我们建立了一种荧光原位杂交方案，用于检测动物模型组织切片中持续性DNA病毒基因组。该方案可通过在同一细胞内共检测病毒基因组、其RNA产物以及病毒或细胞蛋白，来研究感染过程。
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摘要
摘要
单个细胞中基因、其RNA产物及细胞调控蛋白的共检测对于研究基因表达调控至关重要。在病毒学领域，这是一项挑战，特别是对于那些需要动物模型进行研究的核内复制的持久性DNA病毒。单纯疱疹病毒1型（HSV-1）在外周神经元中建立终生潜伏感染。潜伏病毒作为储存库，可被重新激活并引发新的疱疹发作。目前对HSV-1潜伏期的细胞生物学机制仍知之甚少，部分原因在于缺乏检测HSV-1基因组的有效方法 原位 在动物模型中。我们描述了一种DNA-荧光 原位 杂交（FISH）方法，可高效检测感染动物模型神经组织切片中低拷贝数的病毒基因组。该方法依赖于基于热处理的抗原修复，以及直接标记的自制DNA探针或商业化探针。我们建立了一种三重染色方法，将DNA-FISH与RNA-FISH相结合 以及免疫荧光染色，采用基于过氧化物酶的信号放大方法以满足各种染色需求。主要改进在于能够在10 µm厚的组织切片中获得背景信号低的染色结果，并可通过共聚焦显微镜和宽场常规落射荧光显微镜进行高分辨率成像。此外，该三重染色法适用于多种针对细胞和病毒蛋白的抗体。完整实验流程共需2.5天，以确保抗体和探针充分渗透入组织。
引言
单纯疱疹病毒1型（HSV-1）是一种持续性的人类嗜神经病毒，可在周围神经系统三叉神经节（TG）的神经元中建立长期潜伏感染，并可周期性地被激活，进行复制和传播。HSV-1基因组为150 kb的双链DNA，定位于宿主神经元细胞核内，以多拷贝染色质化质粒的形式存在，不会整合到宿主细胞基因组中1,2。在潜伏期间，HSV-1的复制周期基因程序被强烈抑制，基因表达仅限于潜伏相关转录本（LAT）位点，从潜伏建立直至再激活启动阶段均如此3。LAT可产生一条长8.5 kb的非编码RNA，加工后形成一条主要的2 kb稳定套索结构RNA，并生成多个miRNA4-7。因此，HSV-1潜伏感染的特征是存在病毒基因组DNA和LAT RNA，而无可检测到的复制周期蛋白。
动物模型，主要是小鼠和兔，是可重现人类潜伏感染多种特征的实验模型。这些模型的主要优势在于，它们能够在免疫功能健全的宿主体内研究HSV-1潜伏期的生理学特性。在过去几十年中，已开发出多种实验工具，例如基因修饰病毒和基因修饰小鼠，用于从动物组织中研究HSV-1潜伏期的生理学、遗传学和细胞生物学特性。迄今为止，病毒基因组DNA通常通过Southern印迹法和定量PCR（qPCR）从分离的三叉神经节（TG）中检测和定量。然而，目前尚无可用的方法用于直接在组织中检测HSV-1基因组 原位 组织切片杂交8因此，通常通过RNA原位杂交检测组织切片中....
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方案
该方法已在先前发表的一项研究中使用22。关于原位杂交（ISH）、免疫荧光（IF）和荧光原位杂交（FISH）常规操作的一般背景和描述，我们建议参考以下现有文献23。
1. 动物感染
所有涉及实验动物的操作均符合视力与眼科学研究协会（ARVO）关于实验动物使用声明中的伦理要求，并经当地UPR-3296-CNRS伦理委员会批准，符合欧洲共同体理事会指令86/609/EEC的规定。所有动物均可自由获取食物和水。
下述小鼠感染HSV-1的方法已在先前发表的研究中使用过24-26。
- 开始实验前，准备以下溶液：
HSV-1 病毒储备液
麻醉溶液——氯胺酮 100 mg/kg 和赛拉嗪 10 mg/kg
- 用一支连接至微注射泵装置（输注速度为 0.1 µl/sec）的 5 µl 玻璃微量注射器吸取 1 µl 病毒（106 pfu）。注意：将病毒储备液重悬于不含酚红的培养基中，以便区分毛细管中的红色油相与病毒溶液，并避免在接种部位注入空气。
- 将麻醉后的小鼠（氯胺酮 100 mg/kg 和 赛拉嗪 10 mg/kg）仰卧放置....
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结果
经过数月的广泛测试，我们发现基于加热的化学去封闭处理可使潜伏的HSV-1基因组暴露，从而适用于荧光原位杂交（fluorescent in situ hybridization）。在此过程中，我们尝试了多种去封闭方法，但仅基于加热的处理（即在微波炉中将切片加热至接近沸腾的温度）显示出有效。随后，我们测试了多种常用于免疫组织化学（IHC）和电子显微镜中抗原表位修复的盐缓冲液31,32，包括0.01 M pH 6.0柠檬酸盐缓冲液（我们在所有研究中均使用该缓冲液）、1× PBS、1 mM EDTA、0.1 M Tris-HCl pH 7.4以及蒸馏水。尽管EDTA缓冲液倾向于损伤组织，但其余所有缓冲液均适用于HSV-1的检测，其信号表现为神经元细胞核内单个或多个斑点（图2A；需注意这些组织具有高度自发荧光，部分图像中表现为细胞质内的均匀信号）。在我们的实验条件下，柠檬酸盐缓冲液始终能在不损伤组织的前提下提供良好的信号，因此被选为常规实验方案中的首选缓冲液。
使用直接标记的Cy3-DNA探针（由克隆.......
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讨论
本文所述方案可用于检测小鼠神经组织切片中神经元内的HSV-1潜伏基因组。由于缺乏检测HSV-1基因组DNA的有效方法，目前对调控病毒基因表达通路的理解仍十分有限 原位 在神经组织内，基因组拷贝数及感染神经元比例的信息主要来源于对解离神经元的PCR分析11,12在阐明宿主细胞核结构在HSV-1潜伏感染中的作用时，我们旨在通过DNA-FISH技术确定潜伏感染小鼠神经元细胞核内HSV-1基因组的定位。我们测试了多种DNA-FISH实验方案及组织处理方法，发现基于加热的处理方式效果最佳。 "表位去封闭" 作为病毒DNA-FISH检测的关键步骤。该处理方法通常用于免疫组织化学中揭示石蜡包埋切片中的蛋白质表位。尽管该技术在病理学领域几乎被普遍采用，但在DNA-FISH中并未常规使用。尽管已有大量研究支持该技术可在光学显微镜水平保持组织形态，使用者仍应针对其特定的生物系统设置适当的对照以验证此点。38在我们的实验中，其他去封闭方法（如蛋白酶处理）均未能实现HSV-1 DNA的检测，而使用不同缓冲液进行基于加热的去封闭处理则 consistently 使HSV-1潜伏期基因组.......
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披露
作者声明不存在竞争性财务利益。
致谢
感谢 N. Sawtell（美国俄亥俄州辛辛那提儿童医院医学中心）、S. Efstathiou（英国剑桥大学）和 James Hill（美国路易斯安那州立大学健康科学中心，新奥尔良）分别提供了 HSV-1 感染的小鼠和兔子样本及相关试剂；感谢 H. Masumoto（日本千叶县香取 DNA 研究所）和 S. Khochbin（法国格勒诺布尔阿尔伯特·博尼奥特研究所）在研究讨论中提供的帮助。
本工作由法国国家科学研究中心（CNRS）（ATIP项目，资助对象：PL，http://www.cnrs.fr）和法国国家研究局（ANR）（项目编号：ANR-05-MIIM-008-01，CENTROLAT）的资助项目支持。 http://www.agencenationale-recherche.fr），FINOVI基金会（http://www.finovi.org/:fr:start），里昂大学 LabEX DEVweCAN（ANR-10-LABX-61）项目 "未来投资" （由法国国家研究局ANR运营的ANR-11-IDEX-0007）http://www.agence-n....
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Balb/c 小鼠 | Janvier，法国 | 6 周龄雌性 | |
| HSV-1 毒株 | SC16 毒株（野生型） | 详见 Labetoule, M. 等人 Invest. Ophthalmol. Vis. Sci 44, 217–225 (2003)，了解 HSV-1 毒株及病毒储备液制备的详细信息。 | |
| 盐酸氯胺酮 | Sigma | K2753 | 腹腔注射含盐酸氯胺酮（100 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）的溶液 |
| 盐酸赛拉嗪 | Sigma | X1251 | |
| 多聚甲醛（PFA） | Sigma | 158127 | 将 4 g PFA 悬浮于 90 ml 水中。加入 50 µl 1N NaOH，并在 60 °C 水浴中搅拌加热。PFA 约 30 分钟内溶解。加入 10 ml 10x PBS。该溶液可预先配制，并分装于 5 ml 管中，于 -20 °C 保存。注意：应在通风橱中操作。 |
| 生理盐水 | Sigma | 07982-100TAB-F | |
| 1x PBS，pH 7.4（无菌） | Life Technologies | 10010-015 | |
| 蔗糖 | Sigma | 84100 | 用 1x PBS 配制 20% 蔗糖溶液。 |
| 冷冻切片包埋介质 — Tissue-Tek OCT 化合物 | SAKURA | 4583 | |
| 大容量质粒 DNA 纯化试剂盒 | Qiagen | 12462 | 用于纯化含 HSV-1 基因组的 Cosmid 或 BAC 载体，并于 -20 °C 保存 |
| 缺口平移试剂盒 | Roche Applied Sciences | 10 976 776 001 | |
| Cy3-dCTP | GE Healthcare | PA53021 | 避光保存 |
| 0.5 M EDTA | Sigma | E6758 | |
| G50 Mini 离心柱 | GE Healthcare | 27-5330-01 | |
| 鲑鱼精子 DNA 10 mg/ml | Invitrogen Life Technologies | 15632-011 | |
| 分子生物学级乙醇 | Sigma | 87047 | 配制 70% 溶液 |
| 鲑鱼精子 DNA | Invitrogen Life Technologies | 15632-011 | |
| 分子生物学级甲酰胺 | Sigma | F9037 | 注意：应在通风橱中操作。 |
| HSV-1 生物素标记商用探针 | Enzo Life Sciences | ENZ-40838 | |
| ImmEdge 疏水笔 | Vector Laboratories | H-4000 | |
| 20x 柠檬酸钠盐溶液（SSC） | Sigma | S6639 | 用 ddH20 配制 2x SSC 溶液。 |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | 用蒸馏水配制 10% 储备液，4 °C 保存。使用前用 1x PBS 配制 0.5% 溶液。 |
| 10 mM 柠檬酸钠 pH 6.0 | Sigma | S1804 | 配制 100 mM 储备液（10x）。称取 10.5 g 柠檬酸（分子量 210.14）。注意：具刺激性和毒性，需佩戴适当口罩和手套。用 1 N NaOH 调节 pH 至 6.0（注意：具刺激性，需戴手套）。用蒸馏水定容至 500 ml。使用前用蒸馏水稀释 10 倍。 |
| 乙酸 | Sigma | 320099 | |
| 分子生物学级甲醇 | Sigma | 322415 | |
| 硫酸葡聚糖 — 分子量 500,000 | Euromedex | EU0606-A | |
| Denhardt 溶液（100x） | Euromedex | 1020-A | |
| 橡胶水泥 "FixoGum" | Marabut | 290110000 | |
| DNA 纯化试剂盒 — Qiaquick PCR 纯化试剂盒 | Qiagen | 28104 | |
| T7 体外 转录试剂盒 | Ambion Life Technologies | AM1314 | |
| 生物素-16-UTP | Roche Applied Sciences | 11388908910 | |
| RNA 纯化微型柱 | Qiagen | 73404 | |
| 核糖核苷酸钒酸复合物 | New England Biolabs | S1402S | |
| H2O2 | Sigma | H3410 | 用蒸馏水配制 3% 溶液。4 °C 保存并避光。 |
| 酵母 tRNA | Invitrogen | 15401011 | 用无 RNA 酶水配制 10 mg/ml 溶液 |
| 正常山羊血清 | Invitrogen | PCN5000 | |
| 一抗 | 任意供应商 | 结果部分使用的一抗包括：抗小鼠 CENP-A（兔单克隆抗体 C51A7，Cell Signaling Technologies）和抗 ATRX H-300（Santa Cruz Biotechnology） | |
| 荧光标记二抗 | Invitrogen Life Technologies | 本方案常规使用的荧光二抗为 Alexa Fluor 标记的山羊抗体（IgG H+L）。结果部分使用的抗体为 Alexa Fluor 488 标记的抗兔山羊抗体（货号 A11001） | |
| 酪胺信号放大（TSA）试剂盒 — 链霉亲和素 + Alexa Fluor 350（蓝色荧光） | Invitrogen Life Technologies | #T20937 | TSA 试剂盒也可从 Perkin Elmer 购得 |
| 酪胺信号放大（TSA）试剂盒 — 链霉亲和素 + Alexa Fluor 488（绿色荧光） | Invitrogen Life Technologies | #T20932 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen Life Technologies | H3570 | 使用前立即用 1x PBS 配制 0.5 µg/ml 溶液。剩余溶液应丢弃。 |
| 22 mm × 50 mm 盖玻片，n°1.5 玻璃 | Electron Microscopy Sciences | 72204-04 | |
| 含抗淬灭剂的封片介质 — VECASHIELD | Vector Laboratories | H-1000 | 其他常规产品包括 Electron Microscopy Science 的 Fluoromount G |
| Superfrost 玻片 | FisherScientific | 12-550-15 | |
| 仪器/材料 | 公司 | 货号 | 备注 |
| 感染用针头 | 热拉制玻璃微量移液管，定制。 | ||
| 解剖器械 | Moria，法国 | 显微手术剪和镊子 | |
| 蠕动泵 | Cole Palmer Instruments | Easyload Masterflex | |
| 微量注射泵装置（Nano Pump） | kdScientific | KDS310 | |
| 冷冻切片机 | Leica France | CM 1510-1 | |
| -80 °C 冰箱 | Sanyo | 超低温 -80 °C | |
| 家用微波炉 | |||
| 干浴加热器 | Eppendorf | 022670204 | |
| 孵育板槽（Slide moat） | Boekel Scientific | 240000 | |
| Coplin 染色缸 | Dominique Dutscher | 68512 | |
| 染色玻璃容器 | Dominique Dutscher | 68506 | |
| 荧光显微镜 | Zeiss | 结果部分图像使用 Zeiss AxioObserver 显微镜采集，物镜为 40X LD NeoFluor N.A 0.6 和 100X PlanApochromat N.A 1.3。滤光片组 #38、#43 和 #43。HXP 120 荧光光源。Photometrics CoolSNAP HQ2 CCD 相机。信号在较新型的高效显微镜（如 Zeiss AxioImager/AxioObserver 系列、Nikon Ti-E/Ni-E 系列或 Leica DM/DMI6000 系列）上更容易观察到 |
参考文献
- Knipe, D. M., Cliffe, A. Chromatin control of herpes simplex virus lytic and latent infection. Nat. Rev. Microbiol. 6 (3), 211-221 (2008).
- Bloom, D. C., Giordani, N. V., Kwiatkowski, D. L. Epigenetic regulation of latent HSV-1 gene expression. Biochim. Biophys. Acta....
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