体外黏附实验可用于研究肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）对上皮细胞单层的黏附作用，并可用于探索潜在的干预措施，例如使用益生菌抑制肺炎链球菌的定植。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
方法文章
研究益生菌对肺炎球菌定植影响的实验方法 体外 黏附实验
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae，又称肺炎球菌）黏附于鼻咽部上皮衬里可导致定植，并被认为是引发肺炎和中耳炎等肺炎球菌感染的前提条件。体外黏附实验可用于研究肺炎球菌对上皮细胞单层的黏附作用，并可用于探索潜在干预措施（例如使用益生菌）以抑制肺炎球菌 定植。 本文所述方案用于研究益生菌唾液链球菌（Streptococcus salivarius）对肺炎球菌黏附人上皮细胞系CCL-23（有时称为HEp-2细胞）的影响。该实验包括三个主要步骤：1）上皮细胞和细菌的制备；2）将细菌加入上皮细胞单层；3）通过活菌计数（连续稀释和平板接种）或定量实时PCR（qPCR）检测黏附的肺炎球菌。该技术相对简单，除细胞培养设备外无需特殊仪器。该实验可用于测试其他益生菌种类和/或潜在的肺炎球菌定植抑制剂，并可轻松修改以探讨有关肺炎球菌黏附与侵袭的其他科学问题。
引言
Streptococcus pneumoniae（肺炎链球菌）是一种革兰氏阳性细菌，可引起肺炎、中耳炎和脑膜炎等感染。在低收入国家，它是儿童疾病的主要病因，每年估计导致约80万名五岁以下儿童死亡1。肺炎链球菌常在幼儿的鼻咽部定植。尽管这种定植通常被认为是无症状的，但它先于肺炎链球菌感染的发生，并在人群中作为细菌的储存库2。肺炎链球菌结合疫苗可有效减少疫苗所含血清型的定植。然而，目前已知的肺炎链球菌血清型有90多种，接种疫苗可能导致血清型替代现象，即疫苗血清型被清除后，非疫苗血清型的定植率和致病率随之上升3。此外，在某些高风险人群中，肺炎链球菌的定植往往发生在生命早期，早于第一剂疫苗的接种时间4,5。近年来，益生菌的使用被提出作为抑制肺炎链球菌定植的另一种策略6,7。体外黏附实验已被用于研究肺炎链球菌的黏附能力8,9。这些实验方法已被改进，用于探究益生菌Lactobacillus rhamnosus GG（LGG）对肺炎链球菌黏附的影响10。
除了LGG和其他乳酸菌之外， Streptococcus salivarius一种常见的口腔定植菌，因其定植潜力以及抑制肺炎链球菌和其他呼吸道病原体的能力，已被研究作为呼吸道潜在的益生菌 体外
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
1. 上皮细胞与细菌细胞的制备
- CCL-23 上皮细胞的复苏
- 将含有 10% 胎牛血清（FBS）的最低必需培养基（MEM）在 37 °C 水浴中预热约 30 分钟。
- 使用前，用紫外灯对经组织培养认证的生物安全柜灭菌至少 10 分钟，并用 70% 乙醇擦拭工作区域。用 70% 乙醇擦拭预热的培养基瓶外表面，并放入生物安全柜中。
- 使用 25 ml 移液管将 14 ml 培养基转移至 T-75 培养瓶中。将培养瓶置于 37 °C 培养箱中，同时进行细胞复苏（见步骤 1.1.4）。
- 按照适当的安全防护措施，从液氮储存中取出一支 CCL-23 细胞冻存管，在 37 °C 水浴中温育至约 80% 融化。
- 将步骤 1.1.3 中准备好的培养瓶放回生物安全柜。用 70% 乙醇擦拭 CCL-23 细胞冻存管外表面，使用 P1000 移液枪将内容物（1 ml）转移至 T-75 培养瓶中。
- 将培养瓶侧放，于 37 °C、5% CO2、95% 相对湿度的组织培养孵箱中过夜培养（16–20 小时）。
- 在显微镜下检查细胞，确认细胞形态健康后，吸除旧培养基，更换为 15 ml 新鲜预热的 MEM + 10% FBS。
- CCL-23 上皮细胞的维持培养
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
来自一个代表性实验的结果，其中肺炎链球菌（pneumococci）S. pneumoniae PMP843（一种定植性19F分离株）在加入CCL-23细胞1小时后被添加至其中 S. salivarius，通过活菌计数和 lytA qPCR 结果如图所示 表2结果在两种方法之间具有一致性，包括细菌的绝对数量（以CFU/ml表示）和黏附率（% adherence），后者以仅含肺炎链球菌孔中的黏附肺炎链球菌数量为基准进行归一化。肝素作为对照使用，因其已知可抑制肺炎链球菌的黏附，因此在肺炎链球菌 + 肝素条件下黏附减少（通常） <与单独的肺炎球菌相比降低40%表明实验成功。 S. salivarius 以剂量依赖的方式抑制肺炎链球菌的黏附，如所示 表2，其中高浓度的 S. salivarius （约10） S. salivarius 1 型肺炎链球菌）导致最低的肺炎链球菌黏附。
图5
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
该实验的关键步骤是在第 3.1.7 和 3.1.12 节中加入适当浓度的 S. salivarius 和肺炎链球菌。浓度通过 OD 读数进行估算，但确切的接种量需等到次日平板计数后才能确定。因此，我们建议对实验中使用的所有菌株进行生长曲线测定，以测量 OD 值和活菌数（CFU/ml）随时间的变化，从而确定对数中期，并辅助通过 OD 值估算浓度。此外，不同肺炎链球菌菌株在黏附特性上可能存在显著差异。建议选用黏附能力较强的菌株（在 3 小时孵育后，超过 >10% 的接种菌黏附于上皮细胞）用于研究益生菌抑制肺炎链球菌黏附能力的实验。即使由经验丰富的操作人员完成，不同实验之间的黏附水平仍可能存在差异，这一点从图 5中相对较大的误差条即可看出。因此，我们建议每个实验至少重复三次，每种实验条件设两个复孔。在使用大肠杆菌（Escherichia coli）进行的黏附实验中也已有类似变异性的报道18。本方案中，在加入肺炎链球菌后，细胞孵育时间为 3 小时。若进行黏附时间进程实验并发现大部分细菌在孵育第一小时内即已完成黏附，则可缩短孵育时间。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由墨尔本儿童研究所和维多利亚州政府运营基础设施支持计划资助。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 最低必需培养基（MEM） | Thermo Fisher Scientific | SH30244.01 | |
| 胎牛血清（FBS） | Thermo Fisher Scientific | SH30084.03 | |
| T-75 培养瓶 | Nunc | 156472 | |
| CCL-23 细胞 | ATCC | CCL-23 | |
| 胰蛋白酶（Trypsin） | Life Technologies | 15090046 | |
| 24 孔细胞培养板 | Nunc | 142475 | |
| 马血琼脂（HBA）平板 | Oxoid | PP2001 | 羊血琼脂平板也可接受 |
| 托德-休伊特肉汤（Todd-Hewitt Broth） | Oxoid | CM0189 | |
| 酵母提取物 | Beckton Dickinson | 212750 | |
| 皂苷（Digitonin） | Sigma-Aldrich | D141-100MG | |
| 一次性比色皿 | Kartell | 1938 | |
| 肝素（Heparin） | Pfizer | 2112105 | 以无菌安瓿包装，每 5 mL 含 5,000 IU/ |
| 无菌涂布棒 | Technoplas | S10805050 | 也可使用玻璃涂布棒，每次使用前浸入 96% 乙醇并火焰灭菌 |
| 溶菌酶（Lysozyme） | Sigma-Aldrich | L6876 | |
| 突变溶素（Mutanolysin） | Sigma-Aldrich | M9901 | |
| 蛋白酶 K（Proteinase K） | Qiagen | 19133 | |
| 20% SDS 溶液 | Ambion | AM9820 | |
| RNase A | Qiagen | 19101 | |
| QIAamp DNA mini-kit (250) | Qiagen | 51306 | |
| LytA F 引物 | Sigma-Aldrich | 定制合成 | 5' -> 3' 序列 ACGCAATCTAGCAGATGAAGCA |
| LytA R 引物 | Sigma-Aldrich | 定制合成 | 5' -> 3' 序列 TCGTGCGTTTTAATTCCAGCT |
| LytA 探针 | Eurogentec | 定制合成 | 5' -> 3' 序列 Cy5-TGCCGAAAACGCTTGATACAGGGAG-BHQ3，可使用其他荧光染料 |
| 无核酸酶水 | Ambion | AM9906 | |
| Brilliant III Ultra Fast QPCR 预混液 | Agilent Technologies | 600880 | |
| Thermo-Fast 96 检测板 | Thermo Fisher Scientific | AB-1100 | |
| Ultraclear qPCR 封板条 | Thermo Fisher Scientific | AB-0866 | |
| Mx3005 QPCR 系统 | Agilent Technologies | 401449 | |
| *所列大多数/全部产品均有其他可选来源 |
参考文献
- O'Brien, K. L., et al. Burden of disease caused by Streptococcus pneumoniae in children younger than 5 years: global estimates. Lancet. 374, 893-902 (2009).
- Bogaert, D., de Groot, R., Hermans, P. W. M. Streptococcus pneumoniae colo....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
