本文提供了k空间图像相关光谱法（k-Space Image Correlation Spectroscopy, kICS）这一涨落分析技术的逐步操作指南，用于测量活体哺乳动物细胞中荧光标记的质膜蛋白的扩散系数。
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本文内容
摘要
摘要
细胞对质膜蛋白的侧向扩散和区室化具有严格的调控，因此对这些过程的研究将揭示质膜蛋白功能与调控的新见解。近年来，k空间图像相关光谱法（k-Space Image Correlation Spectroscopy, kICS）1 被开发出来，可直接从荧光标记的质膜蛋白显微图像中常规测量扩散系数，从而避免了探针光物理特性引入的系统性偏差。尽管该分析方法的理论基础较为复杂，但非专业人员也可通过免费提供的代码实现蛋白扩散系数的测量。kICS 方法首先对荧光显微图像序列中的每幅图像进行傅里叶变换，转换至倒易（k-）空间，再计算其时间相关函数。随后通过对相关函数进行圆周平均、自然对数变换以及线性拟合，即可获得扩散系数。本文提供了利用 kICS 进行图像分析及扩散系数测量的逐步操作指南。
首先，使用荧光显微镜获取标记有荧光的质膜蛋白的高帧率图像序列。然后，选择一个避开细胞内细胞器、移动囊泡或突出膜区域的兴趣区域（ROI）。将该ROI图像序列导入一个可免费获取的代码中，并为kICS分析设置若干指定参数（见方法部分）。程序随后从k空间时间相关函数生成一张"斜率的斜率"图，并根据该图的斜率计算扩散系数。以下是以绿色荧光蛋白EGFP标记的肾水通道蛋白aquaporin-3为典型示例，利用kICS方法测定膜蛋白扩散系数的逐步操作流程。
引言
质膜蛋白的四维时空组织结构及其侧向运动性受到严格调控，可能在蛋白质功能、活性以及蛋白质-蛋白质相互作用中发挥重要作用。传统上，质膜蛋白的侧向扩散是通过计算单个颗粒在量子点或染料标记的质膜蛋白时间序列成像中的扩散系数来研究的2-4。该方法需要在质膜蛋白上插入一个细胞外标签以便进行量子点或染料标记，这可能影响蛋白质的折叠和功能，因此某些蛋白质无法采用此方法。量子点的立体体积已被证明会减缓蛋白质的扩散速度5，此外，仅有极小部分的蛋白质被量子点标记，目前尚不清楚这部分标记的蛋白质是否能代表整个质膜蛋白群体。通过对量子点标记蛋白的时间序列图像进行单颗粒追踪（SPT）以测量扩散系数，涉及使用二维高斯拟合来定位图像中颗粒的峰值位置，并随后应用复杂的分析算法。该分析计算量极大，需要在时间序列的每一帧图像中进行大量非线性曲线拟合，以逼近显微镜的点扩散函数（通常为二维空间高斯函数），然后将颗粒位置连接成轨迹，从而描述单个分子的运动过程6,7。
一种新近开发的图像相关技术——k空间图像相关光谱法（k-Space Image Correlation Spectroscopy, kICS），能够相对简便地测量荧光标记的质膜蛋白的扩散系数。利用kICS常规计算荧光蛋白标记的膜蛋白扩散系数，是一项独特且具有多种优势的工具，相较于传统的量子点单颗粒追踪（SPT）分析，其优势包括：无需引入细胞外标签，也无需耗时的细胞外标记步骤（可直接使用表达荧....
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方案
用于kICS分析的质膜上EGFP标记蛋白的获取，可在落射荧光显微镜、全内反射荧光（TIRF）装置或设置为采集目标膜图像的转盘共聚焦显微镜上进行。分析时需要知道相机像素尺寸以及图像帧之间的时间间隔。可用于分析的图像序列通常包含100至1,200帧，采集帧速率为4-30 Hz。在采集过程中，必须在整个成像期间保持质膜处于焦点位置，并选择荧光分布均匀的平坦膜区域的一部分进行观察。运动中的囊泡、突出的膜区域以及细胞器可在后续分析过程中被裁剪去除。应选择合适的采集时间，以避免细胞发生漂移或移动。
如需获取用于 MATLAB 的 kICS 代码脚本，请联系 Paul Wiseman（Paul.Wiseman@McGill.ca）。首次使用 kICS 代码时，打开 MATLAB ，点击“文件”，然后选择“设置路径”，再点击“添加并包含子文件夹”，找到计算机中存放 kICS 代码的文件夹。然后点击“确定”，保存并关闭。接下来请继续执行后续步骤中所述的图像区域分析。
1. 将感兴趣的图像序列作为 TIFF 图像栈导入图像分析程序
将文件保存为以下名称：stack1.tif。
- 在膜的平坦区域选择一个矩形兴趣区域（ROI），避开移动的细胞器和突出的膜区域。裁剪尺寸应足够大，以生成充分的统计量，获得良好的 k2 图谱。 <....
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结果
为了获得可用于kICS分析的合适图像序列，可以使用不同的显微镜系统。可以从落射荧光显微镜、全内反射荧光显微镜（TIRF）或转盘共聚焦显微镜系统中获取图像序列进行分析。细胞膜应保持平坦，且无较大的移动性细胞器或移动的囊泡/物体干扰。本文展示了一组在转盘显微镜上采集的时间序列图像，该图像序列记录了活体MDCK细胞中EGFP标记的AQP3蛋白，成像聚焦于质膜，采集速率为9.2 Hz。聚焦位置位于基底（底部）质膜。该数据最近已发表于AJP Cell13。
图2A 显示了细胞的图像。比例尺为10 mm，示例的感兴趣区域（ROI）裁剪范围以矩形标出。在选择裁剪区域时，应选取细胞边缘处膜结构均匀且平坦的区域，以便仅观察到二维扩散现象。应避免包含细胞器、囊泡和膜突起；同时，为确保分析的准确性，时间序列成像过程中不得出现漂移。不符合分析要求的裁剪示例见图2B 和图2C。运动的囊泡会对相关性产生影响（图2B），而膜上的孔洞（本例中略有移动）（
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讨论
本文详细地逐步介绍了如何应用kICS分析方法，从用荧光蛋白标记的蛋白质显微图像中确定扩散系数。该分析方法不依赖探针的选择，对标记密度具有很宽的动态范围，因此也可应用于用量子点、染料以及EGFP等荧光蛋白标记的蛋白质。
为了计算蛋白质的有效扩散系数，需要经过若干已优化的关键步骤。必须仅对膜上的标记蛋白质进行成像。如果图像序列中存在其他物体，例如移动的囊泡或细胞器，则这些物体会影响所计算的扩散系数，导致扩散系数被低估或高估。
按照上述步骤操作，kICS的图形用户界面代码具有良好的用户友好性，且分析过程快速。其中包含多个平均化步骤：包括圆形平均化以及作为时间延迟函数的斜率-斜率扩散图的斜率计算，这有助于快速生成扩散系数的平均值和具有统计学意义的数值。因此，与从单粒子追踪（SPT）实验中计算扩散系数所需的复杂分析相比，kICS操作简便、分析迅速，且无需生物物理学方面的专业培训即可完成。
如果分析结果得到负的扩散系数或水平的扩散图，应进行故障排查，包括目视检查所选区域是否满足此处描.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
本工作获得了由LNN获得的伦德贝克青年研究组负责人奖学金的支持。PWW感谢加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC）提供的资助。我们还感谢南丹麦大学丹麦分子生物成像中心提供使用转盘显微镜的机会。
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材料
参考文献
- Kolin, D. L., Ronis, D., Wiseman, P. W. k-Space image correlation spectroscopy: A method for accurate transport measurements independent of fluorophore photophysics. Biophysical Journal. 91, 3061-3075 (2006).
- Saxton, M. J., Jacobson, K.
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重印与许可
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