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优化的负染色法：一种高通量电镜检测小分子及非对称蛋白结构的实验方案

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DOI：

10.3791/51087

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2014年8月15日

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1Lawrence Berkeley National Laboratory, The Molecular Foundry

本文内容

摘要

超过一半的蛋白质是小分子蛋白质（分子质量 <200 kDa），这类蛋白质在电子显微镜成像和三维重构方面均具有挑战性。优化的负染色法是一种可靠且高通量的方案，可在不同生理条件下获得小分子非对称蛋白质或复合物的高对比度和相对高分辨率（约 1 nm）图像。

摘要

对于分子质量在 40 - 200 kDa 之间的蛋白质而言，其结构测定具有较大挑战性。考虑到超过一半的天然蛋白质分子质量处于 40 - 200 kDa 范围内1,2，因此迫切需要一种具有纳米级分辨率的稳健且高通量的方法。负染色（NS）电子显微镜（EM）是一种简便、快速且定性的技术，常被研究实验室用于分析蛋白质结构及蛋白质-蛋白质相互作用。然而，传统的负染色（NS）制样方法常常在蛋白质上产生结构假象，尤其是脂蛋白，通常会形成呈叠钱状的假象。通过以冷冻电子显微镜（cryo-EM）获得的脂蛋白图像作为标准，近期已对负染样品制备中的关键参数进行了筛选，并报道了一种优化的负染色（OpNS）方案，即一种改良的传统负染色方法3。OpNS 可显著减少叠钱状等假象的产生，同时为小分子且不对称的蛋白质提供高对比度和相对高分辨率（接近 1 nm）的图像。这些高分辨率和高对比度的图像甚至适用于单个蛋白质（单个对象，无需平均）的三维重构，例如通过电子断层扫描技术对 160 kDa 的抗体进行三维重建4,5。此外，OpNS 还可作为一种高通量工具，用于检测数百个小蛋白质样品。例如，先前发表的 53 kDa 胆固醇酯转移蛋白（CETP）的作用机制研究就涉及对数百个样品的筛选与成像6。考虑到 cryo-EM 很少能成功对小于 200 kDa 的蛋白质进行成像，且尚未发表任何涉及上百种样品条件筛选的研究，因此将 OpNS 称为研究小蛋白质的高通量方法是合理的。希望本文所介绍的 OpNS 协议能够成为推动电子显微镜技术边界、加速小蛋白质结构、动态行为及作用机制研究的有力工具。

引言

理解蛋白质功能需要了解其结构。对于分子质量在 40 - 200 kDa 范围内的蛋白质，结构测定具有挑战性。X 射线晶体学受限于蛋白质结晶的难度；核磁共振（NMR）波谱技术仅适用于分子质量小于 40 kDa 的蛋白质，而冷冻电子显微镜（cryo-EM）在小分子蛋白质（分子质量小于 200 kDa）的图像采集和三维（3D）重构方面也存在困难。值得注意的是，超过 50% 的蛋白质分子质量处于 40 - 200 kDa 范围内1,2，由于现有方法在研究此类尺寸蛋白质时面临挑战，因此亟需开发新方法。

尽管大多数透射电子显微镜（TEM）能够达到原子级分辨率，即优于3 Å的分辨率，但从生物样品中获得接近纳米级分辨率的结构仍然相当困难7。辐射损伤、对比度低、结构偏差以及脱水等假象均会阻碍高分辨率TEM成像3,8。

在各种透射电子显微镜（TEM）方法中，冷冻电镜（cryo-EM）是一种先进且前沿的技术，可在接近生理条件下解析高度对称的大分子复合物的原子分辨率结构9-12。冷冻电镜样品通过快速冷冻样品溶液制备，使大分子包埋于玻璃态冰中，随后在低温（如液氮或液氦温度）下进行成像13。冷冻电镜的优势在于样品无假象，结构接近天然状态8-12。然而，冷冻电镜也存在若干缺点：i) 需要安装或购置额外设备，以将标准TEM仪器升级为具备冷冻电镜功能，这些设备包括防污染装置、冷冻样品台、低剂量模式软件以及对低剂量敏感的CCD相机，尽管这些设备的价格远低于TEM仪器本身；ii) 冷冻电镜操作所需时间通常长于负染色（NS）操作。由于需克服更多技术难题，如液氮温度操作、样品充放电、成像漂移、温度梯度、低剂量模式运行、样品对辐射的敏感性及剂量限制等，因此检查冷冻电镜样品通常比负染色样品需要更长的制样和仪器操作时间。与负染色数据采集相比，这些额外步骤会减缓有效数据的获取速度，尽管经验丰富的冷冻电镜专家在仪器温度梯度平衡良好的情况下，仍可在1小时或更短时间内获得少量冷冻电镜图像；iii) 用户需要接受额外培训，包括液氮操作、冷冻电镜载网的制备、低剂量操作、剂量测量、应对样品充放电与漂移，以及图像处理相关知识；iv) 同一冷冻电镜样品在不同TEM使用时段难以实现可重复成像。在将样品装载或卸载至/自TEM仪器过程中，冷冻电镜样品极易因冰污染而受损，当样品难以分离或纯化时，这一问题尤为突出14；v) 小分子蛋白（<200 kDa 分子量）由于对比度低，成像具有挑战性；vi) 冷冻电镜图像的低对比度和高噪声会降低图像间的交叉相关性，从而降低蛋白质取向、构象和分类判定的整体准确性，尤其对于在溶液中结构灵活且天然存在动态波动的蛋白质更为显著4,5。

负染色（NS）是一种相对“古老”且具有历史意义的方法，任何配备任意类型电子显微镜的实验室均可利用该方法来观察蛋白质结构。Brenner 和 Horne 在半个世纪前首次提出了负染色的概念，用于病毒的观察15。负染色通过用带电的重金属盐包裹样品来实现。这一概念最初源于光学显微镜技术，即把细菌包埋在染色液中，使样品周围呈现暗色，从而在观察其负像时获得更高的图像对比度16。由于重金属离子比蛋白质中密度较低的原子具有更强的电子散射能力17-20，因此使用重金属染料包覆样品可提高剂量耐受性并增强对比度。与冷冻电镜（cryo-EM）所获得的图像相比，负染色样品能够提供高对比度图像8，更有利于颗粒取向的判定和三维结构重建。

传统的负染色法（NS）可能会因染料与蛋白质之间的相互作用而产生伪影，例如普遍的聚集、分子解离、压扁和堆叠8,21,22。对于脂质相关蛋白（如脂蛋白）16,23-30，一种常见的伪影表现为颗粒堆叠并紧密排列成串钱状结构（图1）31-36。许多脂蛋白研究，例如非变性聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳、冷冻电镜研究13,29,37-40、质谱分析39,41以及小角X射线衍射数据42，均表明脂蛋白颗粒在自然状态下是独立存在的，并不会自发堆叠形成串钱状结构21,29,30,35,42-45。传统负染色法中观察到的串钱状结构可能是由于脂蛋白（由载脂蛋白（apo）和磷脂组成）在溶液中具有结构灵活性13,29,30,46-49，以及对标准负染色流程的敏感性所导致的动态相互作用所致。为识别这一伪影，本研究采用载脂蛋白E4（apoE4）与棕榈酰-油酰磷脂酰胆碱（POPC）组成的高密度脂蛋白（HDL）样品作为测试样本，并以冷冻电镜图像作为无伪影的参照标准29，对在一系列不同条件下制备的负染样品进行筛选。通过比较负染色法与冷冻电镜所获得的颗粒大小和形态，发现染色试剂的种类和盐离子浓度是导致串钱状现象的两个关键参数。因此，研究人员提出了一种优化的负染色（OpNS）方案。

通过 OpNS，已知的 apoE4 HDL 的串钱状（rouleaux）现象被 OpNS 消除（图 2A）。统计分析表明，OpNS 所得图像在大小和形状上与冷冻电镜（cryo-EM）结果非常相似（偏差小于 5%），但消除了对比度。OpNS 的验证通过检测几乎所有脂蛋白样品类别或亚类中的串钱状伪影消除情况完成6,29,30,50,51，包括 apoA-I 7.8 nm（图 2B）、8.4 nm（图 2C）、9.6 nm 盘状重组高密度脂蛋白（rHDL）（图 2D）、9.3 nm 球形 rHDL（图 2E）、人血浆 HDL（图 2F）、无脂质的 apoA-I（图 2G）、血浆 HDL（图 2H）、低密度脂蛋白（LDL）（图 2I）、中等密度脂蛋白（IDL）（图 2J）、极低密度脂蛋白（VLDL）（图 2K）以及 POPC 脂质体（图 2L）30。进一步的验证通过成像小而不对称的蛋白质完成，包括 53 kDa 的胆固醇酯转移蛋白（CETP）（图 3A–C）6,29、高度柔性的 160 kDa IgG 抗体（图 4A 和 B）4,5,29,52，以及两种结构明确的蛋白质 GroEL 和蛋白酶体（图 2M 和 N）。若有同事需要进一步验证，我们愿意接受针对该 OpNS 方法的任何盲测检验。

OpNS 作为一种高通量实验方案，已被用于通过检测数百个小蛋白样品来研究蛋白质机制，例如在一系列条件下考察 CETP 与多种蛋白质的结合情况（包括 CETP 与四类脂蛋白——重组 HDL、血浆 HDL、LDL 和 VLDL 的相互作用，分别在有或无两种抗体 H300 和 N13 的情况下，设置 9 个孵育时间点：3 分钟、20 分钟、1 小时、2 小时、4 小时、8 小时、24 小时、48 小时和 72 小时，4 种摩尔比，即 i.e., 1:0.5、1:1、1:2、1:4，以及 3 种稀释浓度，即 i.e., 0.1 mg/ml、0.01 mg/ml 和 0.001 mg/ml），并增设额外的对照样品，包括单独的 CETP、单独的 LDL 和单独的 VLDL，上述每项实验均由不同人员重复三次6,29。CETP 的 OpNS 图像提供了高对比度且具有较精细结构细节的图像，使我们能够通过单颗粒重构方法成功重建出分子量为 53 kDa 的小蛋白 CETP 的三维密度图（图 3D - F）。此外，高对比度的 OpNS 图像为我们提供了来自单个蛋白质的足够信号（图 4A - C），从而能够利用单颗粒电子断层扫描（IPET）方法解析出单个（单一对象，无平均）IgG 抗体的中等分辨率（约 1.5 nm）三维结构（图 4E - J）5。IPET 重构策略、方法学、逐步操作流程及结构变异分析的详细描述此前已有报道4。一段关于 IPET 抗体重构过程的视频，包括原始图像、中间结果、三维密度图及结构对接，已上传至 YouTube 向公众开放5。对来自不同单个抗体颗粒的三维重构结果进行比较，可揭示蛋白质在化学反应过程中的动力学行为及构象变化4,5。

鉴于超过50%的蛋白质分子质量范围在40 - 200 kDa1,2，对这些小分子蛋白质成像的成功表明，OpNS方法是一种有效的工具，可将传统电镜技术的应用边界推进至小分子量且不对称结构的解析及机制发现。因此，详细实验方案如下所述。

方案

1. 制备1%（w/v）的新鲜负染液

  1. 在暗室或暗箱中，将 1 mg 甲酸铀酰（UF）粉末加入含有 100 ml 去离子水的玻璃瓶中。
  2. 在室温下于暗室/暗箱中过夜搅拌该溶液。用铝箔包裹溶液瓶，防止光线照射到溶液。
  3. 使用安装在 5 ml 注射器上的 0.2 μm（孔径）滤器轻轻过滤该溶液。将滤过的溶液收集至若干个用铝箔覆盖的 Falcon 管中。过滤用的注射器也必须用铝箔包裹，以避免光照。
  4. 使用安装在 1 ml 注射器上的 0.02 μm（孔径）滤器再次过滤该溶液。将滤过的溶液收集并分装至 2 ml 样品瓶中。使用前，注射器和样品瓶均需用铝箔覆盖。
  5. 过滤完成后，立即用长柄镊子将样品瓶浸入液氮容器中，快速冷冻分装好的样品瓶。
  6. 将冷冻后的样品瓶转移至 -80 °C 冰箱中保存，以备后续使用。

2. 负染工作站和孵育工作站的准备

  1. 将一管1% UF溶液置于室温水浴中解冻。确保试管外包裹的铝箔保持完整，以避免暴露于光线下。
  2. 溶液完全解冻后，使用包裹铝箔的1 ml注射器连接0.02 μm滤器进行过滤。将过滤后的溶液收集至新的、外裹铝箔的试管中，并置于冰盒盖内的冰上，避光保存待用。
  3. 通过手指将一段约8英寸长的Parafilm膜压在空蛋白结晶板表面，制备溶液板。可形成直径约5 mm的圆形液滴阵列，每行制备6个溶液板，并将Parafilm膜形成的液滴置于冰盒盖内压平的冰面上，作为染色工作区。
  4. 在每行左侧三个溶液板上各加入约35 μl去离子水，右侧三个溶液板上各加入约35 μl过滤后的UF溶液。在染色蛋白前，用盖子盖住染色工作区，避免光照。
  5. 准备透射电镜载网孵育站：取一个空盒，装入半盒冰，并将其固定在一个可安装于支撑底座上的挂架旁。将样品镊子置于挂架上，使镊子尖端靠近冰面，并用盒口边缘部分覆盖镊子尖端。推荐使用空的移液枪头盒作为理想的冰盒来构建孵育站。

3. OpNS 操作

  1. 将覆盖有薄碳膜的300目铜制电镜载网进行10秒的辉光放电处理。
  2. 用镊子夹取载网，并将镊子挂在孵育站内的支架上，使载网保持45°倾斜，且位于冰面以上约1英寸处。
  3. 用杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）稀释蛋白样品，终浓度约为0.01至0.005 mg/ml。稀释后立即取约4 μl稀释液滴加到电镜载网的碳膜面。（若蛋白对DPBS敏感，可更换为其他缓冲液）
  4. 将样品在孵育站内于电镜载网上孵育约1分钟。
  5. 用滤纸迅速接触载网边缘，去除多余溶液。
  6. 在去除载网上多余液体后，立即将载网快速接触Parafilm膜片上第一个纯水液滴（约35 μl）的液面，随后立即用滤纸吸除多余水分。
  7. 按照步骤3.6重复操作两次，依次用Parafilm膜片上剩余的两个水滴清洗电镜载网。（若样品对水极为敏感，可跳过步骤3.6和3.7）
  8. 在去除载网上多余水分后，立即将载网漂浮于第一滴UF溶液液面上，孵育10秒。确保在将载网放入UF溶液前，水洗步骤在3秒内完成。水洗时间越短，样品质量越好。
  9. 通过将镊子尖端插入滤纸约2至3次，清洁镊子。
  10. 用滤纸接触载网边缘去除多余溶液，然后将载网漂浮于第二滴UF溶液上。
  11. 在第二滴UF溶液上继续执行上述步骤3.10。
  12. 将载网漂浮于第三滴UF溶液上，并盖上染色室静置约1分钟。
  13. 可选步骤：按照3.6所述方法，将载网在水面上快速清洗一次。此额外步骤有助于减少含有过量游离金颗粒或背景染色过高的样品的干扰。
  14. 用滤纸接触载网背面（与碳膜面相对的一侧）以去除多余溶液，待溶液被滤纸吸收后，立即在室温下用温和的氮气流吹干载网。
  15. 将载网置于培养皿内的滤纸片上，将培养皿盖部分覆盖，于室温下干燥至少30分钟。对于某些样品，可将载网置于40 °C培养箱中烘烤1小时。
  16. 将载网存入电镜载网盒中，以备后续电镜观察使用。

4. 透射电子显微镜观察

  1. 在对载网上的小分子蛋白质进行电镜观察之前，应正确校准透射电子显微镜（TEM）。
    1. 通过检查可见的最高阶Thon环的分辨率来判断TEM是否已正确校准，该Thon环为非晶碳膜的功率谱。由于TEM由多位用户共用，常常未被正确校准。
    2. 仔细检查样品中碳膜区域的功率谱，以调整仪器的校准状态。可见的最高阶Thon环所对应的分辨率应优于目标分辨率。
      注：以在120 kV高压下运行的LaB6灯丝TEM为例，若能观察到超过20个Thon环，则表明其对应分辨率可优于5.0 Å。该Thon环是通过对非晶碳膜在约1.6 µm离焦度和20.4 e-/Ų剂量条件下成像后进行傅里叶变换获得的（图5）。
      注：观察到高分辨率Thon环是正确校准的必要条件，但并非充分条件。要真正获得高分辨率图像，还需考虑其他多个参数，如样品质量、辐射损伤、电荷积累与漂移，以及照明剂量率等。
  2. 将离焦量调回至接近Scherzer离焦状态，以便对理想染色区域的小分子蛋白质进行成像。
  3. 寻找“云雾状”区域进行成像。理想染色区域通常位于较厚染色区的边缘附近，在载网上呈现为“云雾状”外观，这是因为染色剂在碳膜载网上通常分布不均（图6）。一般先使用低倍率（<100x）观察，以快速定位这些云雾状区域，再放大进行高倍成像。

结果

OpNS 的应用包括对多种脂蛋白颗粒的结构与形态学检测，例如：新生重组高密度脂蛋白（rHDL）、球形重组高密度脂蛋白、血浆高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）、中密度脂蛋白（IDL）和极低密度脂蛋白（VLDL）（图 2）30；以及小分子蛋白质，如 53 kDa 的胆固醇酯转移蛋白（CETP）（目前通过电镜成功成像的最小蛋白质之一）（图 3）6，以及 160 kDa 的 IgG 抗体（最具动态性和异质性的蛋白质之一）（图 4）4,5,29,52，甚至无脂载脂蛋白 A-1（28 kDa）（图 2L），以及 GroEL 和蛋白酶体 （图 2M 和 N）。

OpNS 作为高通量方法的其他示例包括研究蛋白质-蛋白质相互作用以揭示蛋白质作用机制，例如 53 kDa 的 CETP。如引言中所述，通过检测超过 400 个电镜样本，研究了 CETP 与不同亚类脂蛋白的相互作用方式6。据我们所知，尚无涉及筛选近一百种不同条件的冷冻电镜研究案例。

OpNS 可扩展电子显微镜的成像边界，用于研究小尺寸且不对称的蛋白质三维结构，甚至可实现对单个蛋白质分子（无需平均处理）的三维结构解析。例如，IgG 抗体是一种分子量为 160 kDa 且具有高度柔性结构的分子，对其在中等分辨率下进行三维重构极具挑战性。OpNS 方法被用于从一系列倾斜角度对单个 IgG 抗体进行成像（图 4E 和H）。OpNS 获得的具有合理高分辨率和高对比度的蛋白质图像，使得通过单颗粒电子断层扫描技术（IPET）成功实现了对单个蛋白质的三维重构（图 4E–J）4,5。在 IPET 三维重构4中，目标抗体的二维倾斜系列图像通过迭代重建逐步与其计算得到的全局中心对齐，最终获得分辨率为 ~14.1 Å 的三维密度图（图 4F 和 G）4。采用相同方法，研究人员还重构了一个单个抗体-肽复合物，并发现了肽诱导的单个抗体颗粒内部结构域构象变化（图 4I 和 J，分辨率 ~16.6 Å）4,5。通过比较来自不同单个颗粒的三维重构结果，结构分析有望揭示蛋白质的热力学波动，甚至“捕捉”化学反应中间阶段的瞬时状态4,5,29,53,54。

综上所述，分子量在 40 kDa 至 200 kDa 之间的蛋白质对常规电镜结构分析与重构具有挑战性。鉴于超过 50% 的蛋白质分子量范围在 40 至 200 kDa1,2，我们报道了一种 OpNS 方法，作为一种稳健且高通量的工具，可将传统电镜的应用边界推进至小分子量及非对称结构的测定，甚至可用于机制研究。

通过电子显微镜观察脂蛋白形态；ApoE4 rHDL、ApoA-I rHDL、ApoB LDL、POPC。
图1. 采用常规负染色法（NS）电子显微镜观察脂蛋白时出现的串珠状伪影。电子显微照片（上排图板）及所选颗粒（下排图板）显示，在标准混合程序下使用磷钨酸（PTA）进行负染色后，多种脂蛋白均出现串珠状结构。（A） 含ApoE4的重组高密度脂蛋白（rHDL），（B） 含apoA-I的9.6 nm盘状rHDL，（C） 含apoB的血浆低密度脂蛋白（LDL），（D） 不含载脂蛋白的POPC脂质体。标尺：50 nm。窗口尺寸：A和C为20 nm；B为30 nm。该研究成果最初发表于《脂质研究杂志》29,30。请点击此处查看该图的放大版本。

载脂蛋白颗粒的电子显微镜比较；apoE4 rHDL、HDL、LDL、IDL、VLDL 示意图。
图 2. 通过优化负染色（OpNS）电镜观察蛋白质结构。 电镜图像显示了采用 OpNS 方法获得的各种脂蛋白和脂质体，均无缗钱状伪影。(A) 含 apoE4 的重组高密度脂蛋白（rHDL）；(B) 7.8 nm rHDL；(C) 8.4 nm rHDL；(D) 9.6 nm rHDL；(E) 9.3 nm 球形 rHDL；(F) 人血浆 α-HDL；(G) 血浆 HDL；(H) 人血浆 LDL；(I) 人血浆 IDL；(J) 人血浆 VLDL；(K) POPC 脂质体；(L) 无脂质的游离 apoA-I。额外验证使用了 (M) GroEL 和 (N) 蛋白酶体样本。上方为电镜图像，下方为选中的颗粒。标尺：50 nm。窗口尺寸：A–D，20 nm；E 和 F，25 nm；G，20 nm；H，25 nm；I，50 nm；J 和 K，100 nm；L，80 nm。除无脂质的游离 apoA-I、GroEL 和蛋白酶体外，本研究最初发表于《脂质研究杂志》29,30。请点击此处查看该图的放大版本。

Cryo-EM analysis diagrams of protein structure models and visualization, detailing structural fits.
图3. CETP的OpNS电子显微照片。（A） CETP（虚线圆圈）香蕉形颗粒的概览显微照片。 （B） 选择带窗口的原始颗粒。 (C) 三个单个原始CETP颗粒图像，清晰显示一个更大、更重且更粗大的球状末端，包含另一个较小、较轻且较细的末端（左图）；顶端视图显示相似的末端区域，整体弯曲度较小（中图）；沿CETP长轴方向的端面视图（右图）。 (D) 将晶体结构（PDB: 2OBD）叠加到这些原始的CETP颗粒图像上，其结构形状和结构域大小均高度匹配，表明即使不借助计算机辅助，也能近乎直接地确定其取向（对应图版至 (C)). (E) 无需参照的二维分类平均图像（an ab 从头开始 通过计算这些随机取向颗粒之间的相似性（互相关计算），将彼此间具有高相似性的颗粒进行归类、对齐，然后取平均值，以降低背景噪声并增强颗粒图像的对比度。无参考的二维分类平均图是通过以下步骤计算得出的 refine2D.py EMAN 软件包中的软件，该类平均过程中未引入任何人为主观构建的初始模型。参考类平均图可作为独立方法，用于验证单颗粒三维重构结果。 (F) 部分选定的无参考二维分类平均图像显示，一端的远端比另一端更大。 (G) 叠加的晶体结构（PDB: 2OBD）与无参考分类平均图像的比较显示，晶体结构与无参考分类平均图像在结构形状和结构域大小方面均近乎完美匹配（下层面板）。 (F) 分辨率13 Å的CETP三维密度图由OpNS成像的8,879个颗粒通过单颗粒重构方法获得（上图），并将晶体结构进行刚体对接至该单颗粒重构图中（下图）。单颗粒重构的详细信息，包括图像预处理、初始模型、 refinement 流程、角度分布以及傅里叶壳层相关系数（FSC），已在原始论文的方法部分及支持信息中发表。（H）单颗粒重构结果的最终比较（上图）与额外的PDB拟合比较（下图） 6比例尺：A，50 nm；B - D，10 nm；F，3 nm。这些图中的部分内容先前已发表于《自然·化学生物学》6. 请点击此处以查看此图的放大版本。

蛋白质结构分析；OpNS-EM、X射线成像、三维重建、分子可视化图。
图 4. 人 IgG1 抗体颗粒的 OpNS 图像与重建结果。(A) 人 IgG1 抗体 OpNS 图像概览。白色圆圈中的颗粒清晰显示出具有三个亚结构域的形态。(B) 五个单独未结合抗体颗粒的高分辨率原始图像，以及(C) 通过手动降低原始颗粒边缘周围噪声（不触及颗粒内部任何密度）获得的相应去噪图像，以便更清晰地观察。(D) IgG1 抗体的晶体结构（PDB 编号 1IGT），其取向与电镜图像视角相似。对比相应图像可见，电镜图像与晶体结构之间存在许多共同特征，包括结构域的位置和形状。(E) 利用单颗粒电子断层成像法（IPET）从单个 IgG1 抗体实例（无平均处理，仅单个独立对象）进行从头开始（ab initio）三维重建的逐步流程。(F) 单个抗体颗粒最终的三维重建结果，分辨率为 14.1 Å，显示三个环状结构域以“Y”形排列。(G) 将各结构域的晶体结构分别对接至对应的结构域密度图中，并手动重复结构域之间的环状区域。(H) 利用 IPET 方法对单个 IgG-肽复合物（无平均处理，仅单个独立对象）进行三维重建的逐步流程。(I) 单个 IgG 肽复合物的最终三维重建结果，分辨率为 16.6 Å，显示三个棒状结构域以“Y”形排列。(J) 将 IgG 抗体各结构域的晶体结构（PDB 编号：1IGT）分别对接至各棒状密度区域，结果显示匹配度较差，提示肽段结合后发生了内部结构域的构象变化。详细实验流程、分辨率分析及统计信息见原始文献5。标尺：A，50 nm；B - D，10 nm。本工作最初发表于 PLoS ONE4 和 Scientific Reports5。请点击此处查看该图的放大版本。

具有相应CTF强度与频率关系图的电子衍射环；显微分析。
图 5. 在 1.6 µm 离焦条件下，由 Zeiss Libra 120 LaB6 透射电子显微镜拍摄的非晶碳膜的功率谱。 高分辨率成像需要充分的证据来证明电子显微镜具备正确的合轴状态和高分辨率能力。在数据采集前，分析载网附近碳区域的功率谱是检查电子束相干性条件的一种有效方法。对非晶碳区域图像进行傅里叶变换可得到与仪器相关的对比度传递函数（CTF），即所谓的索恩环（Thon-rings）。可见索恩环的数量以及在相对较高离焦条件下可见索恩环所达到的最高分辨率，可以反映合轴状态和相干性的优劣。以配备 LaB6 灯丝的透射电子显微镜接近理想合轴状态为例，在 1.6 µm 离焦条件下使用 20.4 e-/Å2 剂量成像非晶碳膜时，可产生超过 ~20 个索恩环（约 5 Å）。低档透射电镜获得的索恩环情况与高档透射电镜（如在理想合轴条件下运行的场发射电子枪（FEG）增强型透射电镜）相似。本工作最初发表于《科学报告》5。请点击此处查看此图的放大版本。

在80倍、4000倍、80000倍下的材料显微镜比较，显示表面细节和结构。
图6. 用于OpNS成像的“理想”区域示例显微图像。 三种蛋白质样品，(A) GroEL (B) 蛋白酶体 (C) 球形HDL，被用作示例以展示适合OpNS成像的理想区域。由于染料在样品中分布不均，低倍镜下的样品通常呈现“云雾状”（最左侧面板）。理想的成像区域通常位于这些“云雾”的边界处。逐步放大一个“云雾状”染色区域的示例（左中面板），显示出高倍镜下颗粒的高分辨率和高对比度图像（右中面板）。所选颗粒图像展示了蛋白质的结构细节（最右面板）。标尺：30 nm。请点击此处查看该图的放大版本。

透射电镜载网染色示意图；包含孵育装置、镊子、吸水操作过程。
图7. OpNS 操作流程示意图。（A） 透射电镜载网孵育装置，用于在辉光放电处理后的载网上孵育样品溶液的简易装置。（B） 染色工作台，设计用于将水洗液滴和染液滴置于冰床上，并尽量减少染液暴露于光照。（C） 染色流程概览，展示：吸水方向、三次水洗、三次超滤染液处理、将样品载网倒置于染液液滴中进行染色孵育，以及最终对载网背面进行吸水处理，以确保在氮气干燥前形成一层薄薄的样品-染液层。请点击此处查看该图的高清版本。

冷冻电镜分析：低通滤波、冷冻正染色、加掩膜图像、蛋白质研究的晶体结构。
图 8. 通过改良的 OpNS 方法——冷冻正染色（cryo-PS）揭示的 53 kDa 小蛋白 CETP 的高分辨率图像。 选取五张高分辨率、呈圆形的软掩膜原始图像（反差反转）以及颗粒形状掩膜的原始颗粒图像（手动降低颗粒边缘周围噪声，但未修改颗粒内部任何密度信息），以便于观察。将全原子模型和带状晶体结构与掩膜后的原始颗粒图像进行比对，并将颗粒取向对齐至与电镜图像相似的方向。原始图像区域的高分辨率细节显示出与晶体结构具有一定相似性，但并非所有晶体结构特征均可在原始数据中分辨。值得注意的是，这些原始图像在两端均显示出相似性，且在手动降噪图像中可见邻近的小型圆形孔洞（三角形）；此外，颗粒图像中 C 端区域的链段与晶体结构中的 β-折叠片（箭头）互补；最后，CETP C 端区域突出的环状结构与晶体结构中的相应结构相似（菱形）。（A） 五张选取的高分辨率、圆形软掩膜原始 CETP 颗粒图像（反差反转）。（B） 低通滤波至 10 Å。（C） 更高程度的低通滤波至 20 Å。（D） 手动降低噪声后的掩膜图像。（E） 通过带状结构进行晶体结构比对。（F） 通过全原子表示进行晶体结构比对。标尺：5 nm。本研究部分内容已发表于《自然·化学生物学》6。请点击此处查看该图的放大版本。

不同盐浓度下磷钨酸胶束透射电镜分析；科学成像。
图9. 不同盐浓度下采用传统负染色法（PTA 染色）制备的脂质体电子显微镜图像，显示缗钱状结构的形成。(A) 高盐浓度（~0.5 M NaCl）。(B) 常规盐浓度（~0.25 M NaCl）。(C) 低盐浓度（~0.1 M NaCl）。(D) 纯水。上方为显微图像，下方为选定区域的局部粒子图像。标尺：100 nm。窗口大小：80 nm。该研究工作最初发表于《脂质研究杂志》30。请点击此处查看该图的高清版本。

讨论

与传统的NS技术相比，OpNS可避免缗钱状伪影（图1 和 9)，可提供小分子蛋白质可靠且合理的高分辨率（约1纳米）结构细节图2与冷冻电镜技术相比，光学纳米孔传感（OpNS）提供了一种高通量的方法，可检测多种多样的蛋白质及蛋白质-蛋白质相互作用。6然而，光学负染色（OpNS）仍存在一些缺点。与传统的负染色法相比，OpNS包括以下不足：i）样品制备步骤更为复杂；ii）需使用放射性物质UF；iii）由于UF染色剂对光敏感，效价维持时间较短，因此必须保持染色剂新鲜；iv）为防止沉淀，UF溶液必须保存在-80 °C，并在使用前进行解冻；v）最后，所有使用过的UF均须作为危险废物处理。与冷冻电镜（cryo-EM）相比，OpNS提供的图像分辨率相对较低，且无法保证未来不会发现新的潜在人为假象。.

NS 手术操作对脂蛋白缗钱状形成的影响

用于制备待检测蛋白质的负染色（NS）方案16,29-36,55 可分为三大类方法50：混合法55、逐滴添加法16 和洗涤法29。i) 混合法需先将染色剂与蛋白质样品按特定比例预先混合，然后将混合液滴加至覆有碳膜的载网上，最后用滤纸吸去多余液体，经空气干燥后用于电镜观察55。ii) 逐滴添加法是将约 4 μl 样品液直接滴加到覆有碳膜的电镜载网上，静置约 1 分钟，吸去多余样品液后，在同一侧载网上再滴加一滴（约 4 μl）染色液。经过约 1 分钟孵育后，用洁净滤纸接触吸去多余染色液，最后进行空气干燥16,56-58。iii) 洗涤法（图7）是将样品液滴加至覆有碳膜的电镜载网上作用 1 分钟，每次用滤纸吸去多余液体后，立即用去离子水洗涤三次3,29,30。OpNS 方案即由此洗涤法改进而来。

NS 染色类型及其对脂蛋白缗钱状聚集形成的影响

在负染色（NS）中，由于重金属染料导致更强的电子散射，从而提供蛋白质的衬度17-20,59。NS 样品还可能承受更高的辐射剂量，并通过更锐利的负衬度增强蛋白质特征8,9,60。重金属染料可分为两类：阴离子型，包括磷钨酸（PTA）16、甲胺钨酸14和硅钨酸61；以及阳离子型，例如醋酸铀酰（UA）62、氟化铀酰（UF）3,29,30和硝酸铀酰（UN）63。其中最常用的阴离子型负染色剂之一是 PTA33,64-67。PTA 是一种杂多酸，通常在 pH 7.0–7.5 左右使用。PTA 也可用于正染色3,16,68。PTA 的负电荷可能通过静电相互作用与脂蛋白和脂质体表面带正电荷的不饱和脂质头部基团（如 POPC）结合。这种相互作用可能导致缗钱状（rouleaux）结构的形成29,30，即使在常规缓冲液盐浓度下也是如此29,30（图 1）。铀酰类染料（如 UA、UF 和 UN）是阳离子型重金属染料的替代选择，其中 UA 尤其常用于多种生物样品的负染色62,69,70。实验发现，UF 不会引起含有不饱和脂肪酸脂质（如 POPC）的脂蛋白形成缗钱状结构。然而，UF 仍可能诱导含有饱和脂肪酸脂质（如二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱（DMPC）和 1-十六酰-2-十八酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱（PSPC））的脂蛋白形成缗钱状结构。这种相互作用的具体机制尚不清楚。UA/UF/UN 均可在较低 pH 值（3.5–4.6 范围内）发挥作用。然而，此类较低的 pH 值可能不适用于对 pH 敏感的某些生物大分子14,71。有趣的是，UA/UF 可通过一种未知机制在数毫秒内固定蛋白质结构72。与 PTA 不同，UA/UF 更类似于盐而非酸。

据报道，甲酸铀酰（UF）的效果优于乙酸铀酰（UA）73，其中 UF 和 UN 的染色颗粒尺寸小于 UA（UF：0.3 nm，UN：约 0.5 nm）3,74。一个有趣的例子是，当采用先前报道的冷冻正染色法（cryo-PS）并以甲酸铀酰作为负染试剂时，可直接从原始显微图像中观察到一种小蛋白（53 kDa CETP）的类似二级结构的细节（图8）6。在 cryo-PS 方法中，染色后的样品采用冷冻电镜（cryo-EM）样品制备流程进行快速冷冻，而非传统负染色（OpNS）方案中的干燥步骤，后者可能导致二级结构塌陷。cryo-PS 是一种适用于小蛋白高对比度、高分辨率成像的方法75。由于 cryo-PS 图像的对比度与已报道的冷冻负染色（cryo-NS）方案22相反，但与常规 cryo-EM 图像的对比度一致，因此该方法被称为 cryo-PS。cryo-PS 图像显示，染色试剂甲酸铀酰能够渗透分子表面，这挑战了传统观点，即染色仅能显示分子外表面结构。目前尚不清楚甲酸铀酰如何渗透分子表面。一种可能机制是铀酰阳离子与蛋白质中可及的羧基结合，从而使周围玻璃态冰的密度低于蛋白质与铀酰基团的染色区域，从而起到正染色作用。cryo-PS 方法类似于多重同晶置换法（multiple isomorphous replacement, MIR），后者曾是解决X射线晶体学中相位问题的常用方法76-78。在 MIR 中，晶体样品被浸泡于含重原子（包括铀）的溶液中，以获得与其天然形式同晶的衍生物。重原子的引入有时不影响晶体形成或晶胞尺寸，但可为晶体结构测定提供额外信息76-78。得益于 UF 较小的颗粒尺寸，cryo-PS 能够提供单个蛋白质的高对比度、高分辨率图像，这对于蛋白质结构研究具有重要意义，尤其考虑到几乎所有蛋白质在溶液中天然具有动态性和异质性。为验证该 cryo-PS 方法，我们欢迎电子显微学领域任何盲测检验。

盐浓度对脂蛋白中红细胞缗钱状聚集形成的影响

使用传统的PTA负染试剂时，观察到的缗钱状聚集更可能与脂质相互作用相关，而非蛋白质相互作用。对在高盐浓度（0.5 M NaCl）、中等盐浓度（0.25 M NaCl）、较低盐浓度（0.1 M NaCl）以及纯水条件下制备的POPC脂质体样品进行成像（图9），电镜图像显示缗钱状结构的形成与盐浓度相关（图9A–D）。当采用UF作为负染试剂时，在POPC脂质体样品中未观察到缗钱状结构30（图2L），这表明在染色前通过洗涤步骤快速降低盐浓度是防止POPC相关样品中出现缗钱状聚集的必要步骤，但单独此步骤尚不足以完全避免该现象。

小蛋白的透射电镜成像需要接近谢尔策聚焦条件。

要实现小蛋白质在更高分辨率下的成功透射电子显微镜（TEM）成像，需要满足两个关键条件：正确的电子束对中，以及接近谢尔策（Scherzer）焦距的成像条件。i) 正确的电子束对中情况可通过在相对较大欠焦条件下采集的碳膜图像的傅里叶变换结果中可见的索恩环（Thon rings，即功率谱）数量来判断。电子束对中状态越佳，可观察并测量的索恩环数量就越多。ii) 在接近谢尔策焦距条件下成像是另一个关键条件。传统上对生物样品成像的标准策略通常采用较大的欠焦值（1–2 μm 甚至更大），以增强生物样品的图像对比度79。该策略与常用于硬质材料原子分辨率结构成像的策略显著不同，后者通常采用接近谢尔策焦距的条件（约50 nm欠焦）。尽管较大的欠焦可增强生物样品的对比度，但高分辨率信号会因此部分丢失。因此，在较大欠焦成像条件下，图像的高分辨率信息完整性会降低。其原因是，TEM图像为样品结构与仪器衬度传递函数（CTF）的卷积结果。CTF是一条随空间频率振荡的曲线，在高频区域频繁穿过零振幅线。每当CTF穿过零点时，对应频率下的样品结构信号即被完全消除（任何数值乘以零均为零）。该频率下丢失的信号无法通过任何CTF校正算法恢复（零除以零的结果是任意随机数，而非原始结构信号）。在较大欠焦成像条件下，CTF的振荡更为剧烈，穿过零振幅的次数更多，导致更多特定频率下的结构信号被消除。被消除的信号越多，图像的信息完整性就越低。值得注意的是，图像的信息完整性无法通过任何CTF校正手段恢复或修复。然而，通过在不同欠焦条件下获取的多幅信息不完整的图像，可利用平均化方法相互填补信号缺失，从而重建出完整的样品结构信息，甚至实现原子级分辨率9–12。

平均法是一种用于解析某些高度对称蛋白质及结构相关刚性蛋白质结构的有力方法。然而，在小分子量且不对称蛋白质的结构研究中，尤其是对于抗体和高密度脂蛋白（HDL）等具有结构动态性和柔性的蛋白质，该方法仍面临挑战。平均法基于一个假设，即蛋白质颗粒在结构和构象上相同，仅取向不同；但已知许多蛋白质在溶液中会发生热力学涨落。若在未预先了解蛋白质热力学涨落的情况下应用平均法，所得的平均结构常会导致在冷冻电镜重构中出现缺失的结构域10,80或局部分辨率的差异81。

成功实现小分子蛋白质（如53 kDa的CETP）的三维重构以及单个蛋白质（如160 kDa的IgG1抗体）的三维结构解析，得益于在适当对中条件下采用近谢尔策聚焦成像条件。尽管近谢尔策聚焦图像的对比度看似较低，但只需应用低通滤波以降低背景中的高频噪声，即可轻松增强对比度。我们相信，近谢尔策聚焦图像携带了最大的结构信号，能够提高颗粒对中的准确性，并提升单颗粒三维重构及单颗粒电子断层成像重构的效率。

披露

我们没有需要披露的内容。

致谢

感谢杨米奇博士（Dr. Mickey Yang）在编辑和评论方面提供的帮助，以及张磊博士（Drs. Lei Zhang）和彭博博士（Drs. Bo Peng）的协助。本工作得到了美国能源部科学办公室基础能源科学办公室（合同编号：DE-AC02-05CH11231）、美国国立卫生研究院国家心肺血液研究所（编号：R01HL115153）以及美国国立卫生研究院国家普通医学科学研究所（编号：R01GM104427）的支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
染色剂：甲酸铀酰Structure Probe, Inc. 公司的 SPI Supplies 部门02545-AAhttp://www.2spi.com/catalog/chem/Uranyl_Formate.shtml
注射器：1 ml NORM-JECTVWR89174-491https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=89174-491
注射器滤器：0.2 μm VWR28145-487https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=28145-487
注射器滤器：0.02 μm 滤膜（Anotop 10）Whatman6809-1002http://www.whatman.com/AnotopSyringeFilters.aspx
杜尔贝科’磷酸盐缓冲液SIGMA-AldrichD8537http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d8537?lang=zh&®ion=US
Parafilm：4 英寸 × 125 英尺VWR470152-246https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=WLS65710-A
碳膜铜网透射电镜载网：300目太平洋电网科技Cu-300CNhttp://www.grid-tech.com/catalog.htm#1-thincarbon
碳膜铜网：200目Electro Microscopy Sciences（EMS）CF200-Cuhttp://www.emsdiasum.com/microscopy/products/grids/support.aspx
镊子：Dumont 镊子 L5Electro Microscopy Sciences（EMS）72882-Dhttp://www.emsdiasum.com/microscopy/products/tweezers/dumont_clamping.aspx#02-L5
Milli-Q Advantage A10 超纯水净化系统EMD MilliporeMilli-Q Advantage A10http://www.millipore.com/catalogue/module.do?id=C10117
滤纸：1号圆形Whatman1001-090http://www.whatman.com/QualitativeFilterPapersStandardGrades.aspx
铝箔任何类型
低吸附气溶胶滤芯吸头，适用于 10µL型移液器VWR89174-520https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=89174-520
[页眉]
辉光放电装置Ted Pella91000http://www.tedpella.com/easiglow_html/Glow-Discharge-Cleaning-System.htm
过滤器提示：适用于 40 的低吸附气溶胶过滤吸头µ移液器VWR89174-524https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=89174-524
过滤提示：VWR Signature 200 µL 吸头VWR37001-528https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=37001-528
移液PipetmanF161201 和 F167300http://www.pipetman.com/Pipettes/Single-Channel/PIPETMAN-Classic.aspx

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