神经可塑性是胃肠道（GI）中日益受到关注但尚不充分理解的特征。在此，以人类胰腺疾病为例，我们介绍了一种 体外 用于研究胃肠道神经可塑性在形态学和功能水平上的神经可塑性检测方法。
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本文内容
摘要
摘要
神经可塑性是肠神经系统和胃肠道（GI）神经支配在病理条件下的一种固有特征。然而，神经可塑性在胃肠道疾病中的病理生理作用仍不明确。能够模拟和调控胃肠道神经可塑性的新型实验模型，可能有助于更深入理解神经可塑性在特定胃肠道疾病（如胰腺癌（PCa）和慢性胰腺炎（CP））中的作用。本文介绍一种在体外模拟胰腺神经可塑性的实验方案 体外 利用新生大鼠背根神经节（DRG）和肠肌间神经丛（MP）神经元，在特定条件下开展双神经元研究。这种双神经元方法不仅能够监测器官内在性和外在性神经可塑性，而且为评估神经元和胶质细胞的形态学及电生理特性提供了有力工具。此外，该体系允许对提供的微环境成分进行功能调控，以研究其对神经可塑性的影响。一旦建立，本神经可塑性检测方法有望适用于任何胃肠道器官中神经可塑性的研究。
引言
胃肠道（GI）神经形态和密度的改变长期以来一直受到胃肠病学家和病理学家的关注，但其在胃肠道疾病病理生理学中的意义仍不明确1-3事实上，多种常见的胃肠道疾病，如胃炎、反流性食管炎、结肠炎、憩室炎和阑尾炎，均与炎症组织区域神经支配密度的增加相关。1然而，迄今为止，人们对胃肠道中神经可塑性的机制及其意义尚未给予真正的关注。形态发生改变的胃肠道神经与正常的胃肠道神经是否存在差异？ 即 肠神经系统在功能上的正常状态是什么？可塑性肠神经中神经肽/神经递质含量的改变具有哪些意义？外周神经可塑性是否必然导致向中枢神经系统的信号传递发生改变？可塑性的外在胃肠道神经通路的中枢投射位于何处？当我们审视目前对胃肠道神经可塑性功能特征认知的匮乏时，很容易提出一系列类似的关键科学问题。
在功能水平上研究胃肠道神经可塑性需要具备有效性、可重复性且仍易于应用的实验模型。在基因工程条件性小鼠模型（GECoMM）日益流行并被广泛接受的时代，此类 体内 该设置有望以更真实的方式揭示胃肠道神经可塑性此前未知的方面1然而，GECoMM 的设计与制备仍然成本高昂、耗费人力，尤其是耗时漫长。此外，它们还需要 先验的 在基因改造小鼠中选择可进行条件性调控的目标例如 转基因过表达 神经生长因子/NGF ....
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方案
本方案中的所有动物实验操作均遵循德国慕尼黑工业大学的动物护理指南。
1. 培养基/提取液的制备
- 组织匀浆
组织匀浆的质量对于后续检测培养神经元中的神经可塑性改变至关重要。建议使用一种能够在不显著升高组织温度的情况下实现组织解离的匀浆器。- 将 5 mm × 5 mm × 5 mm 的胰腺组织块直接从 -80 °C 转移至液氮中，并置于组织匀浆器的固相状态中。理想的匀浆器应能足够快速地解离组织，同时防止其解冻。
- 解离后立即用 300–500 µl 的 0.1× 磷酸盐缓冲液（PBS）重悬呈粉末状的固态匀浆物。此处请勿使用任何裂解缓冲液（如 RIPA），以免导致神经元裂解。
- 将匀浆物在台式离心机的最大速度下（e.g. 21,130 × g）离心至少 15 分钟。收集澄清的上清液，即为组织提取物。
- 细胞系上清液
- 让目标细胞在正常生长培养基中生长至至少 70–80% 汇合度。
- 通常，这些培养基含有血清成分，可能对神经元生长产生不可控的影响。因此，在达到所需细胞密度后，用细胞培养级 PBS 至少洗涤细胞 3 次，并将其置于无血清培养基（SFM）中培养最多 48 小时。
注意： 请注意，某些细....
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结果
形态学神经可塑性
在指定的日龄范围内（出生后2-12天，P2-12）以及所述的接种密度下，小鼠小脑颗粒神经元（MP）和背根神经节神经元（DRG）在培养48小时后已形成致密的神经网络（图2A）。比较在PCa、CP和NP提取物中培养的神经元的神经突密度，结果显示，在PCa或CP提取物中培养的DRG神经元其神经突密度高于在NP提取物中培养的神经元（图2A）5。我们更倾向于选择MP神经元用于单个神经元的测量，因为MP神经元相较于DRG神经元更容易从周围的胶质细胞中分离。在此条件下，生长在PCa或CP提取物中的MP神经元也比生长在含NP提取物培养基中的MP神经元具有更长的神经突，并表现出更复杂的分支模式（图2B）5。若在NP、CP和PCa提取物诱导的神经元形态之间未观察到上述差异，则提示实验中可能存在技术问题。大多数情况下，这可能是由于：1）制备的提取物质量较差，原因可能是处理时间过长；或2）神经元在分离过程中受到损伤所致。
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讨论
本方案旨在阐述以下方法的原理 体外 胰腺神经可塑性检测方法，该方法由我组近期开发，用于研究胰腺癌和慢性胰腺炎中神经可塑性的机制5该方案包括为期三天的操作流程，一旦操作者在背根神经节（DRG）和肠肌丛（MP）神经元的分离与培养方面积累了足够经验，即可轻松实施。此外，该方法为研究肠神经系统胶质细胞与DRG相关胶质细胞对胰腺微环境成分的同步反应提供了有价值的工具。
在我们看来，该检测方法最引人注目的特点之一是其能够检测并模拟前列腺癌（PCa）和慢性前列腺炎（CP）发生过程中出现的改变即 神经 sprouting 与肥大）在简化的体系中 体外 确实，应用组织提取物或细胞上清液会导致神经元形态发生改变，通过系统性的形态计量学分析足以检测到这些变化。最近，我们还证明该检测方法在同时比较多种癌症实体的神经营养潜能时也具有敏感性：当比较前列腺癌（PCa）细胞系与结直肠癌细胞系的神经营养特性时，PCa细胞系在背根神经节（DRG）神经元中诱导出的神经突密度显著高于结直肠.......
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披露
作者没有竞争利益，也没有财务披露。
致谢
所有作者均对本研究所述检测方法的建立与验证以及论文初稿的撰写做出了贡献。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 聚-D-赖氨酸氢溴酸盐 | Sigma-Aldrich | P1149 | |
| 鸟氨酸/层粘连蛋白 | Sigma-Aldrich | P2533/L4544 | |
| 13 mm 盖玻片 | Merck | 用于24孔板 | |
| Dismembranator S | Sartorius | ||
| 抗β-III微管蛋白抗体 | Millipore | MAB1637 | 使用浓度1:200 |
| 抗GFAP抗体 | DAKO | M0761 | 使用浓度1:400 |
| RIPA裂解液 + 蛋白酶抑制剂 | 任意供应商 | ||
| Neurobasal培养基 | Gibco/Life Sciences | 21103-049 | |
| B-27添加剂 | Gibco/Life Sciences | 17504044 | B-27的质量已知与批号相关 |
| 庆大霉素/甲硝唑 | 任意供应商 | ||
| 最低必需培养基 | Gibco/Life Sciences | 31095-029 | |
| Hank’s平衡盐溶液（HBSS） | Gibco/Life Sciences | 24020133 | 含Ca/Mg时可增强胶原酶活性 |
| II型胶原酶 | Worthington Biochemical | CLS-2 | 应选用酶活性至少为200 U/mg的批次 |
| 0.25%胰蛋白酶-EDTA | Gibco/Life Sciences | 25200056 | |
| 4%多聚甲醛 | 任意供应商 | ||
| analySIS docu 软件 | Olympus |
参考文献
- Demir, I. E., Schafer, K. H., Tieftrunk, E., Friess, H., Ceyhan, G. O. Neural plasticity in the gastrointestinal tract: chronic inflammation, neurotrophic signals, and hypersensitivity. Acta Neuropathol. 125, 491-509 (2013).
- Vasina, V., et al.
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