体外 细胞迁移与侵袭实验

摘要

本文描述了常用于体外研究细胞迁移和侵袭的高通可及性方法。in vitro 细胞划痕愈合实验用于测量细胞运动能力；第二种方法是Transwell迁移和侵袭实验，用于评估细胞的趋化性和侵袭能力。

摘要

迁移是活细胞的关键特性，在正常发育、免疫反应以及癌症转移和炎症等疾病过程中具有重要作用。研究细胞迁移的方法对于癌症生物学、免疫学、血管生物学、细胞生物学和发育生物学等广泛的生物医学研究领域非常有用且至关重要。本文以肿瘤细胞的迁移和侵袭为例，介绍两种相关实验方法，以说明目前常用且易于操作的检测手段。第一种方法是细胞培养划痕愈合实验，通过在融合生长的单层细胞上制造划痕，利用普通倒置显微镜在多个时间点拍摄图像，可定量分析伤口闭合速度和细胞迁移能力。若需更详细记录细胞迁移行为，可采用延时显微成像系统。第二种方法是Transwell细胞迁移与侵袭实验，用于检测细胞朝向化学趋化因子梯度的运动能力和侵袭能力。本文旨在以高度可操作的方式描述这些方法，使其即使在仅具备基础细胞生物学实验条件的研究实验室中也能成功实施。

引言

运动性是活细胞的基本特征。细胞迁移参与了生命形成、胚胎发育、免疫应答以及多种病理过程，如癌症转移和炎症^1-9。因此，研究细胞迁移行为的方法在生物医学、生物学、生物工程及相关领域的众多学科中都是极为有用的研究工具。

在癌症研究中，细胞迁移的研究具有特殊意义，因为癌症患者死亡的主要原因与转移性进展相关。为了在体内扩散和播散，癌细胞必须迁移并侵袭穿过细胞外基质（ECM），进入血液循环，附着于远端部位，最终穿出血管形成远处病灶^1,10-12。可采用多种生物学方法对这些过程进行详细研究。细胞培养伤口闭合实验以及transwell迁移和侵袭实验在科学界被广泛使用^1,10。这些检测可提供必要的数据，有助于理解特定类型的细胞自发迁移的能力，或对化学趋化因子产生响应并定向迁移的能力。目前已描述了多种迁移表型：细胞可以单细胞形式迁移，如间充质样或类阿米巴运动，也可以多细胞协同运动的形式迁移，后者被称为集体迁移或细胞流¹³。运动性细胞所采用的迁移方式可通过细胞培养伤口闭合实验直接观察。

在众多研究细胞迁移的方法中，细胞划痕实验是最简单的方法之一。该方法可用于评估整个细胞群体的迁移能力。若进一步深入分析，还可用于观察单个细胞在迁移过程中的形态学特征¹⁴。通过分析划痕闭合情况，可揭示多种表型。将实验组与对照组相比，测量随时间推移的划痕闭合....

方案

1. 细胞培养伤口愈合实验

1. 使用0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液从组织培养板上消化细胞。将细胞在15 ml锥形管中离心沉淀，吸除上清液，用培养基重悬细胞。在6孔板中接种适量细胞，使其在24小时内达到100%汇合度。
   注意：由于细胞类型和所用孔板孔径大小的不同（例如，1 x 10⁵），可能需要进行预实验以确定达到100%汇合度所需的时间和细胞数量。⁶ B16F10 黑色素瘤细胞接种于6孔板的单个孔中，于造伤前24小时进行。也可使用12孔板或24孔板。
   注意：如果有条件，可将细胞接种至经处理的组织培养板上的培养插件（Culture-Insert，ibidi LLC 公司产品）中，从而预先形成划痕。使用培养插件可保护组织培养板表面免受移液器枪头的损伤。若使用培养插件，则省略步骤 1.2。
2. 在无菌环境（通常为生物安全柜）中，使用200 μl移液器吸头紧压细胞培养板表面，迅速垂直划过细胞单层以制造划痕。可根据需要选择不同规格的移液器吸头以获得所需的划痕宽度。操作时避免对培养板表面施加过大压力，以免损伤板面。若划痕已预先制备，此步骤可省略。
3. 小心吸除培养基和细胞碎片。沿孔壁缓慢加入足量的培养基，使其覆盖孔底，避免额外细胞脱落。在划痕形成并检查后，应拍摄第一张图像。将组织培养板置于设定为适当温度和CO₂浓度的培养箱中₂ 浓度（通常为 37 °C 和 5% CO₂).
....

结果

划痕愈合实验和Transwell细胞迁移实验在此使用小鼠B16F10黑色素瘤细胞作为模型系统进行。在划痕愈合实验中，将B16F10细胞接种于6孔组织培养板中，培养24小时至100%汇合。随后制造一个约 700 µm 使用移液器枪头制造划痕，并利用延时显微镜记录伤口闭合（细胞迁移）过程。若无延时显微镜，也可通过在不同时间点拍摄静态图像来研究伤口闭合情况。¹. 显示了延时系列中 0、4、8 和 12 小时时间点的四张图片 图1根据伤口的宽度，我们计算了细胞迁移的距离和速度 40.42 µm/hr (图1B）。使用 ImageJ 程序将延时图片合成为视频（见补充视频）。可对细胞动态迁移过程进行观察研究。如图所示 图2可见迁移细胞的形态，具有片状伪足（前缘）和尾部（后缘）。

在Transwell细胞迁移实验中，使用了Corning公司的24孔插入式培养板。将B16F10黑色素瘤细胞以1 × 10⁶ 个细胞/ml的浓度重悬于迁移缓冲液中，该缓冲液由.......

讨论

细胞迁移是癌症研究中的一个重要研究方面，也可应用于发育、免疫和伤口愈合研究。细胞培养伤口闭合实验以及transwell细胞迁移和侵袭实验能够揭示细胞迁移行为的详细信息，并可用于研究细胞迁移的分子机制^1,2,10,14。本研究利用这些细胞运动性实验，测定B16F10黑色素瘤细胞系的迁移速度和侵袭能力。

细胞划痕愈合实验用于检测特定细胞系迁移并闭合在融合细胞单层上人为制造的“伤口”的能力。该实验对具备基础设备的研究团队而言易于实施，相较于现有其他方法，是一种测量细胞迁移的简便方式。在不同处理组之间，划痕愈合实验可能存在一定变异，但可通过多个步骤加以减少。其中一种降低变异的方法是使每个样本接种相同数量的细胞，以实现同步的融合状态，并在实验开始时维持细胞的健康状态。可能需要进行多次细胞培养实验，以确定在不同独立样本间实现一致融合程度和良好细胞状态所需的确切接种细胞数量。此外，增加样本量也可减少实验变异。对于迁移速度较慢、需要超过24小时孵育时间才能观察到显著迁移的细胞系，使用蚜虫霉素（aphidicolin）或其他增殖抑制剂可防止细胞数量变化，从而避免对实验结果造成潜.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
杜尔贝科’改良型伊格尔培养基（DMEM）	Gibco	11995-073
胎牛血清（FBS）	双子座	100106
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma-Aldrich	A4503-50G
0.25% 胰蛋白酶 EDTA	Gibco	25200-056
杜尔贝科’磷酸盐缓冲液（DPBS）	Gibco	14190-250
结晶紫	Sigma	C0775-100G	溶于水，浓度为0.2%
细胞解离缓冲液	Gibco	13151-014
细胞培养箱	赛默飞世尔科技		型号 3145
SterilGARD 生物安全柜	The Baker Company, Inc.		型号 # VBM-600
EVOS Fl 倒置显微镜	赛默飞世尔科技		型号 # AMF-4302-US
组织培养板	Becton Dickinson	353046	货号因培养板类型而异
Corning Transwell 小室	Fisher	07-200-150	货号因膜的孔径大小而异