本文描述了常用于体外研究细胞迁移和侵袭的高通可及性方法。in vitro 细胞划痕愈合实验用于测量细胞运动能力；第二种方法是Transwell迁移和侵袭实验，用于评估细胞的趋化性和侵袭能力。
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本文内容
摘要
摘要
迁移是活细胞的关键特性，在正常发育、免疫反应以及癌症转移和炎症等疾病过程中具有重要作用。研究细胞迁移的方法对于癌症生物学、免疫学、血管生物学、细胞生物学和发育生物学等广泛的生物医学研究领域非常有用且至关重要。本文以肿瘤细胞的迁移和侵袭为例，介绍两种相关实验方法，以说明目前常用且易于操作的检测手段。第一种方法是细胞培养划痕愈合实验，通过在融合生长的单层细胞上制造划痕，利用普通倒置显微镜在多个时间点拍摄图像，可定量分析伤口闭合速度和细胞迁移能力。若需更详细记录细胞迁移行为，可采用延时显微成像系统。第二种方法是Transwell细胞迁移与侵袭实验，用于检测细胞朝向化学趋化因子梯度的运动能力和侵袭能力。本文旨在以高度可操作的方式描述这些方法，使其即使在仅具备基础细胞生物学实验条件的研究实验室中也能成功实施。
引言
运动性是活细胞的基本特征。细胞迁移参与了生命形成、胚胎发育、免疫应答以及多种病理过程，如癌症转移和炎症1-9。因此，研究细胞迁移行为的方法在生物医学、生物学、生物工程及相关领域的众多学科中都是极为有用的研究工具。
在癌症研究中，细胞迁移的研究具有特殊意义，因为癌症患者死亡的主要原因与转移性进展相关。为了在体内扩散和播散，癌细胞必须迁移并侵袭穿过细胞外基质（ECM），进入血液循环，附着于远端部位，最终穿出血管形成远处病灶1,10-12。可采用多种生物学方法对这些过程进行详细研究。细胞培养伤口闭合实验以及transwell迁移和侵袭实验在科学界被广泛使用1,10。这些检测可提供必要的数据，有助于理解特定类型的细胞自发迁移的能力，或对化学趋化因子产生响应并定向迁移的能力。目前已描述了多种迁移表型：细胞可以单细胞形式迁移，如间充质样或类阿米巴运动，也可以多细胞协同运动的形式迁移，后者被称为集体迁移或细胞流13。运动性细胞所采用的迁移方式可通过细胞培养伤口闭合实验直接观察。
在众多研究细胞迁移的方法中，细胞划痕实验是最简单的方法之一。该方法可用于评估整个细胞群体的迁移能力。若进一步深入分析，还可用于观察单个细胞在迁移过程中的形态学特征14。通过分析划痕闭合情况，可揭示多种表型。将实验组与对照组相比，测量随时间推移的划痕闭合距离，可能发现特定的迁移变化或此前未知的迁移功能受损表型。此外，单个细胞的片状伪足形成、尾部回缩以及定向移动等特征，可为研究目标细胞中哪些功能受到抑制或增强提供线索14。
Transwell 迁移和侵袭实验可用于分析单个细胞对各种趋化因子（如趋化因子蛋白、生长因子、脂质或核苷酸）产生定向反应的能力4,5,8,15,16。该实验还可用于评估因受体过表达而导致的迁移能力差异1,14。这些实验还可用于鉴定和表征细胞迁移的关键调控因子，例如小GTP酶Rho家族2。通过这些简短且易于操作的检测，还可进一步确定细胞迁移模式以及细胞侵入三维基质的能力。
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方案
1. 细胞培养伤口愈合实验
- 使用0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液从组织培养板上消化细胞。将细胞在15 ml锥形管中离心沉淀，吸除上清液，用培养基重悬细胞。在6孔板中接种适量细胞，使其在24小时内达到100%汇合度。
注意：由于细胞类型和所用孔板孔径大小的不同（例如，1 x 10⁵），可能需要进行预实验以确定达到100%汇合度所需的时间和细胞数量。6 B16F10 黑色素瘤细胞接种于6孔板的单个孔中，于造伤前24小时进行。也可使用12孔板或24孔板。
注意：如果有条件，可将细胞接种至经处理的组织培养板上的培养插件（Culture-Insert，ibidi LLC 公司产品）中，从而预先形成划痕。使用培养插件可保护组织培养板表面免受移液器枪头的损伤。若使用培养插件，则省略步骤 1.2。 - 在无菌环境（通常为生物安全柜）中，使用200 μl移液器吸头紧压细胞培养板表面，迅速垂直划过细胞单层以制造划痕。可根据需要选择不同规格的移液器吸头以获得所需的划痕宽度。操作时避免对培养板表面施加过大压力，以免损伤板面。若划痕已预先制备，此步骤可省略。
- 小心吸除培养基和细胞碎片。沿孔壁缓慢加入足量的培养基，使其覆盖孔底，避免额外细胞脱落。在划痕形成并检查后，应拍摄第一张图像。将组织培养板置于设定为适当温度和CO₂浓度的培养箱中2 浓度（通常为 37 °C 和 5% CO2).
- 在多个时间点 例如 每3小时将培养板从培养箱中取出，置于倒置显微镜下拍摄一张快照图像，并检查伤口闭合情况。若具备延时显微成像条件，可在温度和CO₂恒定的环境中，每隔X分钟（通常从每5分钟开始）拍摄照片，持续任意时长。2 可控环境培养室。根据细胞类型的不同，伤口闭合时间可能有所差异。
- 为分析快照图像的结果，使用比例尺测量伤口一侧到另一侧的距离。利用散点图或柱状图分析并清晰展示随时间推移的伤口闭合情况。 例如 图1.
- 为分析延时拍摄的图片，将图片导入ImageJ软件（可免费下载自http://rsb.info.nih.gov/ij/）以制作视频。操作步骤如下：打开ImageJ，点击文件（File）、导入（Import）和图像序列（Image Sequence）。找到存放图片的文件夹，选中该文件夹中的第一张照片。通过选择文件（File）、另存为（Save as）和AVI格式来保存视频。可观察单个迁移细胞以表征其定向运动。此外，也可研究细胞形态学特征，如伪足形成和尾端回缩等现象。图2 以及补充视频。
2. Transwell 细胞迁移和侵袭实验
- 在无菌环境（通常为生物安全柜）中，使用非酶解细胞解离缓冲液或0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液将细胞从组织培养板上解离下来，通过离心收集细胞沉淀，并吸除原有培养基，保留细胞沉淀。用含0.1% BSA（牛血清白蛋白）的无血清细胞培养基重悬细胞。
注意：根据所研究的细胞系不同，0.25%胰蛋白酶-EDTA可能因切割细胞表面多种受体而影响细胞迁移和侵袭能力17。
注意：每毫升细胞数量取决于细胞大小。可能需要进一步测试以确定能获得最佳结果的接种密度。通常情况下，当使用24孔Transwell小室时，1 × 106 个细胞/mL是大多数细胞类型的合适起始点。Transwell小室有多种规格，应根据具体尺寸相应调整接种细胞数量。 - 将100 μl细胞悬液加入Transwell小室的滤膜上方，并在37 °C、5% CO2条件下孵育10分钟，使细胞沉降。
注意：所用Transwell膜的孔径大小应根据样本中细胞的个体尺寸而定。例如，若细胞过小，可能无需主动迁移即可穿过孔隙；若细胞过大，则可能无法通过孔隙。目前市面上有多种孔径的Transwell小室，如用于细胞迁移实验的3 µm、5 µm和8 µm孔径产品。此类小室可由Corning等公司商业化购得。
注意：Transwell细胞迁移实验可简便地改造为细胞侵袭实验。具体操作为：在Transwell膜上方添加细胞外基质（ECM）材料，再将细胞接种于ECM之上。例如，将Matrigel置于冰上解冻并液化后，取30–50 µl加入24孔Transwell小室中，在37 °C培养箱内孵育15–30分钟使其凝固，形成一层薄凝胶。随后将细胞悬液加至Matrigel涂层上方，以模拟细胞穿过细胞外基质的侵袭过程。
注意：Transwell细胞迁移实验与Transwell细胞侵袭实验存在明显区别。前者用于检测细胞向化学趋化因子迁移的能力（即趋化性）；而后者则同时检测细胞的趋化性及其穿透细胞外基质的能力，这一过程常见于癌症转移或胚胎发育过程中。 - 使用移液器小心地将600 μl所需化学趋化因子加入24孔板下室底部。添加过程中避免移动Transwell小室，并防止产生气泡。确保下室中的趋化因子液体与上室滤膜接触，以形成化学趋化梯度。孵育时间取决于细胞类型及所用趋化因子。
注意：可能需要进一步测试以确定最佳孵育时长。
注意：对于贴壁细胞，已迁移的细胞会附着在滤膜的另一侧1,8。迁移细胞的定量分析可按照步骤2.4至2.8进行（步骤2.4–2.8无需在无菌环境中操作）。对于非贴壁细胞，迁移后的细胞会落入下室培养基中，其数量可通过血细胞计数板或流式细胞仪进行计数5。 - 将Transwell小室从培养板中取出。根据需要多次使用棉签小心去除滤膜上表面未迁移的培养基和残留细胞，注意不得损伤滤膜。
- 向24孔板的一个孔中加入600–1,000 μl 70%乙醇。将Transwell小室置于70%乙醇中固定10分钟。随后取出小室，用棉签小心去除滤膜上表面残留的乙醇，并让滤膜自然干燥（通常需10–15分钟）。
- 向24孔板的一个孔中加入600–1,000 μl 0.2%结晶紫染液，并将Transwell小室置于其中进行染色。室温孵育5–10分钟。
- 用移液枪头或棉签轻轻移除滤膜上表面的结晶紫染液。为避免冲走已固定的细胞，需极其小心地将滤膜多次浸入蒸馏水中，以彻底去除多余的结晶紫染料。随后让Transwell滤膜自然干燥。
- 在倒置显微镜下观察，计数不同视野中穿过滤膜并向趋化因子方向迁移、附着于滤膜底面的细胞数量，计算平均值（图3）。
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结果
划痕愈合实验和Transwell细胞迁移实验在此使用小鼠B16F10黑色素瘤细胞作为模型系统进行。在划痕愈合实验中，将B16F10细胞接种于6孔组织培养板中，培养24小时至100%汇合。随后制造一个约 700 µm 使用移液器枪头制造划痕，并利用延时显微镜记录伤口闭合（细胞迁移）过程。若无延时显微镜，也可通过在不同时间点拍摄静态图像来研究伤口闭合情况。1. 显示了延时系列中 0、4、8 和 12 小时时间点的四张图片 图1根据伤口的宽度，我们计算了细胞迁移的距离和速度 40.42 µm/hr (图1B）。使用 ImageJ 程序将延时图片合成为视频（见补充视频）。可对细胞动态迁移过程进行观察研究。如图所示 图2可见迁移细胞的形态，具有片状伪足（前缘）和尾部（后缘）。
在Transwell细胞迁移实验中，使用了Corning公司的24孔插入式培养板。将B16F10黑色素瘤细胞以1 × 106 个细胞/ml的浓度重悬于迁移缓冲液中，该缓冲液由...
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讨论
细胞迁移是癌症研究中的一个重要研究方面，也可应用于发育、免疫和伤口愈合研究。细胞培养伤口闭合实验以及transwell细胞迁移和侵袭实验能够揭示细胞迁移行为的详细信息，并可用于研究细胞迁移的分子机制1,2,10,14。本研究利用这些细胞运动性实验，测定B16F10黑色素瘤细胞系的迁移速度和侵袭能力。
细胞划痕愈合实验用于检测特定细胞系迁移并闭合在融合细胞单层上人为制造的“伤口”的能力。该实验对具备基础设备的研究团队而言易于实施，相较于现有其他方法，是一种测量细胞迁移的简便方式。在不同处理组之间，划痕愈合实验可能存在一定变异，但可通过多个步骤加以减少。其中一种降低变异的方法是使每个样本接种相同数量的细胞，以实现同步的融合状态，并在实验开始时维持细胞的健康状态。可能需要进行多次细胞培养实验，以确定在不同独立样本间实现一致融合程度和良好细胞状态所需的确切接种细胞数量。此外，增加样本量也可减少实验变异。对于迁移速度较慢、需要超过24小时孵育时间才能观察到显著迁移的细胞系，使用蚜虫霉素（aphidicolin）或其他增殖抑制剂可防止细胞数量变化，从而避免对实验结果造成潜...
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
作者感谢东卡罗来纳大学多媒体与技术服务部门的 Mike Myles、Sam Saunders 和 C.W. Elton 在视频制作过程中提供的帮助。我们感谢北卡罗来纳生物技术中心、高尔夫球手对抗癌症组织、Brody Brothers 基金会、美国心脏协会以及东卡罗来纳大学/Vidant 癌症研究与教育基金（L.V.Y. 和 M.J.R.）提供的资助支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 杜尔贝科’改良型伊格尔培养基（DMEM） | Gibco | 11995-073 | |
| 胎牛血清（FBS） | 双子座 | 100106 | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Sigma-Aldrich | A4503-50G | |
| 0.25% 胰蛋白酶 EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 杜尔贝科’磷酸盐缓冲液（DPBS） | Gibco | 14190-250 | |
| 结晶紫 | Sigma | C0775-100G | 溶于水，浓度为0.2% |
| 细胞解离缓冲液 | Gibco | 13151-014 | |
| 细胞培养箱 | 赛默飞世尔科技 | 型号 3145 | |
| SterilGARD 生物安全柜 | The Baker Company, Inc. | 型号 # VBM-600 | |
| EVOS Fl 倒置显微镜 | 赛默飞世尔科技 | 型号 # AMF-4302-US | |
| 组织培养板 | Becton Dickinson | 353046 | 货号因培养板类型而异 |
| Corning Transwell 小室 | Fisher | 07-200-150 | 货号因膜的孔径大小而异 |
参考文献
- Castellone, R. D., Leffler, N. R., Dong, L., Yang, L. V. Inhibition of tumor cell migration and metastasis by the proton-sensing GPR4 receptor. Cancer Lett. 312 (2), 197-208 (2011).
- Hall, A. The cytoskeleton and cancer. Cancer Metastasis Rev. 28, (2009).
- Lauffenburger, D. A., Horwitz, A. F. Cell migration: a physically integrated molecular process. Cell. 84 (3), 359-369 (1996).
- Peter, C., et al. Migration to apoptotic "find-me" signals is mediated via the phagocyte receptor G2A. J. Biol. Chem. 283 (9), 5296-5305 (2008).
- Radu, C. G., Yang, L. V., Riedinger, M., Au, M., Witte, O. N. T cell chemotaxis to lysophosphatidylcholine through the G2A receptor. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101 (1), 245-250 (2004).
- Buul, J. D., Hordijk, P. L. Signaling in leukocyte transendothelial migration. Arterioscler Thromb. Vasc. Biol. (5), 824-833 (2004).
- Yang, L. V., Heng, H. H., Wan, J., Southwood, C. M., Gow, A., Li, L. Alternative promoters and polyadenylation regulate tissue-specific expression of Hemogen isoforms during hematopoiesis and spermatogenesis. 228 (4), 606-616 (2003).
- Yang, L. V., Radu, C. G., Wang, L., Riedinger, M., Witte, O. N. Gi-independent macrophage chemotaxis to lysophosphatidylcholine via the immunoregulatory GPCR G2A. Blood. 105 (3), 1127-1134 (2005).
- Yoshida, M., Yoshida, K. Sperm chemotaxis and regulation of flagellar movement by Ca2+. Mol. Hum. Reprod. 17 (8), 457-465 (2011).
- Albini, A. Tumor and endothelial cell invasion of basement membranes. The matrigel chemoinvasion assay as a tool for dissecting molecular mechanisms. Pathol. Oncol. Res. 4 (3), 230-241 (1998).
- Fidler, I. J. Critical determinants of metastasis. Semin. Cancer Biol. 12 (2), 89-96 (2002).
- Steeg, P. S. Tumor metastasis: mechanistic insights and clinical challenges. Nat. Med. 12 (8), 895-904 (2006).
- Roussos, E. T., Condeelis, J. S., Patsialou, A. Chemotaxis in cancer. Nat. Rev. Cancer. 11 (8), 573-587 (2011).
- Zhang, Y., et al. Comparative study of 3D morphology and functions on genetically engineered mouse melanoma cells. Integr. Biol. (Camb. 4 (11), 1428-1436 (2012).
- Junger, W. G. Purinergic regulation of neutrophil chemotaxis. Cell. Mol. Life Sci. 65 (16), 2528-2540 (2008).
- Lazennec, G., Richmond, A. Chemokines and chemokine receptors: new insights into cancer-related inflammation. Trends Mol. Med. 16 (3), 133-144 (2010).
- Huang, H. L., et al. Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. J. Biomed. Sci. 17, (2010).
- Cortesio, C. L., Boateng, L. R., Piazza, T. M., Bennin, D. A., Huttenlocher, A. Calpain-mediated proteolysis of paxillin negatively regulates focal adhesion dynamics and cell migration. J. Biol. Chem. 286 (12), 9998-10006 (2011).
- Wehrle-Haller, B., Imhof, B. A. Actin microtubules and focal adhesion dynamics during cell migration. Int. J. Biochem. Cell Biol. 35 (1), 39-50 (2003).
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