结合了器官特异性的分层细胞片，以及两种不同的生物来源材料，后者包含强韧的纤维基质基础和内皮细胞，以促进新生血管的形成。
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本文内容
摘要
摘要
许多组织（例如成人心脏）在受损后无法有效再生2,3。组织工程策略提出了多种创新方法，以协助机体实现修复与恢复。例如，组织工程技术可能有助于减轻心肌梗死（MI）后的心脏重构，并有望将整体心脏功能提升至接近MI前的正常水平4。与任何功能性组织一样，心脏组织的成功再生需要将多种细胞类型在适宜的微环境信号引导下递送至损伤部位，以促进移植细胞/组织移植物的整合与存活。工程化组织应综合考虑多个参数，包括可溶性信号分子、细胞间相互作用，以及作为递送载体的基质材料，评估这些材料对细胞存活、材料强度以及促进细胞向组织有序组装的影响。目前一些仅采用直接注射细胞移植物的研究忽略了这些关键要素2,5,6。能够整合上述所有要素的组织设计方案尚未建立。本文展示了一种集成化设计示例，即通过将具有特定图案的细胞片层与两种不同类型的生物来源材料进行层叠组装，其中材料含有目标器官的细胞类型及内皮细胞，以促进“组织”内新生血管的形成。尽管本研究聚焦于类心脏组织的构建，但该组织设计只需进行极少的结构和材料调整，即可应用于除心脏外的多种器官，并旨在成为一种即用型再生治疗产品。本实验方案包含五个详细步骤：首先，使用温度敏感性聚（N-异丙基丙烯酰胺）（pNIPAAM）包被组织培养皿；其次，在包被后的培养板/微图案化表面培养组织特异性细胞，使其形成具有强侧向黏附性的细胞片层；第三步，通过将多孔基质与允许新生血管形成的水凝胶及内皮细胞结合，构建组织的基础基质层；最后，将细胞片层从pNIPAAM包被的培养皿上剥离，并转移至基础基质层上，从而完成整体结构的构建。
引言
单独注射细胞和/或单一材料在其他器官系统中已显示出不一的效果，在心脏再生中的效果则更为有限。5,7-12 目前，干细胞来源的细胞可通过多种递送方式输送至受损组织，包括：直接将细胞注射至组织内，或通过血液供应进行灌注。13-17 其他研究已尝试单独植入细胞、单独植入材料，或联合使用材料载体以促进受损器官的再生。18-21 该设计结合了多种策略，可提供材料强度、多种材料的图案化结构以及支持多种细胞类型共存的环境。
具体而言，脱细胞纤维基质为构建物提供了基础的物理强度，使其在必要时可适用于缝合植入患者体内。基质中的孔隙空间填充了内皮细胞，并置于一种允许新生血管形成的水凝胶中22，以快速建立植入物的血管化。随后，该复合结构与预先图案化的细胞片层整合，以增强细胞间通讯，并更接近模拟天然组织1,23-25。分层细胞补片的整体制备流程如图1中的流程图所示。
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方案
1. 聚N-异丙基丙烯酰胺（pNIPAAM）包被板的制备
- 将2.6 g pNIPAAM溶解于2 ml的60%甲苯/40%正己烷溶液中。
- 将混合物加热至60 °C，搅拌10分钟，直至pNIPAAM完全溶解。
- 将滤纸剪成直径为60 mm的圆形，并放入布氏漏斗中。
- 将溶液通过布氏漏斗过滤至已预先称重的玻璃烧杯中（切勿使用塑料器皿，因为正己烷会溶解塑料）。
- 将烧杯及其内容物置于钟罩式真空干燥器（24 psi）中过夜 （16小时）。注意：在残留物与异丙醇反应之前，其易被氧化，因此务必避免接触氧气。
- 称量烧杯重量，以确定pNIPAAM的重量。
- 向pNIPAAM中加入异丙醇，配制成50/50 w/w的溶液。
- 取2 ml该溶液滴加于组织培养板表面，并在紫外光下照射涂层5分钟。
- 使用前用2 ml温热的PBS洗涤培养板两次。
2. 细胞片的制备
注意：可通过多种不同方法制备目标器官原代细胞的细胞片，或如本文所述，通过在组织培养表面包被温敏性聚合物来制备。多家供应商也提供预先包被的温敏性培养板。
注意：本方案适用于使用35 mm培养皿进行培养。简言之，细胞首先在37 °C下孵育至少24小....
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结果
流程图（图1）展示了制备多层补片的整体方法。当温度降至32 °C以下时，细胞片会从经pNIPAAM处理的培养板上脱落。随后将细胞片置于交联水凝胶上层，该水凝胶下方的纤维基质中已接种内皮细胞（图1）。经预处理的温敏性培养板也可用于制备细胞片。特殊的拓扑结构表面可用于对细胞进行特定的图案化（即，定向排列）30。
基础纤维基质可通过脱细胞化天然组织基质或静电纺丝方法制备。此处，将纤维材料裁剪成直径为4 mm的片状，作为补片基底（图2A）。对该材料的表征对于确定可用于填充孔隙空间的水凝胶用量至关重要。本实验所用基质此前已被表征并发表22。
将HA水凝胶液态组分施加到纤维基质后，含有内皮细胞的水凝胶发生交联。荧光/透射显微镜显示，被包裹在交联水凝胶中的活细胞经Calcein AM染色后可见（图2B）。
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讨论
该实验方案的关键步骤包括：用温敏性聚合物包被培养板表面，以及在降低培养板温度后对细胞片进行操作。由于不同细胞具有不同的物理特性（如黏附性），因此每种细胞类型的剥离时间都应进行优化。本方案中第二个也是最具挑战性的环节是细胞片的操作，这是组织构建方法中的关键部分。细胞片中的单层细胞非常脆弱，若使用镊子操作，容易发生撕裂。此外，当细胞片未被固定时，容易收缩并发生折叠。本方案提出的利用支撑筛进行细胞片转移的方法，有助于对脆弱的细胞片进行操作。
本文所述的设计方法为创建适用于多种组织工程应用的细胞片提供了一种成本相对较低的途径。此外，在大学实验室中采用该方法制备聚异丙基丙烯酰胺（pNIPAAM）包被的培养板可实现标准化操作，且可根据不同细胞类型和表面条件对实验方案进行相应调整。使用细胞片而非无序的单细胞有助于组织构建，并可能提高移植组织的存活率与整合能力。然而，这些构建物的体内（in vivo）递送方法（本方案中未提及）需针对每种组织类型进行优化。未来的研究方向包括探索并优化特定器官系统的组织制备方法。
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披露
我们无任何披露事项。
致谢
本工作由加州再生医学研究所（CIRM；RN2-00921-1）的新教员奖 II、美国国立卫生研究院（NIH）资助的国家研究奖（F32-HL104924）以及 CIRM 培训基金（TG21163）资助。材料由 Glycosan Biosystems Inc / BioTime 和匹兹堡大学 Stephen Badylak 博士提供。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 试剂 | |||
| Calcein-AM | Invitrogen | C3099 | 细胞示踪剂 / 活细胞染料 |
| Lysotracker Red | Invitrogen | L7528 | 细胞示踪剂 |
| Neutral Red | Sigma | N7005 | 可见细胞染料 |
| pNIPAAM | Sigma Aldrich | 412780250 | 聚（N-异丙基丙烯酰胺） |
| 甲苯 | Sigma Aldrich | 244511-1L | |
| 己烷 | Sigma Aldrich | 296090-1L | |
| RAOSMC | Lonza | R-ASM-580 | 大鼠主动脉平滑肌细胞 |
| SmGM2 | Lonza | CC-4149 | 平滑肌细胞培养基 |
| HUVEC | Invitrogen | C-003-5C | 人脐静脉内皮细胞 |
| HyStem | Glycosan/Biotime | ||
| 异丙醇 | VWR International | BDH1133-4LP | |
| 胰蛋白酶 | Corning Cellgro | 25-053-C1 | |
| PBS | Gibco | 14287-072 | |
| FBS | Gibco | 16140-071 | |
| 专用设备 | |||
| 滤纸 | Ahlstrom | 6310-0900 | |
| 布氏漏斗 | Sigma Aldrich | Z247308 | |
| UpCell 培养板 | Nunc | 2014-11 | |
| 紫外灯 | Jelight Company | UVO Cleaner Model No.42 |
参考文献
- Ohashi, K., Okano, T. Functional tissue engineering of the liver and islets. Anat Rec (Hoboken). 297, 73-82 (2014).
- Chen, Q. Z., Harding, S. E., Ali, N. N., Lyon, A. R., Boccaccini, A. R. Biomaterials in cardiac tissue engineering: Ten years of research survey. Mat Sci E....
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重印与许可
