组织工程:建设多细胞三维支架的层状细胞片交货

摘要

为了创建复杂组织的高度组织结构，必须将多种材料和细胞类型组装成一个集成的复合材料。 这种组合设计结合了器官特异性分层细胞片和两种不同的生物衍生材料，其中包含强大的纤维基质基质，以及用于增强新血管形成的内皮细胞。

摘要

许多组织中，如成人心，都无法破坏后，以充分再生^。2,3策略在组织工程中提出的创新，以协助身体恢复和修复。例如，TE方法可能能够减轻心肌梗死（MI）后心脏重塑和可能增加总的心脏功能，以接近正常的预MI水平^。4与任何功能性组织，心脏组织的再生成功涉及适当的递送多种细胞类型与环境因素有利于整合植入的细胞/组织移植和生存。工程化组织应处理的多个参数包括:评价为运载工具，其对细胞存活的影响，材料强度和细胞 - 组织机构的便利可溶信号，细胞 - 细胞相互作用，并且基质材料。研究采用直接注射移植的细胞不仅无视这些基本要素^。2,5,6一种组织设计结合这些成分还有待开发。这里，我们提出的使用图案化的细胞片层的分层与两种不同类型的含有靶器官的细胞类型和内皮细胞用于增强新血管形成中的"组织"生物衍生材料集成设计的例子。虽然这些研究集中在心脏样组织的产生，此组织设计可以应用于许多器官比心脏以最小的设计和材料的变化等，并意指是断开的，现成的产品用于再生疗法。该协议包含五个详细步骤。一种温度敏感聚（N -isopropylacrylamide）（PNIPAAM）用于涂层的组织培养皿。然后，特定组织细胞的涂装板/微图案的表面的表面上培养，以形成细胞片层具有很强的横向粘连。第三，基础矩阵的组织由多孔基体结合新生血管permissi创建已经凝胶和内皮细胞。最后，将细胞片从PNIPAAm的涂覆菜肴解除，并转移到基座元件，使得整个结构。

引言

单独注射细胞和/或单一材料在其他器官系统中显示出不同的成功率，而在心脏再生方面的成功率有限。^5,7-12 目前，干细胞衍生的细胞使用多种递送方法输送到受损组织，包括：将细胞直接注射到组织中并灌注到血液供应中。^13-17 其他人单独植入细胞、单独植入材料和/或与材料载体结合，以帮助受损器官再生。^18-21 这种设计结合了多种策略，可提供材料强度、多种材料和多种单元类型的图案化。

具体来说，基础无细胞化纤维基质为结构提供了基本的物理强度，使其适合在必要时缝合到患者体内。 基质中的空隙空间被新生血管允许水凝胶²² 中的内皮细胞填充，用于快速建立植入结构的血管形成。 然后将这种复合物与预先图案化的细胞片集成，以增强细胞间通讯，更紧密地模拟天然组织。^1,23-25 分层细胞贴片的整体生产过程如图 1 中的流程图所示。

方案

1，创建PNIPAAM涂层板的

1. 解散2.6克PNIPAAM的2毫升60％甲苯/ 40％正己烷溶液。
2. 加热到60℃，将混合物搅拌10分钟，直到PNIPAAM溶解。
3. 切滤纸为60毫米直径的圆和地点纸张布氏漏斗。
4. 过滤该溶液，通过用布氏漏斗放入预先称重的玻璃烧杯（不使用塑料，如己烷将熔化的塑料）。
5. 将烧杯中，内容为钟真空（24磅）的O / N（16小时）。注:直到残留物用异丙醇反应，它会氧化所以一定要确保它不与氧气接触。
6. 称量烧杯建立PNIPAAM的重量。
7. 添加异丙醇的PNIPAAM，创造一个各占50％w / w的解决方案。
8. 放置2毫升在UV光下的溶液中的组织培养板的表面上，并且涂层为5分钟的。
9. 用2毫升温的PBS洗板两次使用的细胞培养之前。

2，创建细胞片的

注:，或通过如这里描述的涂覆的组织培养表面与热响应性聚合物可以使用许多不同的方法来创建的初级细胞对靶器官的细胞片层。预涂温敏板是由一些厂商也提供。

注:该协议是使用35毫米的菜文化。简言之，将细胞首先在37℃下进行至少24小时，在合流建立相邻单元之间的横向连接。释放细胞片材，板材受到温度低于32℃。细胞片，然后转移到含有新生血管容许水凝胶与血管内皮细胞的强碱纤维状基质。

1. 分离的细胞群。注意:此方法是依赖于个体的推导过程和细胞类型。大鼠主动脉平滑肌万亩SCLE细胞（RASMC）被用于本实例。这些是主要的平滑肌细胞从大鼠的腹主动脉分离。
2. 用2毫升温的PBS洗细胞。
3. 加入3 ml胰蛋白酶（或其他切割/解离溶液）向细胞5分钟。
4. 通过加入3毫升含10％胎牛血清（FBS）的培养基中，或磷酸盐缓冲液（PBS）的抑制的胰蛋白酶。
5. 收集细胞在锥形管和计数等分。
6. 旋转细胞以1000rpm（228 XG）5分钟。
7. 吸出上清液并将细胞重新悬浮在生长培养基（SmGM2加子弹试剂盒培养基用于RASMC）。
8. 将含有细胞的培养基上35毫米热敏制版 - PNIPAAm的涂层板，其浓度将达到100％汇合。注意:对于RASMCs该号码被确定为100000细胞/ cm ^2。然而，由于细胞的传递过程中的损失，120是VA的％略被使用。
9. 放入培养箱中，在37℃CO / N。注意:维持细胞在37℃下维持细胞粘附到板是重要的。

3，准备基础性矩阵

注意:各种三维纤维基质可用于层中的微妙细胞片层之间强的纤维基体。一些例子包括:明胶海绵，生物玻璃，天然脱细胞物质²⁶或nanospun材料^27,28在这些研究中所用的猪膀胱基质层（UBM）的慷慨从我们的合作者，Badylak医生提供^29。

1. 在使用之前，确定矩阵特征包括缺乏细胞含量如果脱细胞基质的情况下^，27,28细胞特异性存活率，和空隙空间²²中
2. 切断已预先灭菌的基质成所需的尺寸和形状。注:在这里，打孔用于切割4毫米直径的圆。

ve_title"> 4。播种内皮细胞成新生血管宽容的水凝胶

注意:内皮细胞可从各种来源，包括从干细胞或祖细胞分化而得到。这里，的HuVECs被使用。

1. 使用任何允许的水凝胶（血纤蛋白，胶原蛋白凝胶），只要交联时间短得足以使细胞保持活力。注意:在此，透明质酸（HA）的基于凝胶的交联与二硫键被使用。
2. 准备医管局水凝胶按照公司的协议。
3. 收集内皮细胞和成分散使用1X胰蛋白酶单细胞溶液。注意:的Accutase或细胞解离缓冲液也可用于单细胞分散。
4. 用大豆胰蛋白酶抑制剂等量或在PBS中的10％FBS，收集该溶液/细胞入15ml锥形管中（如果该细胞不接触到血清接触是很重要的）去激活胰蛋白酶的酶。
5. ç指望。2-15的细胞，并计算出所需要的补丁尺寸的体积（先前量化）。注意:对于4毫米的补丁，这里200万内皮细胞使用。
6. 提取200万细胞，并放入一个新的15 mL锥形管。
7. 转速为（228 XG）5分钟。
8. 吸出上清液，留下细胞在锥形管的颗粒。
9. 混合HA和明胶液体物料在1:1比值。然后加入80％总体积的成锥形管含有沉淀。
10. 重悬内皮细胞在1:1的HA /明胶混合
11. 将悬浮的细胞在HA /明胶混合物制成从步骤2中的碱纤维基体。
12. 加入所需的交联剂的总体积的五分之一（20％）的
13. 孵育1小时，在37℃。

5，隔离单元表的

1. 除去含有从培养箱和地方的细胞35毫米PNIPAAM处理板中的细胞培养罩在RT。
2. 从细胞中迅速吸出介质，并加入2毫升6％正常明胶已被加热到37℃。
3. 而明胶仍然温暖时，将金属晶格入明胶，淹没它的正常明胶（电影1）的表面之下。
4. 放置5-7分钟，整个板在冰上，使明胶硬化。
5. 7分钟后，用刮勺从板的侧面仔细分离明胶边缘，然后用钳子抬起金属晶格从板注:6％的明胶，和细胞片应该解除与晶格。
6. 将电池板的菜，并放置在基体的纤维基质的水凝胶组合的顶部，仔细设置在构建体的上方的格子。注:电池板的顶面仍然会在榜首的位置。
7. 加入2毫升温介质（37℃）。
8. 孵育O 2 / N使细胞的薄片粘附到水凝胶的表面上。
9. 除去叔后的溶液升温（约1小时），或在第二天，他的金属晶格。

结果

的流程图（ 图1）示出了制作的多层片的整体方法。细胞片从PNIPAAM处理板通过降低温度低于32℃的分离。然后将细胞板置于含有接种到底层的纤维基体（ 图1）在内皮细胞中的交联水凝胶的顶部。经预处理的温敏板，也可用于创建细胞片。特殊的拓扑表面使用专门的模式（ 即对齐）单元^30。

基底的纤维基质可以由脱细胞天然的组织基质或静电产生。这里，纤维材料的片材切成直径4毫米的片基（ 图2A）。这种材料的特性是，用于确定水凝胶可以用于填充空隙空间的量很重要。这里所使用的基质已经上10狡猾的特点和出版^。22

含有内皮细胞的水凝胶是交联的应用程序的HA水凝胶的液体组分在纤维基质后。荧光/透射显微镜显示活细胞染色，用钙黄绿素AM（ 图2B）已经捕获在交联的水凝胶。

创建电池板的过程中被成像（

讨论

在该协议中的关键步骤包括:涂布板面与温敏聚合物和冷却板后操纵的细胞片层。因为不同的细胞表现出不同的物理性质，如粘合性，升降时间应为每个不同的细胞类型进行了优化。本协议的第二个，也是最显著挑战性成分，集中在电池板，为组织组装方法的一个重要方面的操作。在电池板的单细胞层是相当脆弱的，并且可以很容易地撕开，如果操作用钳子。此外，当细胞片层中的地方不被保持时，往往会收缩，并可以很容易地折叠。使用支持屏幕所提出的电池板传输艾滋病脆弱电池板的操作。

该设计方法在这个手稿展示提供了一个相当低的成本的方法来创建一个单元格板适用于各种组织工程APPLI阳离子。此外，在一个大学实验​​室创建PNIPAAM涂层板可以标准化以这种方法和修改可以做出适应多种细胞类型，并且表面上的协议。利用细胞片层，而不是无组织的单细胞，有助于组织组件，并且还可以增加存活和整合植入组织中的可能性。但是，这些构建体的体内递送的方法（在该协议没有提及）将需要为每种组织类型进行优化。未来的应用包括探索和产生组织特定器官系统的优化方法。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂
钙黄绿素-AM	Invitrogen	C3099	细胞追踪器/活性染料
Lysotracker Red	Invitrogen	L7528	细胞追踪器
中性红色	Sigma	N7005	可见细胞染料
pNIPAAM	Sigma Aldrich	412780250	Poly（N-异丙烯酰胺）
甲苯	Sigma Aldrich	244511-1L
己烷	Sigma Aldrich	296090-1L
RAOSMC	Lonza	R-ASM-580	大鼠主动脉平滑肌细胞
SmGM2	Lonza	CC-4149	平滑肌培养基
HUVEC	Invitrogen	C-003-5C	人静脉内皮细胞
HyStem	Glycosan/Biotime
异丙醇	VWR International	BDH1133-4LP
胰蛋白酶	康宁 Cellgro	25-053-C1
PBS	Gibco	14287-072
FBS	Gibco	16140-071
特定设备
滤纸	Ahlstrom	6310-0900
布赫纳漏斗	西格玛·奥尔德里奇	Z247308
UpCell 板	Nunc	2014-11
UV light	Jelight 公司	UVO 清洁剂 Model No.42