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利用反向酵母双杂交系统鉴定与配体和/或拮抗剂相互作用的哺乳动物核受体残基

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DOI：

10.3791/51085

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2013年11月15日

 ,  ,  , 
1Department of Genetics, Albert Einstein College of Medicine , 2Shanghai Key Laboratory of Complex Prescription and MOE Key Laboratory for Standardization of Chinese Medicines, Institute of Chinese Materia Medica, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

酮康唑可结合并拮抗妊娠X受体（PXR）的活化。通过酵母高通量筛选PXR突变体，确定了酮康唑结合的独特区域。这种基于酵母的遗传学方法可发现核受体与配体之间的新型相互作用，这些配体结合于受体表面的结合位点。

摘要

作为药物代谢和炎症的关键调节因子，妊娠X受体（Pregnane X Receptor, PXR）在连接代谢与炎症的疾病病理生理过程中发挥重要作用（例如 肝脂肪变性）1,2。目前在PXR激动剂配体的鉴定方面已取得诸多进展，然而关于具有药物特性的拮抗剂及其在PXR上的结合位点的描述仍十分有限3,4,5。一个关键障碍在于难以高效纯化全长PXR蛋白以进行拮抗剂的结构研究，尽管PXR早在1998年就已被克隆和表征。本实验室开发了一种基于酵母的新型高通量双杂交检测方法，用于确定拮抗剂酮康唑（ketoconazole）在PXR上的结合残基6。该方法通过构建突变文库，筛选能够挽救位于PXR AF-2表面单个突变（预期与酮康唑相互作用）效应的二次突变。通过引入“功能获得性”二次突变"gain-of-function"，可合理推断酮康唑与PXR表面残基之间的遗传相互作用。因此，我们建立了一种针对PXR突变体与其共激活因子SRC-1相互作用的高通量酵母双杂交筛选方法。通过该方法，并对酵母系统进行改造以适应抗真菌药物酮康唑的研究，我们能够鉴定出在无法与酮康唑结合的克隆中富集的PXR特异性突变。通过逆向逻辑分析，我们推断原始残基即为与酮康唑直接相互作用的位点。该检测方法代表了一种新颖且可行的遗传学手段，可用于筛选核受体表面的拮抗剂结合位点。该方法可适用于任何药物，无论其对酵母是否具有细胞毒性，也可用于无法通过常规结构生物学或基于蛋白质组学方法研究的细胞蛋白。潜在局限性包括数据解读（建议结合互补方法）、对单一酵母双杂交技术的依赖、操作酵母或执行酵母双杂交实验所需的专业技能，以及实验条件的优化。

引言

酵母双杂交（Y2H）实验被广泛用于发现蛋白质-蛋白质相互作用，近年来也被用于筛选可破坏蛋白质-蛋白质相互作用复合物的新型小分子 7, 8, 9, 10, 11然而，该检测的传统方法在药物发现中的应用 "命中数"，无法检测蛋白质-蛋白质相互作用界面上化学化合物的变构相互作用残基，这些残基在发生改变后仍能保持相互作用，并允许对已改变的残基进行分析11的确，如果能够开发出此类方法，将可建立一个易于操作的酵母系统，用于高通量评估对蛋白-蛋白相互作用破坏至关重要的变构相互作用残基。在药物发现背景下，确定化合物与蛋白质相互作用的最直接方法是通过结构解析例如 蛋白质-抑制剂复合物的结晶）。这些方法繁琐，需要复杂的资源，且在技术上难以对每一种蛋白质都进行结构研究。

在细菌1, 2及其他模式系统（如哺乳动物双杂交系统）中已建立可操作的遗传学药物筛选体系。然而，这些系统仍需优化，而像酵母双杂交（Y2H）这样的替代系统在药物发现中仍是应用最广泛的。现有方法存在诸多局限性，例如单一方法在检测相互作用时敏感性和可靠性较差13；不过，单个Y2H实验可通过改造用于探究特定相互作用残基的问题。在核受体研究领域，Y2H已被用于鉴定相互作用蛋白14，但这些蛋白相互作用极少被用于阐明配体/拮抗剂与核受体-蛋白复合物之间相互作用的性质。因此，本实验室致力于开发一种方法，特别适用于那些难以通过蛋白质组学方法研究的受体蛋白，利用反向Y2H发现平台挖掘新的配体/拮抗剂相互作用残基。

基于我们先前发现的酮康唑可破坏PXR及其激活因子SRC-1的相互作用，我们开发了一种新型的反向酵母双杂交（Y2H）系统，可用于鉴定并研究与酮康唑相互作用的PXR残基6。该方法基于酵母GAL4蛋白的特性，该蛋白具有可分离的DNA结合结构域和转录激活结构域。PXR的配体结合结构域（LBD）蛋白以与LexA DNA结合结构域（DNA-BD）融合的形式表达，而全长共激活因子SRC-1（类固醇受体共激活因子1）蛋白则以与GAL4激活结构域（AD）融合的形式表达。PXR与SRC-1融合蛋白之间的相互作用可激活含有GAL4结合位点的报告基因β-LacZ的转录，该报告基因已整合至酵母基因组中。酮康唑作为PXR拮抗剂，可破坏PXR与SRC-1之间的相互作用15, 16, 17，我们可通过在滤膜上对菌落进行X-gal染色，检测在有或无酮康唑存在条件下PXR与SRC-1的相互作用情况。Y2H的原理见图1，实验流程总结于图2。

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方案

1. 在酵母载体中构建PXR和SRC-1融合蛋白

  1. 人PXR配体结合结构域（107-434氨基酸）及人SRC-1全长（1-1401氨基酸）的PCR扩增
    1. 使用 pSG5-hPXR 质粒8 以PXR LBD为模板，使用pCMX-SRC1质粒作为SRC-1的模板。
    2. 解冻PCR SuperMix、DNA模板和引物（见材料部分），并置于冰上保存。
    3. 加入0.25 μ克/μl DNA 模板 1 μl，10 mM 引物对 2 μ每份 45 微升，PCR SuperMix μl 并加入 H2O 以总体积补至 50 μl.
    4. 设置PCR程序为94℃一个循环 °C，2 分钟，20 个循环：94 °C，30 秒，55 °30 秒，37°C 和 72 °C 2分钟，然后一个72 °10 分钟，C 用于延伸。通过1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。
  2. 将PCR产物克隆至Y2H载体
    1. 从1%琼脂糖凝胶中纯化PCR产物。用BamHI和SalI酶切PXR、LBD、PCR和Y2H载体pSH2-1；用NotI酶切SRC-1 PCR和Y2H载体pGADNOTΙ 和 SalΙ。为此，加入1 μ基因组 DNA，3 μl 10x 反应缓冲液，1 μ限制性内切酶，最后是 H2O 以总体积调至 30 μl.
    2. 将消化样品置于37 °在37°C水浴中孵育1小时。通过1%琼脂糖凝胶电泳检测消化情况。
    3. 从1%琼脂糖凝胶中纯化消化产物，将消化后的PCR产物与Y2H载体连接，并转化至DH5α中α 感受态细胞
    4. 挑取菌落并分离质粒DNA。
  3. 通过BamHI/SalI酶切鉴定pSH2-1-PXR质粒DNA，通过NotI/SalI酶切鉴定pGADNOT-SRC-1质粒DNA。所有阳性质粒DNA均需通过测序验证。

2. 酵母双杂交实验

  1. 将酵母菌株接种至5 ml YPAD培养基中，于30℃以恒定振荡（220 rpm）过夜培养。 °C）。注意：该 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） 菌株为 CTY10-5d（MATa ade2 trp1-901 leu2-3,112 his3-200 ga l4-gal80- URA3::lexA-lacZ) 含有一个整合的 GAL1-lacZ 基因与 lexA 操作员10为了获得对酮康唑具有抗性但不携带转运蛋白改变作为唑类抗性原因的可存活酵母细胞18-20，通过首先敲除CTY10-5d酵母菌株中的基因，获得了新的菌株 ERG3（erg3Δ）然后引入额外的缺失 ERG11（erg3Δ/erg11Δ)基因通过同源重组。构建细节已在先前发表的论文中描述6 .
  2. 第二天（早晨），将酵母以1:20的比例接种于5 ml YAPD培养基中，培养至获得所需OD值600 ~0.2，通过持续振荡（30℃下220 rpm） °C）。
  3. 在微型离心机中以2,000 rpm离心2分钟，使细胞成团，弃上清液。随后用灭菌水洗涤沉淀两次，再用0.1 M LiAc洗涤一次。
  4. 最后一次洗涤后，弃去上清液，并向细胞沉淀中加入以下试剂：240 μl PEG 3500 50% w/v，36 μ1 M LiAc, 50 μl 2 mg/ml 煮沸的鲑鱼精子单链DNA，H2O 34 μl. 涡旋混匀，加入1 μg pSH-PXR 和 1 μg pGADNOT-SRC-1 DNA 并混合。
  5. 将混合物转移至聚苯乙烯圆底管中，振荡转化混合物（30℃、220 rpm） °C）孵育30分钟。将离心管转移至42℃ °C水浴中继续孵育30分钟。
  6. 以 2,000 rpm 离心 2 分钟，弃上清液。用灭菌水洗涤沉淀一次。
  7. 移液100 μ将1毫升无菌水加入试管中，轻轻弹击管壁并用移液器吹打重悬细胞，然后接种至-His/-Leu缺陷培养基平板上（每升-His/-Leu缺陷培养基配方：20 g葡萄糖，1.7 g YNB，0.67 g CSM-His/-Leu，5 g硫酸铵，1.5%琼脂），于30 ℃培养 °在3-4天内于C条件下培养以分离转化子。

3. X-gal 滤膜检测

  1. 将硝酸纤维素膜裁剪成与培养皿部分区域大小相匹配的尺寸。在硝酸纤维素膜上做标记以标明方向。
  2. 将预先标记的硝酸纤维素膜放置于酵母菌落上，确保膜与培养基表面充分接触。
  3. 将膜取出，菌落面朝上置于一张3 mm滤纸上，然后将膜和滤纸一同放置于-80 °15 分钟，4 ℃
  4. 配制 X-gal 溶液。加入 50 μl 20 mg/ml X-gal 和 15 μl β-巯基乙醇加入 5 ml Z 缓冲液中（1 L 缓冲液含 16.1 g Na2HPO47H2O，5.5 g NaH2PO4 H2O，0.75 g KCl，0.25 g MgSO4•7H2O）。如果Z缓冲液保持在4 °C，在加入这些试剂之前，需将其恢复至室温。
  5. 在培养皿中放置两片直径为3 mm的滤纸，并用5 ml X-gal溶液浸润。倒掉培养皿中多余的缓冲液，将硝酸纤维素膜菌落面朝上放置于滤纸上。
  6. 关闭盖子，确保膜与滤纸完全接触且充分润湿。用铝箔包裹培养皿，在37℃孵育 °30分钟至过夜，温度为C。

4. 液体β-半乳糖苷酶检测

  1. 在-His/-Leu缺陷型液体培养基中培养酵母至OD600为0.7。
  2. 将1 ml培养基转移至1.5 ml微量离心管中，以3,000 rpm离心2分钟，弃去上清液。
  3. 加入1 ml Z缓冲液重悬沉淀，再次以3,000 rpm离心2分钟，弃去上清液。
  4. 加入150 μl含2ME的Z缓冲液重悬细胞沉淀，混匀后加入50 μl氯仿和20 μl 0.1% SDS。剧烈涡旋震荡样品15秒。
  5. 加入700 μl ONPG溶液（1 mg/ml溶于Z缓冲液）。启动计时器，在30 °C孵育足够时间以使黄色显色，并记录总反应时间。
  6. 加入500 μl 1 M Na2CO3终止反应，测定420 nm处的吸光度。空白对照为700 μl ONPG溶液加500 μl 1 M Na2CO3。

按以下公式计算米勒单位：米勒单位 = (Å420 × 1,000) / (Å600 × 分钟 × 毫升)

Å420：420 纳米处的吸光度单位；Å600：600 纳米处的吸光度单位；min：反应时间（分钟）； ml：反应体积（ml）

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结果

我们进行了一项检测，以观察是否能够检测到PXR与类固醇受体共激活因子-1（SRC-1）相互作用的比色读数。由于酵母具有显著的甾醇合成能力，先前已有研究表明，酵母中的lacZ表达可在无需额外外源性配体的情况下被诱导。我们发现，在转入PXR和SRC-1的酵母菌株中，lacZ表达（蓝色菌落）也被诱导；然而，在仅转入空载体、单独PXR或单独SRC-1的酵母中，未出现LacZ表达的诱导（白色菌落）（图3）。为了确定酮康唑（25 μM）是否在酵母中破坏PXR与SRC-1的相互作用，我们将含有酮康唑的复制平板用硝酸纤维素膜浸泡，并进行了X-gal滤膜提升实验以及β-半乳糖苷酶液体活性检测。结果显示，酮康唑可破坏酵母中PXR与SRC-1的相互作用，因为复制滤膜上的所有菌落均变为白色（液体酶学检测也显示β-半乳糖苷酶活性显著降低）（图4A）。我们此前在哺乳动物系统检测中已证明，PXR突变体（T248E/K277Q）可被强效配体（例如 利福平）激活，但对酮康唑的拮抗作用具有抗性17。类似地，当我们在酵母质粒中构建PXR双突变体（...

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讨论

在我们改进的酵母双杂交实验中，已鉴定出PXR上对酮康唑相互作用至关重要的残基6。由于SRC-1是一种共激活因子（并被克隆至pGADNot载体中），我们还检测了当SRC-1被克隆到pSH载体系统中时是否仍能激活lacZ表达，以及这是否会改变激活谱和/或影响酵母双杂交实验的本底表达水平。利用重新设计的质粒，我们在erg3Δ/erg11Δ酵母菌株中进行了双杂交实验。与之前结果一致，我们发现转入PXR和SRC-1的erg3Δ/erg11Δ酵母菌株中lacZ表达（蓝色菌落）同样被诱导；然而，在仅转入空载体、单独PXR或单独SRC-1的酵母中未观察到LacZ表达的诱导（白色菌落，数据未显示）。我们的方法为分离那些难以通过传统结构生物学和/或蛋白质组学方法研究的蛋白质的变构配体-蛋白质相互作用相关残基，提供了一种强大而新颖的技术途径5,21。

所述方案存在若干必须注意的缺陷。首先，检测的灵敏度，特别是对蛋白质-蛋白质相互作用残基上部分拮抗效应的检测，可能会限制该检测方法的分辨率。比...

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披露

未声明任何利益冲突。

致谢

本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 CA127231 以及 Damon Runyon 基金会临床研究员奖（CI 1502）（授予 S.M）支持。我们感谢捷克共和国帕拉茨基大学奥洛穆茨分校的 Zdenek Dvorak 教授，他在讨论将本技术转移至其机构以及实验方案标准化方面提供了有益的见解。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
酵母菌株 CTY10-5d erg3Δ/erg11Δ我们的实验室CTY10-5d 酵母菌株进行了双基因敲除 ERG3 和 ERG11 (erg3Δ/erg11Δ基因6 .
YPD培养基BD 生物科学630409
Difco 酵母氮源基础培养基（YNB），不含氨基酸和硫酸铵BD 生物科学233520
Bacto 琼脂BD 生物科学214010
CSM-His/-Leu 完全补充剂混合物MP Biomedicals4250-412
ONPG（邻硝基苯基-β-半乳糖苷） Β-D-半乳吡喃糖苷)Sigma-AldrichN1127
2-巯基乙醇Sigma-AldrichM6250
Luria肉汤（LB）Sigma-AldrichL3022
X-GalFisherBP-1615
超声处理的鲑鱼精子DNA煮沸（10 mg/ml）Life Technology156-017
氨苄青霉素Acros Organics61177
酮康唑Sigma-AldrichK1003
N,N-二甲基甲酰胺Acros Organics326871000
乙酸锂Sigma-AldrichL4158
50% PEG-3350 溶液，滤膜除菌Sigma-AldrichP-3640
硝酸纤维素膜Whatman10402091
10 cm 培养皿Fisher875712
5'-ACCGGATCCCGATGAAGA AGGAGATGATCATGTCC-3'我们的实验室PXR LBD 用于 pSH2-1 的正向引物
5'-AGAGTCGACTCAGCTACCTGTGATGCC-3'我们的实验室PXR LBD 反向引物（用于 pSH2-1）
5'-TATAGC GGCCGCATGAGTG GCCTCGGGGACAGTTCATCC -3'我们的实验室SRC-1 用于 pGADNOT 的正向引物
5'-GCGGTCGACTTATTCAGTCA GTAGCTG -3'我们的实验室pGADNOT 的 SRC-1 反向引物
Platinum PCR SupermixInvitrogen11306-016
BamHI我们的实验室R0136
SalI我们的实验室R0138
NotI我们的实验室R0189

参考文献

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