本文提供了k空间图像相关光谱法（k-Space Image Correlation Spectroscopy, kICS）这一涨落分析技术的逐步操作指南，用于测量活体哺乳动物细胞中荧光标记的质膜蛋白的扩散系数。
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本文内容
摘要
摘要
细胞对质膜蛋白的侧向扩散和区室化具有严格的调控，因此对这些过程的研究将揭示质膜蛋白功能与调控的新见解。近年来，k空间图像相关光谱法（k-Space Image Correlation Spectroscopy, kICS）1 被开发出来，可直接从荧光标记的质膜蛋白显微图像中常规测量扩散系数，从而避免了探针光物理特性引入的系统性偏差。尽管该分析方法的理论基础较为复杂，但非专业人员也可通过免费提供的代码实现蛋白扩散系数的测量。kICS 方法首先对荧光显微图像序列中的每幅图像进行傅里叶变换，转换至倒易（k-）空间，再计算其时间相关函数。随后通过对相关函数进行圆周平均、自然对数变换以及线性拟合，即可获得扩散系数。本文提供了利用 kICS 进行图像分析及扩散系数测量的逐步操作指南。
首先，使用荧光显微镜获取标记有荧光的质膜蛋白的高帧率图像序列。然后，选择一个避开细胞内细胞器、移动囊泡或突出膜区域的兴趣区域（ROI）。将该ROI图像序列导入一个可免费获取的代码中，并为kICS分析设置若干指定参数（见方法部分）。程序随后从k空间时间相关函数生成一张"斜率的斜率"图，并根据该图的斜率计算扩散系数。以下是以绿色荧光蛋白EGFP标记的肾水通道蛋白aquaporin-3为典型示例，利用kICS方法测定膜蛋白扩散系数的逐步操作流程。
引言
质膜蛋白的四维时空组织结构及其侧向运动性受到严格调控，可能在蛋白质功能、活性以及蛋白质-蛋白质相互作用中发挥重要作用。传统上，质膜蛋白的侧向扩散是通过计算单个颗粒在量子点或染料标记的质膜蛋白时间序列成像中的扩散系数来研究的2-4。该方法需要在质膜蛋白上插入一个细胞外标签以便进行量子点或染料标记，这可能影响蛋白质的折叠和功能，因此某些蛋白质无法采用此方法。量子点的立体体积已被证明会减缓蛋白质的扩散速度5，此外，仅有极小部分的蛋白质被量子点标记，目前尚不清楚这部分标记的蛋白质是否能代表整个质膜蛋白群体。通过对量子点标记蛋白的时间序列图像进行单颗粒追踪（SPT）以测量扩散系数，涉及使用二维高斯拟合来定位图像中颗粒的峰值位置，并随后应用复杂的分析算法。该分析计算量极大，需要在时间序列的每一帧图像中进行大量非线性曲线拟合，以逼近显微镜的点扩散函数（通常为二维空间高斯函数），然后将颗粒位置连接成轨迹，从而描述单个分子的运动过程6,7。
一种新近开发的图像相关技术——k空间图像相关光谱法（k-Space Image Correlation Spectroscopy, kICS），能够相对简便地测量荧光标记的质膜蛋白的扩散系数。利用kICS常规计算荧光蛋白标记的膜蛋白扩散系数，是一项独特且具有多种优势的工具，相较于传统的量子点单颗粒追踪（SPT）分析，其优势包括：无需引入细胞外标签，也无需耗时的细胞外标记步骤（可直接使用表达荧光蛋白的细胞系）；扩散系数是从荧光蛋白的整体群体中提取，而非仅限于被量子点标记的亚群；分析过程简便，无需对单个蛋白进行追踪，且可使用现有代码完成分析，无需额外编程。该方法具有快速性，因其为一种基于平均值的技术，可实现快速计算和扩散系数测定。这种针对蛋白群体的快速扩散测量，可与通过耗时的SPT方法获得的部分蛋白群体的更详细分子转运信息形成互补。
kICS 时间关联荧光显微镜图像序列，这些图像序列首先被转换到傅里叶空间，从而将由光物理效应引起的荧光波动与由分子运输引起的波动分离开来1。因此，kICS 能够在不受荧光染料复杂的光漂白或闪烁干扰的情况下，测定荧光标记分子的数量密度、流动速度和扩散系数。这使得 kICS 成为快速确定荧光标记细胞膜蛋白扩散动力学的有力工具，且无需自行编写算法。除了荧光标记蛋白外，kICS 还可应用于量子点标记的膜蛋白8。
本文逐步介绍了如何使用kICS方法提取EGFP标记的质膜蛋白的扩散系数，演示了如何设置裁剪区域、如何运行代码以及如何评估生成的图表，从中可提取出扩散系数。作为示例，展示了采用转盘显微镜在半全内反射荧光（TIRF）模式下获取的肾水通道蛋白水通道蛋白-3（AQP3）的数据，该蛋白标记有EGFP。
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方案
用于kICS分析的质膜上EGFP标记蛋白的获取，可在落射荧光显微镜、全内反射荧光（TIRF）装置或设置为采集目标膜图像的转盘共聚焦显微镜上进行。分析时需要知道相机像素尺寸以及图像帧之间的时间间隔。可用于分析的图像序列通常包含100至1,200帧，采集帧速率为4-30 Hz。在采集过程中，必须在整个成像期间保持质膜处于焦点位置，并选择荧光分布均匀的平坦膜区域的一部分进行观察。运动中的囊泡、突出的膜区域以及细胞器可在后续分析过程中被裁剪去除。应选择合适的采集时间，以避免细胞发生漂移或移动。
如需获取用于 MATLAB 的 kICS 代码脚本，请联系 Paul Wiseman（Paul.Wiseman@McGill.ca）。首次使用 kICS 代码时，打开 MATLAB ，点击“文件”，然后选择“设置路径”，再点击“添加并包含子文件夹”，找到计算机中存放 kICS 代码的文件夹。然后点击“确定”，保存并关闭。接下来请继续执行后续步骤中所述的图像区域分析。
1. 将感兴趣的图像序列作为 TIFF 图像栈导入图像分析程序
将文件保存为以下名称：stack1.tif。
- 在膜的平坦区域选择一个矩形兴趣区域（ROI），避开移动的细胞器和突出的膜区域。裁剪尺寸应足够大，以生成充分的统计量，获得良好的 k2 图谱。
- 裁剪该区域，并将裁剪结果作为 TIFF 文件保存到适当的文件夹中。如果来自同一视频的多个裁剪图像，应使用递增编号，例如“stack1crop.tif”、“stack1crop2.tif”、“stack1crop3.tif”。
- 进行 kICS 分析时，应将包含裁剪图像的文件夹放置在本地计算机上，而非服务器上。
2. 逐一将作物导入分析软件以执行分析
- 打开 MATLAB，在命令窗口中输入“icsgui”，然后按 ENTER 键。ICS GUI 是图像相关光谱学图形用户界面程序的可执行文件名。
- 在 ICS 图形用户界面中，点击“kICS”选项卡。分析窗口的截图如下所示 图1.
- 找到名为“MATLAB code”的文件夹，滚动至名为“Scripts”的文件，双击打开该文件。或者，右键单击该文件，选择“使用 MATLAB 打开”，或进入文件菜单，在 MATLAB 中选择“打开”并打开 Scripts 文件。该文件称为编辑器。
- 在编辑器中滚动至“加载 kICS 数据集”，然后将文件名和文件夹路径复制或输入到以 img = 开头的命令行中 例如 “C:\Users\Documents\AQP3dynamics\stack1crop.tif”。在文件夹路径下方的命令行中，设置要分析的帧数—— 例如 [1:500]。数据系列中所有连续视频应使用相同的设置。若后续帧中出现焦距漂移，则应将这些帧排除在分析之外。
- 在编辑器中点击“save”，然后点击“evaluate cell”。数据集现已加载到分析软件中。
- 在图形用户界面的 kICS 分析窗口中，输入分析设置：
- 取消勾选“T细胞”复选框。
- 输入要分析的时间滞后数。时间滞后数（τ）会影响扩散图，必须选择适当的值以确保扩散图呈线性。可先输入25，然后逐步减少，直到扩散图呈现线性。τ表示kICS分析中进行比较的时间滞后的数量，而一个时间滞后是指相邻两帧之间的时间间隔。应选择能够产生线性图的最小值。最大时间滞后数应以获得线性拟合为原则进行选择；若选择过大的值，将导致数据无法进行线性拟合。
- 输入最大 k 值2 值（见图1中的圆圈1） 图1），通常为20-50。一个良好的k2 散点图是一种包含多个数据点沿直线分布的图表。首先输入70，然后在评估k之后递减2 以及扩散图，选择数据点围绕直线聚集的最低值。k2 值是傅里叶空间中空间波矢k的幅度的平方。
最初应重复分析，直至确定最佳数值，然后对数据系列中的所有后续视频使用相同的设置，但需始终检查所选设置是否能与数据良好拟合：良好的 k2 图和线性扩散图。 - 点击“保存设置并继续”。
- 单击“是”以显示所有图表。
- 单击“加载图像序列”（见图2中的圆圈2） 图1），然后点击“workspace”。
- 选择“imgSerCrop”，然后点击“从工作区导入”。
- 输入成像系统的采集设置。在“像素大小”框中，输入图像堆栈采集时成像系统的投影像素大小。对于AQP3-EGFP，使用0.111。在“输入帧间时间（s）”框中，AQP3-EGFP使用0.1150。
- 点击“选择感兴趣区域”，输入“1”，点击确定并选择“使用整幅图像”。
- 点击“进行 kICS 分析”，然后点击“是”以执行“不可移动组分过滤”。结果将自动以图像形式打开。
- 最小化设置窗口、细胞信息窗口和光物理学窗口。在动力学窗口中，检查动力学图是否显示数据的线性拟合结果为一条具有负斜率的直线，表明数据点存在相关性，可假设为自由扩散。记录对应特定时间延迟和k的扩散系数2 设置（无需注明拟合的标准偏差）。k 中的数据点2 曲线必须在给定的时间滞后范围内聚集于该直线周围。
- 勾选“将打开的图表保存为图像”复选框，然后点击“将打开的图表保存为图像”以保存结果文件。将文件保存至 C:\Users\Documents\AQP3diffusion 下的新建文件夹中。点击“清除当前数据”，继续分析下一个裁剪区域。
3. 计算所得扩散系数的平均值以概览分析数据
- 在电子表格中输入每个 ROI 的单独扩散系数（务必记录相应的 τ 和 k2 值），并使用上述设定的作物名称。
- 使用电子表格程序计算平均扩散系数及其标准偏差。
- 采用 Kolmogorov-Smirnov 检验或学生 t 检验，在 5% 显著性水平下评估统计学差异。可对细胞间进行定量比较（例如处理组与未处理组）。
- 打开分析软件为每种作物生成的扩散曲线电子表格版本，对每种条件在每个时间滞后点的数据进行平均，生成新的平均扩散曲线，用于论文或报告展示。
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结果
为了获得可用于kICS分析的合适图像序列，可以使用不同的显微镜系统。可以从落射荧光显微镜、全内反射荧光显微镜（TIRF）或转盘共聚焦显微镜系统中获取图像序列进行分析。细胞膜应保持平坦，且无较大的移动性细胞器或移动的囊泡/物体干扰。本文展示了一组在转盘显微镜上采集的时间序列图像，该图像序列记录了活体MDCK细胞中EGFP标记的AQP3蛋白，成像聚焦于质膜，采集速率为9.2 Hz。聚焦位置位于基底（底部）质膜。该数据最近已发表于AJP Cell13。
图2A 显示了细胞的图像。比例尺为10 mm，示例的感兴趣区域（ROI）裁剪范围以矩形标出。在选择裁剪区域时，应选取细胞边缘处膜结构均匀且平坦的区域，以便仅观察到二维扩散现象。应避免包含细胞器、囊泡和膜突起；同时，为确保分析的准确性，时间序列成像过程中不得出现漂移。不符合分析要求的裁剪示例见图2B 和图2C。运动的囊泡会对相关性产生影响（图2B），而膜上的孔洞（本例中略有移动）（
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讨论
本文详细地逐步介绍了如何应用kICS分析方法，从用荧光蛋白标记的蛋白质显微图像中确定扩散系数。该分析方法不依赖探针的选择，对标记密度具有很宽的动态范围，因此也可应用于用量子点、染料以及EGFP等荧光蛋白标记的蛋白质。
为了计算蛋白质的有效扩散系数，需要经过若干已优化的关键步骤。必须仅对膜上的标记蛋白质进行成像。如果图像序列中存在其他物体，例如移动的囊泡或细胞器，则这些物体会影响所计算的扩散系数，导致扩散系数被低估或高估。
按照上述步骤操作，kICS的图形用户界面代码具有良好的用户友好性，且分析过程快速。其中包含多个平均化步骤：包括圆形平均化以及作为时间延迟函数的斜率-斜率扩散图的斜率计算，这有助于快速生成扩散系数的平均值和具有统计学意义的数值。因此，与从单粒子追踪（SPT）实验中计算扩散系数所需的复杂分析相比，kICS操作简便、分析迅速，且无需生物物理学方面的专业培训即可完成。
如果分析结果得到负的扩散系数或水平的扩散图，应进行故障排查，包括目视检查所选区域是否满足此处描...
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
本工作获得了由LNN获得的伦德贝克青年研究组负责人奖学金的支持。PWW感谢加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC）提供的资助。我们还感谢南丹麦大学丹麦分子生物成像中心提供使用转盘显微镜的机会。
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材料
参考文献
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重印与许可
