八细胞期端足类甲壳动物Parhyale hawaiensis单细胞消融

摘要

两栖类片脚类动物Parhyale hawaiensis 是研究甲壳动物胚胎学以及节肢动物比较发育与进化的理想模式生物。本实验方案描述了一种从Parhyale早期卵裂阶段胚胎中手动去除单个卵裂球的方法。

摘要

端足类动物Parhyale hawaiensis是一种小型甲壳动物，广泛分布于全球潮间带海洋生境中。在过去十年中，Parhyale 已成为发育生物学实验室研究中一个极具前景的模式生物，可作为与已被深入研究的节肢动物模式生物Drosophila melanogaster进行有效外群比较的工具。与Drosophila的合胞体卵裂不同，Parhyale的早期卵裂为全裂型。通过向早期卵裂球中注射示踪染料进行命运图谱标记的研究表明，三个胚层以及生殖系在八细胞期时均已建立。在此阶段，有三个卵裂球注定发育为外胚层，三个注定发育为中胚层，其余两个卵裂球则分别为内胚层和生殖系的前体细胞。然而，卵裂球消融实验表明，Parhyale胚胎还具有显著的调控能力，即在八细胞期被消融的卵裂球的命运可由其余部分卵裂球的后代细胞所取代。此前，卵裂球消融主要通过两种方法实现：注射光毒性染料并随后激活，或手动消融。然而，光消融虽可杀死目标卵裂球，却无法从胚胎中清除死亡的细胞体。因此，对于某些研究应用而言，完全物理性地移除特定卵裂球可能是更优的消融方法。本文介绍了一种在Parhyale胚胎八细胞期手动移除单个卵裂球的实验方案，详细说明了完成细胞体完全移除所必需的仪器与手动操作步骤，同时确保其余卵裂球保持存活且结构完整。该方案可适用于Parhyale八细胞期的任意细胞，也可用于其他早期卵裂阶段的卵裂球。此外，原则上，该方法还可推广应用于其他进行全裂型卵裂的海洋无脊椎动物的早期卵裂阶段胚胎。

引言

近十年来，端足类甲壳动物Parhyale hawaiensis 已成为进化发育生物学研究中极具潜力的模式生物¹。在节肢动物中，大多数模式生物属于昆虫，其中研究最为深入的是果蝇Drosophila melanogaster。D. melanogaster 属于昆虫纲双翅目，因此其胚胎发育特征相较于基部分支的昆虫已发生较多衍生性变化²。此外，昆虫嵌套于泛甲壳动物亚门（Pancrustacea）³ 内，这意味着昆虫在系统发育上最接近被称为“泛甲壳类”的传统自然类群，而该类群为并系群。这表明，除了基部分支的昆虫模型外，还需研究其他甲壳类动物，以更全面地理解在D. melanogaster 中已被广泛研究的发育性状及分子机制的进化历史。然而，目前可用于实验性实验室发育分析的甲壳类动物极为有限。Parhyale hawaiensis 是一种实验操作性极强的实验室模式系统，适用于多种实验技术。端足类在其所属的高等端足总目（Peracarida，包括跳虾、钩虾和井虾）中表现出许多独特特征，因此被认为在该甲壳类群中属于较晚衍生的类群。尽管如此，Parhyale 所具备的胚胎学操作与功能遗传学操控的相对便利性，使其成为当前模式生物体系中极为宝贵的补充。

作为一种实验动物， P. hawaiensis 具有诸多优势。该动物对广泛的温度和盐度范围具有耐受性，并能在大量人工海水中良好存活。¹根据明显的形态学差异可以轻松区分雄性和雌性，最显著的特征是雄性具有大型钩状的前部躯干附肢，用于在交配期间抓住雌性。对于胚胎学和发育研究， P. hawaiensis 具有多个非常吸引人的特点。胚胎发育持续约10天，在28 ºC条件下约六周达到性成熟（但需注意 帕拉哈尔 在约 20–30 ºC 的温度范围内具有良好的存活率，且在 18 ºC 条件下培养的胚胎已有详细的发育分期信息可供参考⁴，25 ºC⁴，以及 26 ºC^5,6）。成虫在实验室条件下全年均可交配，因此一年中任何时候均可获得胚胎。雌性将2-20枚受精卵（数量取决于雌性个体的年龄）产入位于前几对附肢之间的腹面育卵囊中。图1A 和 1B），并且可以在胚胎发育的早期无创地采集这些胚胎，而不会导致雌性个体死亡或对胚胎造成损伤（图1C胚胎可在过滤的人工海水中存活至孵化，并可用于后续的基因表达或组织学分析⁷，详细的分期表可准确识别发育进程的各个阶段⁵. 采用稳健的实验方案进行基因表达分析 原位 杂交^8-15 或免疫染色^4,16,17，通过RNA干扰实现功能敲低^13,15 或吗啉寡聚核苷酸¹²，以及稳定的种系转基因¹⁸. 利用转基因系统，实现可诱导表达¹⁴ 和增强子捕获¹⁹ 方法也可用于研究基因在 P. hawaiensis尽管目前尚无公开可用的基因组序列，但已获得包含卵子发生和胚胎发生期间转录产物的转录组数据 从头合成 组装并注释²⁰，并存入可搜索的数据库中²¹，促进基因发现。总之， P. hawaiensis 是一种高度易于操作的模式生物，适用于多种实验和遗传学方法来研究发育过程。

与黑腹果蝇（D. melanogaster）早期的合胞体卵裂不同，夏威夷短臂虾（P. hawaiensis）的胚胎在受精后进行全裂式卵裂（图2A）。谱系追踪分析表明，到第三次卵裂时，每个第三次卵裂的卵裂球已特异地决定其发育命运，分别形成三个胚层之一或生殖系⁶（图2B）。这些数据，结合微阵列数据²²、细胞谱系分析^6,23以及卵裂球分离实验⁴，提示发育潜能通过细胞命运决定因子的不对称遗传，已被分配至至少部分第三次卵裂的卵裂球中。因此，在卵裂球消融实验中，若在八细胞期移除生殖系前体细胞（在Parhyale细胞谱系命名法中称为“g”⁶），胚胎在后续发育阶段将缺乏生殖细胞⁴，表现为缺乏表达Vasa蛋白的细胞——该蛋白是大多数后生动物中生殖系的标志物²⁴。相反，体细胞卵裂球消融实验表明，P. hawaiensis胚胎也具有显著的调节能力，八细胞期被消融的中胚层或外胚层前体卵裂球的命运可由其余卵裂球的后代细胞所取代²⁵。目前尚不清楚这种调节性细胞命运替代是如何发生的，以及体细胞卵裂球自主决定其命运的程度。诸如卵裂球消融等实验胚胎学技术有助于理解细胞命运决定的相对自主性与非自主性^26,27 ，因此在研究P. hawaiensis胚胎发生过程中具有重要意义。

在证明外胚层和中胚层谱系具有调节性替代能力的实验中，通过显微注射²⁸并随后激发光毒性染料²⁵来实现卵裂球消融。尽管该技术能够有效杀死被注射的卵裂球，但并不能将死亡细胞完全从胚胎中清除。此外，通过向卵裂球注射荧光谱系示踪剂获取原肠胚形成阶段的细胞谱系数据^28,29，与通过追踪未受干扰卵裂球在相同胚胎发育阶段的发育过程所获得的数据之间也观察到了差异²³。因此，完全物理性移除特定卵裂球可能是某些应用中更理想的消融方法。

我们此前发表了对单个细胞被人工消融的胚胎进行细胞谱系分析的结果²³。然而，从早期卵裂阶段胚胎中去除单个卵裂球所需的精细操作尚未被完整描述。本文中，我们提供了一种收集P. hawaiensis胚胎以及从八细胞期胚胎中人工消融单个卵裂球的实验方案。该方法的目标是将细胞本体完全从胚胎中移除，从而观察胚胎发育及胚后发育过程中剩余细胞的细胞行为和细胞命运潜能。我们的方案展示了生殖系前体细胞g的移除过程（图2C），但该方法可适用于八细胞期的任意细胞，也可用于更早卵裂阶段的卵裂球。原则上，本方案还可推广应用于其他全裂型卵裂的海洋无脊椎动物的早期卵裂阶段胚胎中单个细胞的去除。

方案

对执行某些步骤可能有帮助的说明以斜体标出。

1. 第1天：材料准备

1. 准备以下材料（参见材料与设备列表）：
   • 15 cm 和 22 cm 的巴斯德吸管
   • 金刚石刻刀
   • 含 1 mg/ml 两性霉素 B（取 100 mg/ml 储存液按 1:100 稀释）、100 单位/ml 青霉素和 100 mg/ml 链霉素（取含 5,000 单位/ml 青霉素和 5,000 mg/ml 链霉素的储存液按 1:50 稀释）的过滤人工海水（盐度介于 0.0018–0.0020 之间）
   • 不含添加剂的过滤人工海水（盐度介于 0.0018–0.0020 之间）
   • 用于饲养配对个体的大型塑料容器（至少 15 cm × 15 cm × 5 cm）
   • 内衬 Sylgard 的小型（3 cm 或 5 cm）培养皿
   • 小型（3 cm 或 5 cm）培养皿
   • 表面皿或玻璃多孔板
   • 镊子（我们使用由旧 Dumont #5 镊子改造而成的钝头镊子，这些镊子在其他实验操作中意外损坏后，通过镊子磨石进行修整，确保镊尖光滑、两侧尖端长度一致且无锐利尖端。极细的镊子，如新的 Dumont #5 镊子，不推荐使用，因其可能损伤胚胎和/或雌性个体）
   • 末端扩大的巴斯德吸管（见下文步骤 1.2）
   • 由细弯钨丝嵌入巴斯德吸管细端制成的胚胎回收工具（可用其他替代工具；见下文 1.3）
   • 具有小开口的口吸管（见下文步骤 1.4）
   • 由拉制玻璃毛细管制成的玻璃针（见下文步骤 1.5）
   本实验方案中未使用对人类有毒的材料。然而，研究人员应根据所在机构的风险管理指南，佩戴手套或其他必要的防护装备。
2. 制作扩大的巴斯德吸管时，首先用金刚石刻刀在 15 cm 巴斯德吸管开始变细的位置周围划痕，用 Kimwipe 或纸巾包裹划痕区域以保护手指，然后小心地在划痕处折断管尖。将断口端在本生灯火焰上加热数秒以使边缘光滑。开口应略窄于吸管的最大宽度。
3. 制作钨丝解剖工具时，将一根钨丝插入 15 cm 玻璃巴斯德吸管的一端，并短暂置于本生灯火焰上加热玻璃，使玻璃熔化以固定钨丝。用镊子轻轻将钨丝末端弯成钩状。合适的工具形状示例见图 3。
4. 为口吸管制作小开口时，将 22 cm 巴斯德吸管的细端在火焰上拉成两段，折断细端的尖端，然后插入口吸管手柄末端。
5. 使用拉针仪 拉制用于消融过程中穿刺目标卵裂球的玻璃针。图 4展示了合适形状的针示例。该针使用 Sutter P97 拉针仪，按照程序参数 2×(加热 = 566，拉力 = 100，速度 = 20，时间 = 250) + 1×(加热 = 566，拉力 = 100，速度 = 100，时间 = 250) 拉制而成。拉针所用的具体程序和仪器可有所不同，但所制玻璃针必须具有精细的尖端，同时具备足够的强度，在接触胚胎绒毛膜时不会断裂。

2. 第1天：收集Parhyale 交配对

1. 使用加宽的巴斯德吸管（如上文步骤1.2所述）从大培养容器中收集交配中的 P. hawaiensis 成对个体，并将其转移至另一个含有洁净人工海水的容器中。该人工海水无需经过过滤。最好在傍晚稍晚时收集正在交配的个体，并将这些成对个体在室温（20–23 ºC）下过夜培养，以便次日早晨大多数胚胎已处于刚受精并产出的状态，即适合进行消融操作的早期卵裂阶段。应至少收集20对交配个体，以确保次日早晨有一定数量的雌性个体携带处于早期卵裂阶段的胚胎。

3. 第2天：Parhyale 胚胎的收集

• 次日早晨，用 CO₂ 饱和过滤的人工海水（FASW）。部分雌性个体在夜间会从雄性配偶中游离出来；收集这些分离的雌性个体，并将其麻醉于含 CO₂ 的 FASW 中。 未配对的雄性个体可从交配容器中移除，并放回大规模培养体系中。剩余的交配对可保留，用于当天晚些时候或次日收集胚胎。
• 将一只携带胚胎的麻醉雌性个体转移至盛有含 CO₂ 的 FASW 的表面皿中。所有已分离的雌性个体很可能已完成产卵，卵可通过雌性透明的基节板肉眼观察到，呈淡粉色或紫色的球形结构（图1A）。为判断胚胎是否处于早期卵裂阶段，因而适用于胚裂球消融实验，研究人员需将胚胎从育卵囊中取出，并在显微镜下进行观察。
• 在解剖显微镜下观察操作过程，用镊子夹住身体一侧的基节板。胚胎可见于这些基节板之间的腹侧育卵囊内（图1B）。
• 将细而弯曲的金属丝工具（图3；见上文步骤1.3）插入育卵囊的后端，轻轻将金属丝向育卵囊前端提起，以分离育卵囊的覆盖结构（这些是称为育卵叶（oostegites）³⁰ 的特化腹侧附肢），从而打开育卵囊并松动其中的胚胎。产卵后约一小时内的胚胎均包裹在一层极薄且透明的膜中，该膜易被金属丝工具破坏；此膜在产卵后约2–3小时即消失，此后直至胚胎发育全程，胚胎彼此之间以及与母体之间均无任何连接。若研究人员发现使用弯曲金属丝工具从育卵囊中取出胚胎操作不便或困难，可选用其他替代工具，前提是操作动作轻柔，且不对胚胎或育卵囊施加剧烈压力。适用于从育卵囊中取出胚胎的其他工具包括钝头镊子或末端密封并磨光的玻璃毛细管。
• 使用未经改造的15 cm巴斯德移液管，将液体冲入已打开的育卵囊，以冲出胚胎，胚胎应会沉降至表面皿底部。随后将雌性个体转移至清洁的FASW（不含CO₂）中，使其恢复，再重新放回主培养体系。多个雌性个体可置于同一恢复皿中，但需确保其完全恢复后再放回主培养体系，否则若仍处于部分麻醉状态，可能被其他动物捕食。
• 使用未经改造的15 cm巴斯德移液管将胚胎转移至盛有清洁FASW的培养皿中，在显微镜下观察以确定其胚胎发育阶段。挑选处于第三次卵裂（第4阶段 ⁵）的胚胎用于本实验。本方案也可应用于原肠胚盘形成前的任何卵裂阶段（第7–8阶段 ⁵）。

4. 第2天：单细胞消融

1. 在铺有Sylgard的培养皿中加入一层浅海水中。使用未经修改的15 cm巴斯德移液管将单个胚胎转移至培养皿中。
2. 使用钝头镊子轻轻滚动胚胎，以识别需要消融的细胞（图2A和 2B）。生殖系前体细胞g可被识别为最小的微裂球，位于最小的大裂球Mav之上。此外，g不直接与细胞en接触，因为中胚层前体微裂球ml和mr在胚胎中央共享一条细胞边界。mr是位于g右侧的裂球，而ml是位于g左侧的微裂球。mr、ml和en的姐妹大裂球分别为外胚层前体Er、El和Ep。
3. 若研究者为右利手，则用左手持镊子（若为左利手则用右手），将胚胎调整方向，使目标细胞位于右侧（左利手者则位于左侧），并用镊子轻轻夹住胚胎以固定。
4. 使用拉制的玻璃针（见步骤1.5；图4）轻轻刺穿目标细胞。切勿将针插入过深，以免刺入目标细胞邻近或下方的细胞。针只需穿透绒毛膜及下方的细胞膜，无需深入细胞内部即可完成消融。
5. 将用于刺穿胚胎的玻璃针更换为带有精细拉制巴斯德移液管尖端的口控移液管玻璃端（见步骤1.4）。将移液管尖端靠近目标细胞上所形成的孔洞，并施加极轻微的负压吸力。
6. 用镊子非常轻柔地挤压胚胎。当裂球内容物通过步骤4.4中形成的孔洞被挤出绒毛膜时，用口控移液管将其吸出，以便清晰观察胚胎。若孔洞足够大，可能还会看到被刺穿细胞的细胞核被挤出，这有助于确认整个细胞内容物已被完全清除，无法再生。
7. 在移除目标裂球的过程中仔细观察胚胎。被刺穿细胞的边界会向绒毛膜上的孔洞方向回缩，使下方细胞的交界变得可见。持续施加压力，直至目标裂球完全被移除。使用镊子将胚胎左右轻轻翻滚，目视确认目标裂球已彻底清除。
8. 使用未经修改的15 cm巴斯德移液管，将胚胎转移至洁净的FASW+培养液中（FASW + 1 mg/ml两性霉素B、100单位/ml青霉素和100 mg/ml链霉素）。
9. 将裂球消融后的胚胎置于洁净的48孔板的各个独立孔中，用FASW+培养，每日更换50%含抗生素的FASW+。在我们的实验条件下，即使经过消融处理，胚胎在18–28 ºC温度范围内仍能良好存活并正常发育。研究者应根据自身条件选择适宜的培养温度，确保拥有清洁（不一定无菌）且干扰最小的培养表面。为了能够将裂球消融胚胎的发育事件时间点与对照组进行比较，我们建议读者参考已在18 ºC⁴、25 ºC⁴和26 ºC^5,6条件下建立的详细胚胎发育分期资料。

结果

按照本方案所述，成功消融单个第三次卵裂的P. hawaiensis小裂球后，其余小裂球会逐渐轻微移动位置，以部分占据被消融裂球原先所处的空间。例如，当消融g裂球时，其相邻的裂球mr和ml会轻微移动，进而共享原先直接与g接触的侧向细胞边界（比较图2A与2C）。成功消融后，剩余裂球在进入第四次卵裂前可能会出现轻微延迟（不足一小时），但随后应恢复与未操作胚胎至少至原肠胚阶段相同的卵裂模式和时间进程²³。在消融四个小裂球中的任何一个后，其余裂球的后代也应表现出正常的卵裂时序和细胞行为，包括形成一种称为“玫瑰花结”（rosette）的特征性细胞排列，以及启动原肠胚运动²³。对于初次掌握该技术的研究人员而言，经消融处理后存活并完成胚胎发育直至孵化的胚胎比例最初可能约为10%，但随着经验积累，平均存活率应可达约50%，若操作熟练并仔细护理消融后的胚胎，存活率甚至可高达75%。

讨论

我们描述了一种手动消融并完全物理移除端足类动物P. hawaiensis早期卵裂阶段单个卵裂球的实验方案。通过在八细胞期胚胎中移除唯一的生殖系前体细胞g，我们展示了该方案的应用，并通过确认在后续胚胎发育过程中不存在g的子代细胞，验证了消融的成功。该方案可用于在早期卵裂阶段移除胚胎中的任意一个小型卵裂球（micromere）。若需利用此方案在该阶段移除大型卵裂球（macromere），或在第一次或第二次卵裂阶段移除卵裂球，使用者只需在步骤4.4中制作稍大的卵膜切口，并在步骤4.6中施加更长时间的压力和吸力，以移除体积更大的细胞内容物即可。我们发现，采用本方案进行消融后，剩余卵裂球的发育在卵裂模式和细胞运动行为方面均未受到影响，至少可维持至原肠胚形成时期²³。

该方案可能有助于进一步研究这种端足类动物早期卵裂期分裂球的发育潜能。该领域仍有许多问题有待解答，包括为何某些细胞能够改变其命运以替代被消融的分裂球，而其他细胞则不能，以及这些调节性变化的精确时间与机制。此外，该方案也可稍作...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
15 厘米巴斯德吸管	Wheaton	53499-630 VWR	用于将完整胚胎和单卵裂球消融后的胚胎在培养皿之间转移。
22 厘米巴斯德吸管	Wheaton	53499-632 VWR	用于制作口吸管尖端。
3 厘米培养皿	Thermo Scientific	25382-334 VWR	部分保持未处理状态，用于收集和储存胚胎；部分涂覆一层Sylgard（见下文），以创建用于卵裂球消融的操作表面。
48 孔板	Greiner Bio-One	82051-004 VWR	用于消融后胚胎的培养。
瓶顶滤器 0.2 µm	Nalge Nunc International	28199-296 VWR	用于制备FASW（见下文）。
本生灯	VWR	89038-530 VWR	用于制作钨丝工具以及口吸管的精细尖端。
金刚石刻线笔	Musco Sports Lighting	52865-005 VWR	用于制作宽口巴斯德吸管，以收集交配中的个体。
镊子	Fine Science Tools	11050-10 Fine Science Tools	用于在从麻醉雌体的育卵囊中取出胚胎时固定个体。无需使用尖端极细的Dumont镊子——其尖端可至少与目录编号所列镊子一样钝。
抗真菌剂-两性霉素B（Fungizone-Amphotericin B）	Sigma	A2942 Sigma Aldrich	加入FASW中，终浓度为1 mg/ml，并用此溶液培养单卵裂球消融后的胚胎。
玻璃毛细管，长4英寸，外径/内径1/0.58（mm）	World Precision Instruments	1B100-4 World Precision Instruments	用于制作穿刺待消融卵裂球的针头。
玻璃表面皿，直径300 mm	Electron Microscopy Sciences	70543-30 Electron Microscopy Sciences	用于从麻醉雌体的育卵囊中取出胚胎。
Instant Ocean人工海水（ASW）	Instant Ocean	IS160 Aquatic EcoSystems	将盐溶解于去离子水中，配制盐度为1.022–1.024的人工海水。
Instant Ocean过滤人工海水（FASW）	Instant Ocean	IS160 Aquatic EcoSystems	使用0.2 µm滤器对ASW进行灭菌。根据需要配制小量（< 250 ml）使用。
Kimwipes吸水纸	Kimberly-Clark	21905-026 VWR	用于安全折断为收集交配个体而改装的巴斯德吸管的精细末端。
口吸管连接适配器	Drummond Labware	A5177-5EA Sigma Aldrich	将拉制精细的巴斯德吸管尖端插入此端，用于在消融过程中吸除挤出的细胞内容物。
口吸管用软管	Aldrich	Z280356 Sigma Aldrich	剪成适当长度，以便在消融操作期间舒适地挂在颈部。
拉针仪	Sutter Instrument Company	P97 Sutter Instrument Company	用于从玻璃毛细管拉制穿刺待消融卵裂球的针头。
青霉素-链霉素溶液	Mediatech	45000-650 VWR	加入FASW中，使青霉素终浓度为100单位/ml，链霉素终浓度为100 mg/ml，并用此溶液培养单卵裂球消融后的胚胎。
橡胶吸球	Electron Microscopy Sciences	100488-418 VWR	配合巴斯德吸管使用，用于在培养皿之间转移胚胎。
Sylgard 184	K. R. Anderson, Inc.	NC9659604 Fisher Scientific	按制造商说明配制。倒入3 cm培养皿中，形成2–5 mm厚的涂层，作为卵裂球消融的操作表面。
钨丝，直径0.004英寸	A-M Systems	719000 A-M Systems	用于制作从麻醉雌体育卵囊中取出胚胎的工具。