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方法文章

通过荧光法检测神经元组织中一种持续性DNA病毒的基因组和转录本 原位 杂交结合免疫染色

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DOI：

10.3791/51091

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2014年1月23日

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1Virus and Centromere Team, Centre de Génétique et Physiologie Moléculaire et Cellulaire, CNRS UMR 5534, 2Université de Lyon 1, 3Laboratoire d'excellence, LabEX DEVweCAN, 4Institut de Virologie Moléculaire et Structurale, CNRS UPR 3296, 5Centre de Recherche en Cancérologie de Lyon, INSERM U1052, CNRS UMR 5286

本文内容

摘要

我们建立了一种荧光原位杂交方案，用于检测动物模型组织切片中持续性DNA病毒基因组。该方案可通过在同一细胞内共检测病毒基因组、其RNA产物以及病毒或细胞蛋白，来研究感染过程。

摘要

单个细胞中基因、其RNA产物及细胞调控蛋白的共检测对于研究基因表达调控至关重要。在病毒学领域，这是一项挑战，特别是对于那些需要动物模型进行研究的核内复制的持久性DNA病毒。单纯疱疹病毒1型（HSV-1）在外周神经元中建立终生潜伏感染。潜伏病毒作为储存库，可被重新激活并引发新的疱疹发作。目前对HSV-1潜伏期的细胞生物学机制仍知之甚少，部分原因在于缺乏检测HSV-1基因组的有效方法 原位 在动物模型中。我们描述了一种DNA-荧光 原位 杂交（FISH）方法，可高效检测感染动物模型神经组织切片中低拷贝数的病毒基因组。该方法依赖于基于热处理的抗原修复，以及直接标记的自制DNA探针或商业化探针。我们建立了一种三重染色方法，将DNA-FISH与RNA-FISH相结合 以及免疫荧光染色，采用基于过氧化物酶的信号放大方法以满足各种染色需求。主要改进在于能够在10 µm厚的组织切片中获得背景信号低的染色结果，并可通过共聚焦显微镜和宽场常规落射荧光显微镜进行高分辨率成像。此外，该三重染色法适用于多种针对细胞和病毒蛋白的抗体。完整实验流程共需2.5天，以确保抗体和探针充分渗透入组织。

引言

单纯疱疹病毒1型（HSV-1）是一种持续性的人类嗜神经病毒，可在周围神经系统三叉神经节（TG）的神经元中建立长期潜伏感染，并可周期性地被激活，进行复制和传播。HSV-1基因组为150 kb的双链DNA，定位于宿主神经元细胞核内，以多拷贝染色质化质粒的形式存在，不会整合到宿主细胞基因组中1,2。在潜伏期间，HSV-1的复制周期基因程序被强烈抑制，基因表达仅限于潜伏相关转录本（LAT）位点，从潜伏建立直至再激活启动阶段均如此3。LAT可产生一条长8.5 kb的非编码RNA，加工后形成一条主要的2 kb稳定套索结构RNA，并生成多个miRNA4-7。因此，HSV-1潜伏感染的特征是存在病毒基因组DNA和LAT RNA，而无可检测到的复制周期蛋白。

动物模型，主要是小鼠和兔，是可重现人类潜伏感染多种特征的实验模型。这些模型的主要优势在于，它们能够在免疫功能健全的宿主体内研究HSV-1潜伏期的生理学特性。在过去几十年中，已开发出多种实验工具，例如基因修饰病毒和基因修饰小鼠，用于从动物组织中研究HSV-1潜伏期的生理学、遗传学和细胞生物学特性。迄今为止，病毒基因组DNA通常通过Southern印迹法和定量PCR（qPCR）从分离的三叉神经节（TG）中检测和定量。然而，目前尚无可用的方法用于直接在组织中检测HSV-1基因组 原位 组织切片杂交8因此，通常通过RNA原位杂交检测组织切片中的LAT RNA来评估潜伏期 原位 杂交而非病毒基因组检测。由于无法根据病毒基因组的存在来鉴定被感染的细胞，这一技术局限性严重阻碍了对宿主-病毒相互作用多个方面的研究，例如病毒基因组与细胞及病毒基因表达之间的关系。 或宿主细胞介导的免疫反应9,10.

最重要的是，潜伏感染的细胞间异质性仍相对缺乏研究，并已被证明是小鼠以及植入SCID小鼠体内的人类感觉神经节神经元中潜伏感染的关键特征11-17。通常通过qPCR显示，每个细胞中HSV-1基因组拷贝数从5到数百不等。尽管LAT被认为是调控潜伏和再激活的关键因子，但对分离神经元的qPCR分析以及原位PCR结果表明，仅有部分潜伏感染的神经元（低至30%）表达LAT基因座11,12,18-21。宿主细胞及其组织微环境如何影响病毒潜伏的建立及病毒基因表达，目前尚不明确。本文中，我们描述了一种可靠的荧光原位杂交（FISH）方法，可高效检测动物神经组织切片中低拷贝数的HSV-1基因组DNA。该方法由我们设计并使用，旨在获得高分辨率显微成像，从而研究病毒基因组与宿主细胞核内组分之间的相互作用22。此外，我们还描述了一种多重染色方法，可同时检测病毒DNA、RNA和蛋白质，这是描述调控病毒基因表达的病毒-宿主相互作用的独特工具。该方法也可广泛应用于需要检测HSV-1潜伏基因组的各类分析，例如在大量组织切片中定量感染的神经元。其中关键步骤是进行抗原修复处理，以使病毒DNA能够暴露并适用于杂交。因此，本方案也可能适用于其他目前无法通过传统DNA-FISH方法在动物组织中检测的双链DNA病毒的检测。

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方案

该方法已在先前发表的一项研究中使用22。关于原位杂交（ISH）、免疫荧光（IF）和荧光原位杂交（FISH）常规操作的一般背景和描述，我们建议参考以下现有文献23。

1. 动物感染

所有涉及实验动物的操作均符合视力与眼科学研究协会（ARVO）关于实验动物使用声明中的伦理要求，并经当地UPR-3296-CNRS伦理委员会批准，符合欧洲共同体理事会指令86/609/EEC的规定。所有动物均可自由获取食物和水。

下述小鼠感染HSV-1的方法已在先前发表的研究中使用过24-26。

  1. 开始实验前，准备以下溶液：

    HSV-1 病毒储备液
    麻醉溶液——氯胺酮 100 mg/kg 和赛拉嗪 10 mg/kg
     
  2. 用一支连接至微注射泵装置（输注速度为 0.1 µl/sec）的 5 µl 玻璃微量注射器吸取 1 µl 病毒（106 pfu）。注意：将病毒储备液重悬于不含酚红的培养基中，以便区分毛细管中的红色油相与病毒溶液，并避免在接种部位注入空气。
  3. 将麻醉后的小鼠（氯胺酮 100 mg/kg 和 赛拉嗪 10 mg/kg）仰卧放置。
  4. 将麻醉小鼠的头部置于双目立体显微镜下，将针头插入左侧上唇黏膜与皮肤交界处的上皮下层。以每 5 秒 0.5 µl 的速度分两步注射病毒溶液（每次 0.5 µl）。注意：两次 0.5 µl 注射之间应间隔 10 秒，以确保病毒悬液在注射部位充分吸收。
  5. 将小鼠置于 37 °C 培养箱中直至苏醒。
  6. 将小鼠放回动物饲养设施中，恢复至所需时间。注意：在小鼠模型中，HSV-1 会引发原发性感染（称为急性感染），该感染在接种部位及多个神经组织（包括三叉神经节（TG）、颈上神经节（SCG）和背根神经节（DRG），具体取决于接种部位）持续不到 10 天。原发性感染的体征逐渐消失，潜伏感染通常在感染后 28–30 天（dpi）起被认定为完全建立。用于急性感染研究的神经组织通常可在感染后第 4 天（4 dpi）起采集，而用于潜伏感染研究的组织则通常在感染后第 28 天（28 dpi）起采集。

2. 小鼠灌注固定

  1. 开始前准备以下溶液：50 ml 生理盐水缓冲液

    60 ml 1× PBS
    150 ml 新鲜配制的含4%多聚甲醛的1× PBS
    60 ml 含20%蔗糖的1× PBS。
     
  2. 准备灌注管路：将针头连接至毛细管，再将毛细管连接至蠕动泵。
  3. 按照前述方法（步骤1.2）麻醉小鼠，并将其仰卧固定于解剖托盘上，四肢用针固定。
  4. 使用剪刀从腹部向上剪开皮肤至 throat*。撕开覆盖器官的薄层组织。剪开胸骨一侧的肋骨以打开胸腔。通过撕除方式去除皮肤。将左右两侧肋骨分开，暴露心脏。注意：注意避免切破肠道、肺脏以及大血管（颈动脉和颈静脉），否则将导致无法进行灌注固定。
  5. 将针头插入左心室*。用剪刀剪开右心房。通过心脏向血管内注入20 ml生理盐水进行放血。让血液流入托盘中。注意：操作过程中注意避免针头穿透心脏另一侧壁。
  6. 在15分钟内灌注150 ml含4% PFA的1× PBS*（注意： PFA具有毒性，应在通风橱中操作）。随后在6分钟内灌注60 ml含20%蔗糖的1× PBS。至此，小鼠已准备好进行TG取材。注意：将泵速设定为10 ml/min。良好的灌注表现为小鼠尾巴先僵直、抬起，随后下垂。

3. 甘油三酯的提取

  1. 开始前准备以下溶液：

    20% 蔗糖的 1x PBS 溶液
     
  2. 在颈部水平处切断头部。在门齿后方剪断鼻尖以暴露鼻腔。用剪刀将腭部从中间剪开，并分别移开两侧腭部。注意：三叉神经节（TGs）位于腭部下方，呈左右两侧对称分布的两个白色、长椭圆形组织，长约 2–3 mm，并与三叉神经相连。
  3. 在两侧切断三叉神经节（TGs）的三叉神经分支，使 TGs 与脑干分离。用手术镊取下 TGs，并将其置于 20% 蔗糖无菌溶液中保存 24 小时。注意：左右侧 TGs 应分别使用不同的容器存放，以避免混淆左侧（感染）与右侧（未感染或弱感染）TGs。在包埋前，将 TGs 置于含 20% 蔗糖的 1x PBS 溶液中孵育 24 小时。
  4. 将 TGs 单独包埋于冷冻切片包埋介质中，并在 -80 °C 下冷冻。
  5. 将包埋块保存在 -80 °C，直至进行切片。

4. 冷冻切片制备

  1. 在-20 °C的冷冻切片机中将TG组织纵向切为10 µm厚的切片，置于轻微加热（30 °C）的Superfrost载玻片上。切片干燥5–10分钟后，冻存于-80 °C，待用。 注意： 如果需要同时处理大量切片，每张载玻片上可放置4-5个切片。操作步骤如下：将连续切片依次置于标记为A1、B1和C1的三组载玻片上，随后为A2、B2、C2，依此类推。因此，每组载玻片（A、B和C）可进行不同的染色处理原位 杂交，荧光原位杂交（FISH） 原位 PCR、LCM）所获得的数据进行比较，因为编号相同的切片对应于三叉神经节（TG）的相同区域。

5. HSV-1 探针标记

本文所述用于通过DNA FISH检测HSV-1基因组的实验方案已成功使用了两种类型的探针。第一种是自制的Cy3标记荧光探针，适用于通过高倍荧光显微镜对单个细胞内细胞核结构进行精细分析。第二种是市售的生物素标记探针，可与基于过氧化物酶的信号放大技术联用，产生强荧光信号。后者适用于在低倍镜下对整张组织切片中含病毒的神经元进行鉴定与定量，并用于分析HSV-1基因组的分布模式。最终使用者应根据研究目的评估哪种方法更为合适。市售探针列于试剂部分，自制探针的制备方法如下所述。

  1. 开始前准备以下溶液：

    含有 HSV-1 基因组的载体（见步骤 1）
    70% 乙醇，分子生物学级
     
  2. 准备含有 HSV-1 基因组 30 kb 片段的黏粒（黏粒编号 14、28 和 56，参见文献20），使用专用于大载体的纯化柱进行纯化。注意：其他类型的含有 HSV-1 基因组的文库（如细菌人工染色体）也应可行，只要探针覆盖 HSV-1 基因组的较大区域以产生足够信号27-29。在我们的实验中，由黏粒载体骨架制备的探针未产生任何信号，因此用作阴性对照。因此，本研究使用了包含 HSV-1 序列的完整黏粒载体。也可将 HSV-1 序列切割下来用于制备探针。
  3. 使用缺口平移试剂盒，按照制造商说明书，用 Cy3-dCTP 对每种黏粒的 2 µg DNA 进行标记。注意：标记反应体系中应仅包含 Cy3-dCTP，不添加未标记的 dCTP。
  4. 向反应混合物中加入 3 µl 0.5 M EDTA 以终止反应，并在 70 °C 加热 10 分钟。随后置于冰上冷却。
  5. 使用 G50 凝胶过滤微型柱纯化探针。向探针中加入 150 µg 鲑精 DNA，并通过乙醇沉淀法沉淀探针。由于掺入了 Cy3，DNA 沉淀应呈粉红色。用 70% 乙醇洗涤沉淀，并用移液器尽可能吸除乙醇。切勿让沉淀完全干燥。
  6. 用 100 µl 去离子甲酰胺溶解沉淀（注意： 甲酰胺有毒，应在通风橱中操作）。此时无法准确测定探针浓度。文中提到的探针用量指的是用于制备探针的模板 DNA 量。由于本方案基于 2 µg 模板 DNA 和 100 µl 甲酰胺，因此探针浓度视为 20 ng/µl。探针可于 -20 °C 保存。标记后的探针可大量制备并冷冻保存数月。

6. DNA-FISH

图1展示了DNA-FISH实验方案的主要步骤概览，以及如何在多重染色实验中进行DNA-FISH以同时检测RNA和蛋白质，如方案7-9所述。

  1. 开始前准备以下溶液：

    1x PBS 中含 0.5% Triton X-100
    2x SSC 和 0.2x SSC 缓冲液
    100 mM pH 6.0 柠檬酸盐缓冲液（10x 储备液）和 10 mM pH 6.0 柠檬酸盐缓冲液（工作液）
    2x 杂交缓冲液（见方案 4）
     
  2. 第1天，在室温下将切片置于切片架上，让组织干燥10分钟。用疏水笔圈出组织区域。在1x PBS中重水化10分钟。用含0.5% Triton X-100的1x PBS孵育20分钟以通透组织。用2x SSC洗涤3次，每次10分钟，并将切片保留在2x SSC中，直至去封闭缓冲液加热完成（见下文）。
  3. 进行去封闭时，准备一个可容纳20张切片的玻璃切片托盘，加入200 ml 10 mM柠檬酸钠缓冲液（pH 6.0）。将该托盘放入一个更大的容器中，容器内装有500 ml 蒸馏水。此设置有助于更好地控制加热脉冲。在将切片放入托盘前，先将缓冲液在微波炉中预热至沸腾（约800 W下加热8分钟）。
  4. 将切片放入预热的含柠檬酸盐缓冲液的托盘中，并确认其完全被缓冲液覆盖。加热约20秒，直至缓冲液达到沸腾。注意：切勿使缓冲液过度沸腾，以免损伤组织。在室温下冷却2分钟。重复加热循环6次（共7次加热循环）*。冷却2分钟后，将切片转移至2x SSC中孵育5分钟。
    注*：这是最关键的步骤之一。最佳加热循环次数和持续时间需通过实验确定，可能因组织类型或探针类型而异。为保证去封闭的可重复性，应保持微波炉、托盘、容器以及托盘中缓冲液体积和容器中水量一致。过度沸腾可能导致组织脱落和细胞损伤。每次加热时应密切观察沸腾现象，并在刚出现沸腾迹象时立即停止加热。一旦条件确定 ，去封闭过程通常稳定且可重复。图2A显示，使用不同缓冲液去封闭均可检测到HSV-1基因组，表明去封闭条件尚可进一步优化。基于柠檬酸盐的去封闭方法在多种实验室 和动物模型组织切片中均能稳定提供良好的FISH信号和组织保存效果。
  5. 将切片在甲醇:乙酸:PBS混合液（3:1:4）中孵育15分钟，然后在甲醇:乙酸混合液（3:1）中孵育15分钟（注意：乙酸具有腐蚀性，应在通风橱中操作并采取适当防护措施。该溶液需现配现用）。
  6. 通过依次在70%乙醇中孵育10分钟，再在100%乙醇中孵育2次、每次10分钟进行脱水。室温下干燥10分钟。保持干燥状态直至杂交步骤。
  7. 按如下方法配制杂交溶液：预先配制20 ml 含20%硫酸葡聚糖（分子量500,000）、2x Denhardt溶液和4x SSC*的2x 杂交缓冲液储备液。分装为每管500 µl 至微量离心管中，于-20 °C保存。每张切片（使用22 mm × 50 mm盖玻片）取90 ng HSV-1 Cy3标记探针（每个cosmid探针30 ng），用甲酰胺补足至40 µl 。加入40 µl 2x 杂交缓冲液。反复吹打数次以充分混匀。
    注*：配制2x 杂交缓冲液时，将4 g分子量为500,000的硫酸葡聚糖加入10 ml 蒸馏水中。该混合物较粘稠，需在70 °C下加热3–4小时使其溶解。期间需定期混匀以促进溶解。加入4 ml 20x SSC和400 µl 100x Denhardt溶液，用蒸馏水定容至20 ml ，并用涡旋振荡器充分混匀。
  8. 将80 µl 杂交溶液滴加至干燥的组织切片上。盖上22 mm × 50 mm的玻璃盖玻片，确保杂交液均匀覆盖整个盖玻片表面。注意：不得有气泡。气泡会降低杂交效率。用橡胶胶水密封盖玻片边缘，并使其干燥。将切片避光置于室温下至少2小时，以获得整张切片上最佳的杂交信号。
    注：橡胶胶水使用方便，干燥迅速，防水，且能防止杂交过程中样本干燥。杂交完成后也易于剥离以去除盖玻片。指甲油可作为替代密封材料，但使用较不方便。
  9. 将切片置于80 °C的切片孵育器上进行5分钟变性。或者，将切片放在金属托盘上，再将托盘浸入80 °C水浴中（托盘应漂浮于水面）。随后迅速将切片转移至置于冰上的金属托盘中，保持5分钟。最后将切片转移至37 °C（切片加热器或孵育器）进行过夜杂交。
    注：不建议缩短杂交时间，否则会导致信号微弱或无信号。
  10. 第2天，用镊子去除橡胶胶水，同时保持切片在加热器上以维持组织温度在37 °C。用手术刀刀尖轻轻移除盖玻片。
  11. 在37 °C下用2x SSC洗涤3次，每次5分钟；再在37 °C下用0.2x SSC洗涤3次，每次5分钟。最后在室温下用2x SSC洗涤一次，5分钟，随后进行DNA染色和封片（见下方方案10 ）。
    注：该方法可通过在杂交液中同时加入针对细胞基因组靶标的特异性探针，实现对细胞基因组目标的检测，如已发表文献中针对着丝粒和近着丝粒序列所采用的方法22。

7. 双重 RNA-DNA FISH

参见图1中的绿色框以了解概览。

对于包含RNA-FISH步骤的多重染色实验，通常建议首先进行RNA检测，因为该靶标易受RNase及化学试剂的降解影响。此外，DNA-FISH实验步骤中的处理可能降低其他染色的效率。在RNA-FISH中，我们选择了一种基于酶的检测方法（使用生物素标记探针和辣根过氧化物酶（HRP）偶联的链霉亲和素进行酪胺信号放大（TSA））。TSA基于荧光酪胺底物（详见试剂表），通过过氧化物酶的酶促反应将该底物共价连接至组织。因此，RNA-FISH信号在后续DNA-FISH过程中得以保留。

  1. 开始前准备好以下溶液：

    载体用于 体外 LAT基因座的转录（pSLAT-2）
    含 2 mM RVC 的 1x PBS
    含 2 mM RVC 的 0.5% Triton X-100 的 1x PBS 溶液
    3% H202 在蒸馏水中。
    70%、80%、95% 乙醇，分子生物学级
    4x RNA杂交溶液（见方案4）
     
  2. 至少在RNA-FISH实验前一日，制备RNA FISH探针。为检测HSV-1潜伏相关转录本（LAT），需从pSLAT-2载体制备生物素标记的核糖探针30，或另一种载体用于 体外 LAT 基因座的转录，如参考文献中先前所述26简要步骤：用HindIII酶切10 µg的pSLAT-2质粒使其线性化，并使用DNA纯化试剂盒纯化酶切后的载体。以2 µg线性化的pSLAT-2为模板，利用T7聚合酶合成单链核糖探针。 体外 在生物素-16-UTP*存在下使用转录试剂盒制备探针。使用RNA微型柱纯化探针，并用分光光度计在260 nm处定量。将探针用无DNA酶/RNA酶的水稀释至50 ng/µl，分装成小份后于-80 °C保存，避免反复冻融。
    注意*： 生物素-16-UTP与UTP的比例需通过实验确定。我们发现40:60的比例可有效生成用于RNA-FISH检测LAT的探针。
  3. 第1天，将切片置于室温下的载片架上，晾干10分钟。用疏水笔在组织周围画圈。在含2 mM核糖核苷酸钒氧复合物（RVC）的1×PBS中重水化组织切片，持续10分钟。随后在含0.5% Triton X-100和2 mM RVC的1×PBS中孵育20分钟，以通透组织。用含2 mM RVC的1×PBS洗涤3次，每次10分钟。为淬灭内源性过氧化物酶活性，将切片在3% H₂O₂的甲醇溶液中孵育10分钟。用含2 mM RVC的1×PBS洗涤3次，每次5分钟。使用含2 mM RVC的1×PBS配制封闭液（含5%正常山羊血清和0.2% Triton X-100），室温封闭切片60分钟。按制造商说明书稀释一抗，置于湿盒中，4°C孵育过夜。次日，用含2 mM RVC的1×PBS洗涤切片3次，每次10分钟。按说明书推荐稀释生物素标记的二抗，室温孵育1小时。再次用含2 mM RVC的1×PBS洗涤3次，每次10分钟。滴加ABC试剂（亲和素-生物素-过氧化物酶复合物），室温孵育30分钟。用含2 mM RVC的1×PBS洗涤3次，每次10分钟。用去离子水短暂冲洗切片后，置于DAB显色液中显色，显微镜下控制反应时间。显色完成后，用去离子水冲洗终止反应。如有必要，用苏木精轻度复染。梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。切片干燥后于显微镜下观察并拍照。2O2 2次，每次10分钟，然后用1×PBS、2 mM RVC洗涤1次。
    注意*： 在整个RNA-FISH实验过程中，需在缓冲液和溶液中添加核糖核苷酸氧钒复合物（RVC），以防止RNA降解。
  4. 在70%乙醇中孵育2次，每次10分钟。此步骤后，切片可在70%乙醇中于-20 °C保存数周。依次在80%、95%和100%乙醇中孵育脱水，每次5分钟。让切片干燥至少10分钟。
    注意： 在某些情况下，乙醇处理可能不利于其他靶标的检测。一种替代方案是使用含50%甲酰胺的预杂交步骤 - 2x SSC 可用于（见下文方案 9） 有关三重染色的详细信息，请参见相关说明）。然而，乙醇处理是RNA-FISH中最通用的方法，可提供最低的背景信号。
  5. 按如下步骤配制探针溶液：预先配制10 ml浓度为4x的储备液 含8x的RNA杂交溶液 SSC，20× Denhardt溶液，4 mM EDTA，40%葡聚糖*。将溶液分装至微量离心管中，每管500 µl，于-20 °C保存。每张载玻片准备80 µl 20 µl 溶液（22 mm × 50 mm 盖玻片），包含 20 ng 生物素标记的 LAT 核糖探针、40 ng 酵母 tRNA、2 mM RVC，并用溶剂定容至 20 µl 用水。加入 20 µl 4倍 RNA杂交溶液，以及40 µl 甲酰胺（最终浓度50%）。为了便于移液和混匀，建议将4x预热 在75 °C下使用RNA杂交溶液，用移液器上下吹打数次以充分混匀。
    注意*： 准备 4x RNA 杂交溶液，将 4 g 硫酸葡聚糖（分子量 500,000）溶于 3 ml 蒸馏水和4 ml 20倍 SSC。形成黏稠混合物，在70 °C下3-4小时溶解。定期混匀以促进溶解。加入2 ml 100倍 Denhardt's 溶液，和 80 µl 0.5 M EDTA 溶液，定容至 10 ml 用水溶解，并用涡旋振荡器充分混匀。注意：仅使用无RNA酶/DNA酶的产品。
  6. 将探针在75 °C下变性10分钟。同时，将载玻片置于65 °C的载玻片孵育器上。加入80 µl 将探针溶液滴加到切片上，并迅速将盖玻片覆盖在液滴上。注意：不得产生气泡，气泡的存在会降低杂交效率。由于盖玻片未密封，孵育必须在湿化 chamber 中进行。可使用可盛水的切片孵育盒（见材料表），或在密封盒内自制湿化 chamber，然后置于65 °C杂交炉中孵育。
  7. 65 °C 下孵育过夜。 注意： LAT RNA-FISH 在 65 °C 下进行，以防止探针在 37 °C 时出现非特异性结合。许多其他 RNA-FISH 探针在 37 °C 时应能产生良好的信号。
  8. 第2天，在开始洗涤前，根据TSA检测试剂盒的制造商说明书配制检测试剂。检测使用商业化的TSA检测试剂盒进行，包含辣根过氧化物酶（HRP）偶联的链霉亲和素以及绿色或蓝色荧光底物。
  9. 将载玻片置于65 °C的载玻片加热器上。小心移除盖玻片，并迅速加入1 ml 50% 甲酰胺的2x溶液 SSC（于65 °C预热）。注意：切勿让切片干燥。在65 °C下，用含50%甲酰胺的2×SSC溶液洗涤两次，每次10分钟。 SSC 和 2 × 10 分钟在 2× 在65 °C下用SSC洗涤，再用2x洗涤一次 SSC中，并将载玻片置于37 °C的载玻片加热器上。
  10. 根据TSA检测试剂盒制造商的说明书进行检测步骤。HRP-链霉亲和素的浓度、荧光底物的浓度以及反应时间必须通过实验经验确定*。对于LAT RNA检测，我们常规使用的条件如下：HRP-链霉亲和素按1/500稀释，荧光试剂用于蓝色荧光时按1/100稀释，用于绿色荧光时按1/500稀释，反应时间为10分钟。在进行DNA-FISH之前，可无需封片，直接使用倒置荧光显微镜快速检查信号。
    注意*： 扩增程序将根据实验的主要目标进行设计。例如，若需精确地定位目标 RNA，建议使用较短的反应时间；相反，若需在低倍镜下快速识别并计数阳性细胞，则可延长反应时间以产生较强的信号。
  11. 对于DNA-FISH，从去封闭步骤（步骤6.2）开始，按照上述指示进行操作。

8. 免疫- DNA FISH

参见图1中的紫色框以查看概览。

与RNA-DNA-FISH类似，建议首先进行免疫荧光染色，因为DNA-FISH可能导致蛋白质变性，从而阻碍抗体对蛋白质的检测。免疫荧光信号的质量高度依赖于抗体的特性，因此应尽可能测试多种抗体。为提高蛋白质检测和DNA-FISH的效果，需在免疫荧光染色前进行一次表位修复。为了在DNA-FISH过程中保持样品上的免疫荧光信号，必须将其通过共价键连接到组织上。本文介绍了我们实验中效果良好的两种方法：抗体后固定法和基于酪胺的信号放大检测法（见步骤8.5）。具体方法的选择应根据每种靶标/抗体组合的预实验结果来决定。

  1. 开始前准备以下溶液：

    含 3% 正常山羊血清（NGS）的 1× PBS。
    1× PBS 中的 2% PFA（由 4% 储存液稀释而成）
     
  2. 第 1 天，前几步与 DNA-FISH 相同，直至去遮蔽步骤（步骤 6.1–6.2 ）。
  3. 去遮蔽后，用含 3% NGS 的 1× PBS 孵育切片 1 小时。
  4. 用含 3% NGS 的 1× PBS 稀释的一抗孵育 24 小时。可缩短孵育时间以加快实验流程，但我们发现过夜孵育通常可获得更强的信号。对于亲和力较低的一抗（如 IgM），可能需要孵育 48–72 小时。
  5. 第 2 天，用 1× PBS 洗涤 3 次，每次 10 分钟。
  6. 采用抗体后固定方案：在含 3% NGS 的 1× PBS 中，加入与绿色荧光染料偶联的二抗（1/200 稀释），孵育 1 小时。用 1× PBS 洗涤 3 次，每次 10 分钟。随后用含 2% PFA 的 1× PBS 进行后固定，持续 10 分钟*。再用 1× PBS 洗涤 3 次，每次 10 分钟。
    采用 TSA 检测方案：在含 3% NGS 的 1× PBS 中，加入 HRP 偶联的二抗（1/250 稀释），孵育 1 小时。用 1× PBS 洗涤 3 次，每次 10 分钟。随后根据试剂盒说明书进行酪胺信号放大（tyramide）检测。如上所述（步骤 7.9），试剂稀释比例和反应时间需通过实验确定。在大多数情况下，我们采用荧光底物 1/500 稀释，反应时间为 10 分钟。最后用 1× PBS 洗涤 3 次，每次 10 分钟。
    注 *： 后固定是免疫-FISH 中的关键步骤，需谨慎优化。后固定越强，免疫荧光信号越好，但 DNA-FISH 效率越低。
  7. 从甲醇-乙酸步骤（步骤 6.3）开始继续进行 DNA-FISH。免疫-DNA-FISH 的总时长通常为 3 天，其中第一抗体孵育过夜。

9. 联合免疫荧光的双 DNA-RNA FISH

参见图1中的橙色框以了解概览。

首先进行RNA-FISH，然后进行免疫荧光，最后进行DNA-FISH。如果免疫荧光采用酪胺反应检测，则关键在于使用H2O2彻底淬灭RNA-FISH步骤中残留的HRP活性，并验证淬灭效果是否充分。可通过使用一张未加一抗的切片作为"无一抗"对照来完成此验证。

由于基于乙醇的脱水步骤对某些溶剂敏感的蛋白质具有破坏作用，因此该步骤可能抑制免疫荧光。若如此，可采用替代方案进行RNA-FISH，详见下文步骤9.3。

  1. 开始前准备以下溶液：

    含 2 mM RVC 的 50% 甲酰胺 1x PBS 溶液
     
  2. 第 1 天，制备 RNA-FISH 探针，并按照双联 RNA-FISH 操作进行，直至 H2O2 淬灭步骤（步骤 7.2）。
  3. 情况 1：乙醇脱水后免疫荧光染色仍有效：按上述步骤 7.3–7.9 继续进行 RNA-FISH。然后进入下文的步骤 9.6。
  4. 情况 2：乙醇处理会阻碍免疫荧光染色：将载玻片置于设定为 65 °C 的载玻片加热器上的湿盒中，用含有 50% 甲酰胺、1x PBS 和 2 mM RVC 的预杂交溶液孵育 1.5 小时。吸去预杂交溶液，按照步骤 7.4 和 7.5 滴加 80 µl 杂交溶液。然后按照上述步骤 7.6–7.9 进行 RNA-FISH 杂交与检测（第 2 天和第 3 天）。
  5. 第 2 天，在完成 RNA-FISH 后，从去封闭步骤开始进行免疫-DNA-FISH（参见步骤 6.2）。然后按照上述步骤 8.2–8.6 进行免疫-DNA-FISH 操作。

10. 载玻片封片与成像

  1. 开始前准备以下溶液：

    0.5 μg/ml Hoechst 33342 溶于 1x PBS 中
     
  2. 用 DAPI 或 Hoechst 33342* 在 1x PBS 中以 0.5 µg/ml 浓度染色细胞核 10 分钟。用 1x PBS 洗涤 3 次，每次 10 分钟。
    注意 *：注意事项。 如果其中一种检测系统使用荧光蓝色染料，则不要使用 DAPI 或 Hoechst。应改用发射光谱位于远红波长范围的荧光 DNA 染料，例如 Topro3。
  3. 尽可能吸尽载玻片上的液体。在载玻片一端滴加 80 µl 含抗荧光淬灭剂的封片剂。用高质量光学盖玻片（n°1.5 玻璃）覆盖组织切片。用镊子夹住盖玻片一端，缓慢放下，使封片剂均匀覆盖切片，避免产生气泡。
  4. 用指甲油封边，并将载玻片置于暗盒中，于 4 °C 保存。
  5. 直接观察潜伏性 HSV-1 基因组的 DNA-FISH 信号时，需使用 40X 或更高倍率的油浸物镜，且具有高数值孔径（例如 40X N.A 1.1、60X–63X N.A 1.4、100X N.A 1.3），激发光源至少应相当于 100 W 汞灯。建议使用近五年内厂商提供的高效透射显微镜（参见设备列表）。共聚焦显微镜可通过薄层切片或光谱成像等技术降低组织自发荧光带来的背景干扰，从而获得更清晰的图像。

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结果

经过数月的广泛测试，我们发现基于加热的化学去封闭处理可使潜伏的HSV-1基因组暴露，从而适用于荧光原位杂交（fluorescent in situ hybridization）。在此过程中，我们尝试了多种去封闭方法，但仅基于加热的处理（即在微波炉中将切片加热至接近沸腾的温度）显示出有效。随后，我们测试了多种常用于免疫组织化学（IHC）和电子显微镜中抗原表位修复的盐缓冲液31,32，包括0.01 M pH 6.0柠檬酸盐缓冲液（我们在所有研究中均使用该缓冲液）、1× PBS、1 mM EDTA、0.1 M Tris-HCl pH 7.4以及蒸馏水。尽管EDTA缓冲液倾向于损伤组织，但其余所有缓冲液均适用于HSV-1的检测，其信号表现为神经元细胞核内单个或多个斑点（图2A；需注意这些组织具有高度自发荧光，部分图像中表现为细胞质内的均匀信号）。在我们的实验条件下，柠檬酸盐缓冲液始终能在不损伤组织的前提下提供良好的信号，因此被选为常规实验方案中的首选缓冲液。

使用直接标记的Cy3-DNA探针（由克隆...

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讨论

本文所述方案可用于检测小鼠神经组织切片中神经元内的HSV-1潜伏基因组。由于缺乏检测HSV-1基因组DNA的有效方法，目前对调控病毒基因表达通路的理解仍十分有限 原位 在神经组织内，基因组拷贝数及感染神经元比例的信息主要来源于对解离神经元的PCR分析11,12在阐明宿主细胞核结构在HSV-1潜伏感染中的作用时，我们旨在通过DNA-FISH技术确定潜伏感染小鼠神经元细胞核内HSV-1基因组的定位。我们测试了多种DNA-FISH实验方案及组织处理方法，发现基于加热的处理方式效果最佳。 "表位去封闭" 作为病毒DNA-FISH检测的关键步骤。该处理方法通常用于免疫组织化学中揭示石蜡包埋切片中的蛋白质表位。尽管该技术在病理学领域几乎被普遍采用，但在DNA-FISH中并未常规使用。尽管已有大量研究支持该技术可在光学显微镜水平保持组织形态，使用者仍应针对其特定的生物系统设置适当的对照以验证此点。38在我们的实验中，其他去封闭方法（如蛋白酶处理）均未能实现HSV-1 DNA的检测，而使用不同缓冲液进行基于加热的去封闭处理则 consistently 使HSV-1潜伏期基因组...

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披露

作者声明不存在竞争性财务利益。

致谢

感谢 N. Sawtell（美国俄亥俄州辛辛那提儿童医院医学中心）、S. Efstathiou（英国剑桥大学）和 James Hill（美国路易斯安那州立大学健康科学中心，新奥尔良）分别提供了 HSV-1 感染的小鼠和兔子样本及相关试剂；感谢 H. Masumoto（日本千叶县香取 DNA 研究所）和 S. Khochbin（法国格勒诺布尔阿尔伯特·博尼奥特研究所）在研究讨论中提供的帮助。

本工作由法国国家科学研究中心（CNRS）（ATIP项目，资助对象：PL，http://www.cnrs.fr）和法国国家研究局（ANR）（项目编号：ANR-05-MIIM-008-01，CENTROLAT）的资助项目支持。 http://www.agencenationale-recherche.fr），FINOVI基金会（http://www.finovi.org/:fr:start），里昂大学 LabEX DEVweCAN（ANR-10-LABX-61）项目 "未来投资" （由法国国家研究局ANR运营的ANR-11-IDEX-0007）http://www.agence-nationale-recherche.fr），法国癌症研究协会（ARC-7979 和 ARC-4910， http://www.arc-cancer.net），法国抗癌联盟（LNCC， http://www.ligue-cancer.net）以及INCa（EPIPRO项目， http://www.e-cancer.fr）。FC 和 PL 是法国国家科学研究中心（CNRS）的研究人员。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Balb/c 小鼠Janvier，法国6 周龄雌性
HSV-1 毒株SC16 毒株（野生型）详见 Labetoule, M. 等人 Invest. Ophthalmol. Vis. Sci 44, 217–225 (2003)，了解 HSV-1 毒株及病毒储备液制备的详细信息。
盐酸氯胺酮SigmaK2753腹腔注射含盐酸氯胺酮（100 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）的溶液
盐酸赛拉嗪SigmaX1251
多聚甲醛（PFA）Sigma158127将 4 g PFA 悬浮于 90 ml 水中。加入 50 µl 1N NaOH，并在 60 °C 水浴中搅拌加热。PFA 约 30 分钟内溶解。加入 10 ml 10x PBS。该溶液可预先配制，并分装于 5 ml 管中，于 -20 °C 保存。注意：应在通风橱中操作。
生理盐水Sigma07982-100TAB-F
1x PBS，pH 7.4（无菌）Life Technologies10010-015 
蔗糖Sigma84100用 1x PBS 配制 20% 蔗糖溶液。
冷冻切片包埋介质 — Tissue-Tek OCT 化合物SAKURA4583 
大容量质粒 DNA 纯化试剂盒Qiagen12462用于纯化含 HSV-1 基因组的 Cosmid 或 BAC 载体，并于 -20 °C 保存
缺口平移试剂盒Roche Applied Sciences10 976 776 001 
Cy3-dCTPGE HealthcarePA53021避光保存
0.5 M EDTASigmaE6758 
G50 Mini 离心柱GE Healthcare27-5330-01 
鲑鱼精子 DNA 10 mg/mlInvitrogen Life Technologies15632-011 
分子生物学级乙醇Sigma87047配制 70% 溶液
鲑鱼精子 DNAInvitrogen Life Technologies15632-011 
分子生物学级甲酰胺SigmaF9037注意：应在通风橱中操作。
HSV-1 生物素标记商用探针 Enzo Life SciencesENZ-40838 
ImmEdge 疏水笔Vector LaboratoriesH-4000 
20x 柠檬酸钠盐溶液（SSC）SigmaS6639用 ddH20 配制 2x SSC 溶液。
Triton X-100SigmaT8787用蒸馏水配制 10% 储备液，4 °C 保存。使用前用 1x PBS 配制 0.5% 溶液。
10 mM 柠檬酸钠 pH 6.0SigmaS1804配制 100 mM 储备液（10x）。称取 10.5 g 柠檬酸（分子量 210.14）。注意：具刺激性和毒性，需佩戴适当口罩和手套。用 1 N NaOH 调节 pH 至 6.0（注意：具刺激性，需戴手套）。用蒸馏水定容至 500 ml。使用前用蒸馏水稀释 10 倍。
乙酸Sigma320099 
分子生物学级甲醇Sigma322415 
硫酸葡聚糖 — 分子量 500,000EuromedexEU0606-A 
Denhardt 溶液（100x）Euromedex1020-A 
橡胶水泥 "FixoGum"Marabut290110000 
DNA 纯化试剂盒  — Qiaquick PCR 纯化试剂盒Qiagen28104 
T7 体外 转录试剂盒Ambion Life TechnologiesAM1314 
生物素-16-UTPRoche Applied Sciences11388908910 
RNA 纯化微型柱Qiagen73404 
核糖核苷酸钒酸复合物New England BiolabsS1402S 
H2O2SigmaH3410用蒸馏水配制 3% 溶液。4 °C 保存并避光。
酵母 tRNAInvitrogen15401011用无 RNA 酶水配制 10 mg/ml 溶液
正常山羊血清InvitrogenPCN5000 
一抗任意供应商结果部分使用的一抗包括：抗小鼠 CENP-A（兔单克隆抗体 C51A7，Cell Signaling Technologies）和抗 ATRX H-300（Santa Cruz Biotechnology）
荧光标记二抗Invitrogen Life Technologies本方案常规使用的荧光二抗为 Alexa Fluor 标记的山羊抗体（IgG H+L）。结果部分使用的抗体为 Alexa Fluor 488 标记的抗兔山羊抗体（货号 A11001）
酪胺信号放大（TSA）试剂盒 — 链霉亲和素 + Alexa Fluor 350（蓝色荧光）Invitrogen Life Technologies#T20937TSA 试剂盒也可从 Perkin Elmer 购得
酪胺信号放大（TSA）试剂盒 — 链霉亲和素 + Alexa Fluor 488（绿色荧光）Invitrogen Life Technologies#T20932
Hoechst 33342Invitrogen Life TechnologiesH3570使用前立即用 1x PBS 配制 0.5 µg/ml 溶液。剩余溶液应丢弃。
22 mm × 50 mm 盖玻片，n°1.5 玻璃Electron Microscopy Sciences72204-04 
含抗淬灭剂的封片介质 — VECASHIELDVector LaboratoriesH-1000其他常规产品包括 Electron Microscopy Science 的 Fluoromount G
Superfrost 玻片FisherScientific12-550-15 
仪器/材料公司货号备注
感染用针头热拉制玻璃微量移液管，定制。
解剖器械Moria，法国显微手术剪和镊子
蠕动泵Cole Palmer InstrumentsEasyload Masterflex
微量注射泵装置（Nano Pump）kdScientificKDS310 
冷冻切片机Leica FranceCM 1510-1 
-80 °C 冰箱Sanyo超低温 -80 °C
家用微波炉 
干浴加热器Eppendorf022670204 
孵育板槽（Slide moat）Boekel Scientific240000 
Coplin 染色缸Dominique Dutscher68512 
染色玻璃容器Dominique Dutscher68506 
荧光显微镜Zeiss结果部分图像使用 Zeiss AxioObserver 显微镜采集，物镜为 40X LD NeoFluor N.A 0.6 和 100X PlanApochromat N.A 1.3。滤光片组 #38、#43 和 #43。HXP 120 荧光光源。Photometrics CoolSNAP HQ2 CCD 相机。信号在较新型的高效显微镜（如 Zeiss AxioImager/AxioObserver 系列、Nikon Ti-E/Ni-E 系列或 Leica DM/DMI6000 系列）上更容易观察到

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HSV-1 检测神经组织分析三叉神经节切片基于热法的抗原修复DNA-RNA-蛋白质三重染色共聚焦显微镜成像病毒基因组定位潜伏病毒感染检测单细胞共检测
通过荧光法检测神经元组织中一种持续性DNA病毒的基因组和转录本 原位 杂交结合免疫染色
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