模拟胰腺神经可塑性：体外双神经元可塑性检测

摘要

神经可塑性是胃肠道（GI）中日益受到关注但尚不充分理解的特征。在此，以人类胰腺疾病为例，我们介绍了一种 体外 用于研究胃肠道神经可塑性在形态学和功能水平上的神经可塑性检测方法。

摘要

神经可塑性是肠神经系统和胃肠道（GI）神经支配在病理条件下的一种固有特征。然而，神经可塑性在胃肠道疾病中的病理生理作用仍不明确。能够模拟和调控胃肠道神经可塑性的新型实验模型，可能有助于更深入理解神经可塑性在特定胃肠道疾病（如胰腺癌（PCa）和慢性胰腺炎（CP））中的作用。本文介绍一种在体外模拟胰腺神经可塑性的实验方案 体外 利用新生大鼠背根神经节（DRG）和肠肌间神经丛（MP）神经元，在特定条件下开展双神经元研究。这种双神经元方法不仅能够监测器官内在性和外在性神经可塑性，而且为评估神经元和胶质细胞的形态学及电生理特性提供了有力工具。此外，该体系允许对提供的微环境成分进行功能调控，以研究其对神经可塑性的影响。一旦建立，本神经可塑性检测方法有望适用于任何胃肠道器官中神经可塑性的研究。

引言

胃肠道（GI）神经形态和密度的改变长期以来一直受到胃肠病学家和病理学家的关注，但其在胃肠道疾病病理生理学中的意义仍不明确^1-3事实上，多种常见的胃肠道疾病，如胃炎、反流性食管炎、结肠炎、憩室炎和阑尾炎，均与炎症组织区域神经支配密度的增加相关。¹然而，迄今为止，人们对胃肠道中神经可塑性的机制及其意义尚未给予真正的关注。形态发生改变的胃肠道神经与正常的胃肠道神经是否存在差异？ 即 肠神经系统在功能上的正常状态是什么？可塑性肠神经中神经肽/神经递质含量的改变具有哪些意义？外周神经可塑性是否必然导致向中枢神经系统的信号传递发生改变？可塑性的外在胃肠道神经通路的中枢投射位于何处？当我们审视目前对胃肠道神经可塑性功能特征认知的匮乏时，很容易提出一系列类似的关键科学问题。 

在功能水平上研究胃肠道神经可塑性需要具备有效性、可重复性且仍易于应用的实验模型。在基因工程条件性小鼠模型（GECoMM）日益流行并被广泛接受的时代，此类 体内 该设置有望以更真实的方式揭示胃肠道神经可塑性此前未知的方面¹然而，GECoMM 的设计与制备仍然成本高昂、耗费人力，尤其是耗时漫长。此外，它们还需要 先验的 在基因改造小鼠中选择可进行条件性调控的目标例如 转基因过表达 神经生长因子/NGF 在肠上皮细胞中）。因此，为了成功设计GECoMM，研究人员需要一些指标（例如 有价值靶点的先前实验数据 即 感兴趣的目标分子（此处 NGF) 至少可预期对胃肠道神经产生某些具有生物学意义的影响。

此类指标可轻松从适当的 体外 复杂微环境中介离出的细胞亚群模型 体内 系统可选择性地以异型共培养方式培养^4-7在这样一种异质培养环境中，对分子靶点的调控平均而言在技术上较为简便、速度更快，因此有助于筛选值得进一步验证的靶点 体内 研究。

最近，我们提出了一种 体外 旨在模拟人胰腺癌（PCa）和慢性胰炎（CP）组织中胰腺内神经密度增加及神经肥大的神经可塑性检测方法。在此实验中，将来自新生大鼠背根神经节（DRG）或肠肌间神经丛（MP）的神经元分别暴露于手术切除的PCa或CP组织提取物中，并与在正常人胰腺（NP）组织提取物中培养的神经元进行比较⁵。除了组织提取物外，还可以使用细胞系上清液来研究特定细胞类型对神经可塑性的影响。当与标准化的形态计量学测量相结合时，本研究所展示的神经可塑性检测方法能够对不同胰腺微环境中神经可塑性的反应进行有效且可重复的评估。特别是，该方法可用于模拟 1）形态学神经可塑性， 即 神经突起的生长、分支模式和神经元大小的变化，以及2）功能性神经可塑性， 即 外周神经元兴奋性的改变。此外，不仅外周（即 肠源性），还包括中枢（例如 背根神经节（DRG）或二阶脊髓神经元可被纳入本实验，以评估其对不同胃肠道组织成分的形态学和功能学反应。在本视频教程中，我们演示了该实验的技术操作流程，并讨论其优势与局限性。此外，我们强调该实验基本原理可广泛适用于研究任一胃肠道器官中的神经可塑性。

方案

本方案中的所有动物实验操作均遵循德国慕尼黑工业大学的动物护理指南。

1. 培养基/提取液的制备

1. 组织匀浆
   组织匀浆的质量对于后续检测培养神经元中的神经可塑性改变至关重要。建议使用一种能够在不显著升高组织温度的情况下实现组织解离的匀浆器。
   1. 将 5 mm × 5 mm × 5 mm 的胰腺组织块直接从 -80 °C 转移至液氮中，并置于组织匀浆器的固相状态中。理想的匀浆器应能足够快速地解离组织，同时防止其解冻。
   2. 解离后立即用 300–500 µl 的 0.1× 磷酸盐缓冲液（PBS）重悬呈粉末状的固态匀浆物。此处请勿使用任何裂解缓冲液（如 RIPA），以免导致神经元裂解。
   3. 将匀浆物在台式离心机的最大速度下（e.g. 21,130 × g）离心至少 15 分钟。收集澄清的上清液，即为组织提取物。
2. 细胞系上清液
   1. 让目标细胞在正常生长培养基中生长至至少 70–80% 汇合度。
   2. 通常，这些培养基含有血清成分，可能对神经元生长产生不可控的影响。因此，在达到所需细胞密度后，用细胞培养级 PBS 至少洗涤细胞 3 次，并将其置于无血清培养基（SFM）中培养最多 48 小时。
      注意： 请注意，某些细胞（如胰腺星状细胞）可能需要在生长培养基中添加血清以维持其正常状态和结构。在此类情况下，应对目标细胞的培养基进行系列血清稀释，以确定维持细胞正常功能所需的最低血清浓度。
   3. 通过 Bradford 蛋白质测定法测定组织匀浆物或细胞上清液中的蛋白浓度。尽管该数值因组织和细胞类型而异，但对于胰腺组织提取物，预期蛋白浓度范围为 5–12 µg/µl，而对于细胞系上清液，则为 3–8 µg/µl。

2. 分装提取物和细胞上清液

根据检测中要使用的浓度， 神经元培养基中提取物或上清液的终浓度应为100 µg/ml ^5,8.

注意： 对于在24孔板中每孔含有500 µl培养基的神经元实验，每个孔需要来自每种提取物或上清液的50 µg蛋白质。在典型的提取物浓度约为10 µg/µl时，每孔需加入5 µl提取物或上清液。在每次以三复孔形式进行的实验中，这相当于共需15 µl提取物或上清液。对于不同的组织或细胞类型，应对最终的提取物或上清液浓度进行系列稀释，并比较不同提取物或上清液浓度下的神经营养效应。

3. 神经元的分离

提取/上清液收集完成后，继续进行神经元的分离。

1. 对于背根神经节（DRG）神经元，取出生后第2至12天（P2–P12）新生大鼠，在断头后通过体视显微镜解剖分离颈段至腰段的背根神经节图1A为了获得足够用于24孔板的背根神经节（DRG）神经元，每块板需收集一只新生大鼠从颈段至腰段的所有背根神经节（共52个DRG）。
   1. 使用显微剪刀切除背根神经节的外周（神经）突起和中枢突起（根）。
      保留突起结构会阻碍吹打操作，并增加成纤维细胞污染培养物的风险。
2. 对于MP神经元，从小肠上切除肠系膜，并手动小心剥离小肠的浆膜肌层（关于MP分离的详细方案，请参见Schäfer 等⁹, 图1B对于MP，每24孔板收集两只大鼠的神经丛。
   注意： 尽量轻柔操作，以避免浆肌层撕裂，因为撕裂会阻碍其与小肠的成功分离。
3. 将背根神经节和血清肌层收集于含庆大霉素（500 ml 培养基中含 20 mg）和甲硝唑（500 ml 培养基中含 2.5 mg）的冰冻最低必需培养基（MEM）中。
4. 采集背根神经节（DRG）后，将其置于含有II型胶原酶的Hank’s平衡盐溶液（HBSS）中孵育20–30分钟。对于巨噬细胞（MP）的分离，根据动物年龄的不同，使用II型胶原酶孵育1–3小时。图1C).
5. 对于微脉管（MP），在体视显微镜下收集网状的MP片段，并转移至预冷的MEM中。
6. 然后使用直径递减的注射器研磨DRG和MP。
   注意： 过度吹打会破坏神经元，但对胶质细胞的损伤较小。
7. 一旦含有DRG或MP的培养基变得浑浊，于93.9 × g离心5分钟，弃去上清液，用Neurobasal培养基（添加100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素、0.5 mM L-谷氨酰胺和2% B-27）重悬沉淀。
8. 统计细胞总数（即 神经元和胶质细胞）通过血细胞计数板进行计数。
   注意： 所需细胞数量取决于测量参数。在进行神经突密度定量时，需要比测量神经突生长、胞体大小以及单个神经元分支模式时更密集的培养，因此需要更多的细胞。对于神经突密度的测量，请使用 例如 每孔接种10,000个细胞（神经元+胶质细胞）或每孔1,500个神经元。若需对单个神经元进行形态学测量，建议对细胞进行短暂（1分钟）胰蛋白酶消化，并接种每孔2,500个细胞或每孔400个神经元。通常每只大鼠获得的细胞数约为300,000–500,000个。
9. 将细胞接种于前一晚已包被的13 mm盖玻片上，并用Neurobasal培养基（添加100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素、0.5 mM L-谷氨酰胺和2% B-27）补满孔内图1D).
   注意： 使用多聚-D-赖氨酸（40 mg/m²）或鸟氨酸和层粘连蛋白包被的盖玻片（各1 mg/ml）。细胞在聚-D-赖氨酸上贴附速度极快，因此适用于需要大量细胞的实验即 神经突密度测量）。与层粘连蛋白的黏附性总体较弱，但层粘连蛋白能显著促进神经突生长。因此，在进行神经元分支和神经突长度测量时，优先选用鸟氨酸/层粘连蛋白包被。
10. 让细胞在培养板孔中贴壁过夜。次日，配制添加提取物的培养基（提取物/上清液终浓度为 100 µg/ml）。
11. 吸弃接种培养基，可选地用 PBS 进行一次非常轻柔的洗涤，然后缓慢加入含有提取物/上清液的培养基图1E).
12. 让细胞生长48小时。吸去培养基，用4%多聚甲醛固定，用于免疫染色（图1F).
13. 使用神经元特异性抗体进行双重免疫荧光染色例如 βIII-微管蛋白）和胶质细胞特异性（例如 胶质纤维酸性蛋白/GFAP 标记物（图1G).
14. 进行形态测量时，使用配备CCD相机的倒置光学显微镜，并结合自动化软件以测量神经突密度（见表格）。
15. 通过在每张盖玻片上神经突生长最密集的4个不同区域，以200倍放大倍数拍摄4-5张具有代表性的显微照片，并叠加50 µm的测量网格，来测定神经元培养物的神经突密度。 50 µm 网格并计数纤维 每平方单位面积内交叉纤维的密度。通过随机选取每张盖玻片上30个孤立神经元，并标记其神经突和胞体，可测量神经突生长、每个神经元的平均分支数、平均分支长度以及胞体大小。图1H).

结果

形态学神经可塑性

在指定的日龄范围内（出生后2-12天，P2-12）以及所述的接种密度下，小鼠小脑颗粒神经元（MP）和背根神经节神经元（DRG）在培养48小时后已形成致密的神经网络（图2A）。比较在PCa、CP和NP提取物中培养的神经元的神经突密度，结果显示，在PCa或CP提取物中培养的DRG神经元其神经突密度高于在NP提取物中培养的神经元（图2A）⁵。我们更倾向于选择MP神经元用于单个神经元的测量，因为MP神经元相较于DRG神经元更容易从周围的胶质细胞中分离。在此条件下，生长在PCa或CP提取物中的MP神经元也比生长在含NP提取物培养基中的MP神经元具有更长的神经突，并表现出更复杂的分支模式（图2B）⁵。若在NP、CP和PCa提取物诱导的神经元形态之间未观察到上述差异，则提示实验中可能存在技术问题。大多数情况下，这可能是由于：1）制备的提取物质量较差，原因可能是处理时间过长；或2）神经元在分离过程中受到损伤所致。

讨论

本方案旨在阐述以下方法的原理 体外 胰腺神经可塑性检测方法，该方法由我组近期开发，用于研究胰腺癌和慢性胰腺炎中神经可塑性的机制⁵该方案包括为期三天的操作流程，一旦操作者在背根神经节（DRG）和肠肌丛（MP）神经元的分离与培养方面积累了足够经验，即可轻松实施。此外，该方法为研究肠神经系统胶质细胞与DRG相关胶质细胞对胰腺微环境成分的同步反应提供了有价值的工具。

在我们看来，该检测方法最引人注目的特点之一是其能够检测并模拟前列腺癌（PCa）和慢性前列腺炎（CP）发生过程中出现的改变即 神经 sprouting 与肥大）在简化的体系中 体外 确实，应用组织提取物或细胞上清液会导致神经元形态发生改变，通过系统性的形态计量学分析足以检测到这些变化。最近，我们还证明该检测方法在同时比较多种癌症实体的神经营养潜能时也具有敏感性：当比较前列腺癌（PCa）细胞系与结直肠癌细胞系的神经营养特性时，PCa细胞系在背根神经节（DRG）神经元中诱导出的神经突密度显著高于结直肠...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
聚-D-赖氨酸氢溴酸盐	Sigma-Aldrich	P1149
鸟氨酸/层粘连蛋白	Sigma-Aldrich	P2533/L4544
13 mm 盖玻片	Merck		用于24孔板
Dismembranator S	Sartorius
抗β-III微管蛋白抗体	Millipore	MAB1637	使用浓度1:200
抗GFAP抗体	DAKO	M0761	使用浓度1:400
RIPA裂解液 + 蛋白酶抑制剂			任意供应商
Neurobasal培养基	Gibco/Life Sciences	21103-049
B-27添加剂	Gibco/Life Sciences	17504044	B-27的质量已知与批号相关
庆大霉素/甲硝唑			任意供应商
最低必需培养基	Gibco/Life Sciences	31095-029
Hank’s平衡盐溶液（HBSS）	Gibco/Life Sciences	24020133	含Ca/Mg时可增强胶原酶活性
II型胶原酶	Worthington Biochemical	CLS-2	应选用酶活性至少为200 U/mg的批次
0.25%胰蛋白酶-EDTA	Gibco/Life Sciences	25200056
4%多聚甲醛			任意供应商
analySIS docu 软件	Olympus