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方法文章

Drosophila 温度偏好行为及其昼夜节律的设计与分析

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DOI：

10.3791/51097

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2014年1月13日

 ,  , 
1The Visual Systems Group, Division of Pediatric Ophthalmology, Cincinnati Childrens Hospital Medical Center, 2PRESTO, JST

本文内容

摘要

我们近期鉴定出一种新的黑腹果蝇（Drosophila）昼夜节律输出——温度偏好节律（temperature preference rhythm, TPR），即果蝇在白天偏好的温度升高，而在夜间偏好的温度下降。TPR 的调控独立于另一项昼夜节律输出——运动活动节律。本文中 我们描述了黑腹果蝇（Drosophila）TPR 的实验设计与分析方法。

摘要

昼夜节律钟调控着生命的诸多方面，包括睡眠、运动活动和体温（BTR）节律1,2我们最近鉴定出一种新型 果蝇 昼夜节律输出，即温度偏好节律（TPR），其中果蝇在白天偏好的温度升高，夜间则下降 3令人意外的是，体温调节节律（TPR）和运动活动由不同的昼夜节律神经元调控。3. 果蝇 运动活动是一种被广泛研究的行为指标 已知的昼夜节律行为输出，为发现多种保守的哺乳动物昼夜节律钟基因及机制作出了重要贡献4因此，理解温度周期反应（TPR）将有助于揭示迄今未知的分子与细胞昼夜节律机制。本文描述了如何开展并分析TPR实验。该技术不仅可用于解析TPR的分子与神经机制，还能为大脑整合不同环境信号并调控动物行为的基本功能机制提供新的见解。此外，我们近期发表的数据表明，果蝇的TPR与哺乳动物的BTR具有共同特征。3. 果蝇 是变温动物，其体温通常通过行为进行调节。因此，TPR 是一种在这些果蝇中产生节律性体温的策略5-8我们相信，对 黑腹果蝇 TPR 将有助于阐明动物体温调控机制的基础。

引言

温度是一种普遍存在的环境线索。动物会表现出多种行为以避免有害温度并寻找适宜的温度。Drosophila表现出强烈的温度偏好行为6,7。当果蝇被释放到18–32 °C的温度梯度环境中时，它们会避开高温和低温区域，最终在早晨选择25 °C作为其偏好的温度3。高温感受器是一类表达Drosophila瞬时受体电位（TPR）通道TRPA1的热感受神经元，即AC神经元6,9。冷温度感受器位于第三触角节段，因为去除第三触角节段会导致果蝇丧失对低温的回避行为6。最近，TRPP蛋白Brivido（Brv）被鉴定出来10。由于Brv在第三触角节段中表达并介导冷刺激的感知，因此Brv是一种可能的冷感受分子，对温度偏好行为至关重要。综上所述，果蝇利用这两种温度感受器来避开高温和低温，从而找到其偏好的温度。

尽管哺乳动物通过产生热量来调节体温，变温动物通常则使自身体温适应环境温度11。已知某些变温动物表现出昼夜性的温度偏好行为（TPR），这被认为是一种调节其基础体温节律（BTR）的策略12。为了确定果蝇是否表现出TPR，我们在24小时内的多个时间点重复进行了温度偏好行为分析。我们发现，Drosophila 具有昼夜性的TPR，表现为早晨偏好温度较低，傍晚偏好温度较高，其变化模式与人类的基础体温节律（BTR）相似13。

在 Drosophila 中，脑内大约有 150 个生物钟神经元。其中调控运动活动的生物钟神经元被称为 M 和 E 振荡器。然而有趣的是，M 和 E 振荡器并不调控体温节律（TPR）；我们发现，脑内的 DN2 生物钟神经元调控 TPR，但不调控运动活动。这些数据表明，TPR 的调控独立于运动活动。值得注意的是，哺乳动物的体温节律（BTR）也独立于运动活动进行调控。在大鼠中进行的消融研究表明，BTR 由特定的视交叉上核（SCN）神经元控制，这些神经元靶向的是与调控运动活动不同的室旁下区神经元亚群14。因此，我们的数据提示，哺乳动物的 BTR 与果蝇的 TPR 可能在进化上是保守的3，因为果蝇的 TPR 和哺乳动物的 BTR 均表现出依赖于生物钟的体温节律，且这种节律独立于运动活动进行调控。

本文详细描述了如何分析果蝇（Drosophila）中的TPR行为实验。该方法不仅可用于研究TPR的分子机制和神经回路，还可用于探究大脑如何整合不同的环境线索与内在生物钟。

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方案

1. 果蝇的准备

  1. 光暗（LD）实验
    1. 在25 °C、相对湿度40-60%的培养箱中，以12小时光照/12小时黑暗（LD）循环条件饲养果蝇。培养箱内的光照强度约为500-1,000 lux。
    2. 需要两个培养箱才能完成为期24小时的行为检测。两个培养箱均应配备可编程的照明系统，具备开关功能，并且应具有不透光的实心门。即 无玻璃或有机玻璃
      注意：应指定一个培养箱为“白天”培养箱，并设置为12小时光照/12小时黑暗（LD）循环 光照和12小时 暗。第二个培养箱应指定为“夜间”培养箱，其设置与第一个相反，即12小时 12小时黑暗，随后12小时光照 光照。夜间培养箱必须放置在黑暗条件下可进入的房间内，以便于在夜间条件下进行实验时能够方便地接触果蝇。
    3. 将果蝇管置于白天或夜间培养箱中。收集新羽化的果蝇至新管中，每管20–30只，用于实验，并在相同培养箱中继续培养2–3天。
    4. 2-3天后，使用果蝇进行温度偏好行为实验。
      1. 对于白天（ZT 0-12）实验，从白天培养箱中收集果蝇。
      2. 行为实验开始前，立即将收集的果蝇试管从日间培养箱中取出。
      3. 对于夜间（ZT 13-24）实验，从夜间培养箱中收集果蝇。
      4. 行为实验开始前，将收集好的果蝇管从夜间培养箱中取出，用铝箔纸包裹后，置于暗室中红光灯下的盒子内。
        注意：由于夜间实验中的温度偏好行为检测是在黑暗条件下进行的，必须在行为实验结束前避免果蝇暴露于光照。
        注意：实验当天不应让果蝇接触二氧化碳。
  2. 恒定黑暗（DD）实验
    1. DD 日
      1. 进行DD日实验需要额外的培养箱， 我们称之为 "转变" 孵育箱用于本论文的其余部分。过渡孵育箱必须放置在可于黑暗条件下进入的房间内，以便能够方便地获取处于DD条件下的果蝇用于实验。一个过渡孵育箱的光照时间表示例为：光照开启时间为下午1点至晚上7点，关闭时间为晚上7点至次日下午1点（图 1).
      2. 收集在白天培养箱中饲养的果蝇。在13:00至19:00光照开启期间，将果蝇培养管放入过渡培养箱中。通过此方式，果蝇可充分接受光照直至19:00，此时光照关闭。
      3. 次日13点前，在避光条件下，将果蝇小瓶从转换用培养箱中取出，用铝箔包裹后放入盒中，将该盒在任意培养箱中继续放置一天。
    2. DD 夜间
      1. 在红光灯下于黑暗中收集在夜间培养箱中饲养的果蝇。或者，在夜间培养箱的灯光开启时额外收集一批果蝇。
      2. 用铝箔将收集的样品瓶在关灯时包裹起来并置于暗处，并将样品瓶放入盒子中。将盒子置于任何培养箱中继续孵育两天图 1B).
        注意：由于夜间实验中的温度偏好行为检测是在黑暗条件下进行的，必须在行为实验结束前避免果蝇暴露于光照。
  3. 恒定光照（LL）实验
    1. LL Day
      1. 进行持续光照（LL）实验时需要额外的培养箱。该培养箱维持LL条件（25 °C，800 lux），光照持续开启。
      2. 收集在光照培养箱中饲养的果蝇。可在其生活周期的任何时间将果蝇培养管移至持续光照培养箱中 "天".
    2. LL 夜间
      1. 收集在夜间培养箱中饲养的果蝇。在夜间培养箱光照开启期间，将果蝇培养管转移至恒光培养箱中。
        注意：例如，夜间培养箱的光照在早上7点关闭。需在早上7点前将果蝇培养管从夜间培养箱转移至持续光照培养箱，并在持续光照培养箱中继续培养4天。
        注意：在持续光照（LL）条件下第4天，运动活动的节律性振荡消失15,16，而TPR仍持续维持 3.

2. 温度偏好行为实验的装置

  1. 将一块有机玻璃盖板（29 cm × 19.2 cm）（图 4）放置在铝板上。
  2. 监测铝板与盖板之间的空气温度。在其中一个通道内，将六个温度探头固定于盖板内侧的不同位置（图 2）。
    注意：确保探头不接触铝板或有机玻璃盖板。空气温度应设置为18–32 °C的梯度。
  3. 将装置置于温度为25 °C、相对湿度为65–75%的环境室中。该环境室需完全屏蔽外界光线。通常情况下，环境室配备有风扇以维持恒定的温度和湿度。
    注意：风扇产生的气流可能干扰装置上的稳定温度梯度。为避免此问题，我们使用一张透明薄板覆盖装置周围的区域。
  4. 准备温度计和湿度计，用于检测环境室内的温度和湿度。
    注意：Drosophila的温度偏好受光照影响3。装置表面应接受均匀且相同强度的光照。本实验所用环境室光源的光照强度约为800 lux。
    注意：行为实验完成后，将连接至CO2气罐或供气装置的导管放置于装置顶部的小孔附近，以麻醉并清除果蝇。

3. 仪器使用前的准备

  1. 开启装置至少 30 分钟，以在培养皿表面正确建立温度梯度（图 3）。
  2. 用防水剂涂抹行为学装置的盖子，防止果蝇攀爬盖子的壁面或顶部。擦去多余的防水剂，并将盖子静置 25–30 分钟使其干燥。
  3. 清除铝板上的任何冷凝水。将有机玻璃盖子放置在铝板上，并用六个 C 型夹固定（图 2）。
    注意：必须确保盖子密封良好，必要时可使用双面胶带。
  4. 将盖子静置至少 15 分钟。铝板与盖子之间会形成 18–32 °C 的空气温度梯度。

4. 温度偏好行为检测

  1. 通过装置盖板每条通道中心的小孔，将果蝇装入铝板与聚碳酸酯盖板之间的空间（图 2 和 4）。用盖玻片封住小孔，防止果蝇逃逸。
  2. 在黑暗条件下，关闭环境室内的所有光源。放置果蝇时可使用红光灯照明。确保在行为实验结束前，果蝇仅暴露于红光灯下，不接触其他任何光源。
  3. 每次试验使用 20–25 只成年果蝇，且不得在后续试验中重复使用。行为检测持续 30 分钟。可拍摄几张照片，可使用闪光灯，也可不用。实验过程中注意避免产生较大噪音或突然动作。
  4. 记录装置上全部六个探头的温度。同时记录环境室的温度和湿度。
  5. 用二氧化碳气体将装置中的果蝇麻醉，松开夹具，取下聚碳酸酯盖板，并将果蝇从铝板上移除。每次实验后，果蝇均应丢弃。擦去铝板上的冷凝水或湿气。将盖板重新盖好，并用夹具夹紧，为下一次实验做好准备。
  6. 为了全面反映全天的温度偏好情况，将 24 小时分为八个时间段，白天四个，夜晚四个。例如，我们采用以下 ZT 或 CT 时间段：1–3、4–6、7–9、10–12、13–15、16–18、19–21 和 22–24。
    注意：由于在光照开启（ZT0）或关闭（ZT12）后立即可能出现由遮蔽效应引起的表型变化，因此我们不在这几个时间段（ZT 或 CT 0–1、11.5–13 和 23.5–24）检测温度偏好行为。每个时间段至少需进行五次重复试验，以确保结果具有统计学意义。

5. 数据分析

  1. 根据放置在亚克力盖板顶部和底部边缘的两把尺子，确定温度探头的位置，然后按如下方式计算温度梯度：图 2A).
  2. 温度探针之间的温度梯度估计为线性。根据温度探针的位置及其记录的相应温度，在图片的适当位置绘制代表每一度温度的线条。计数该数量 每度范围内所处果蝇的数量 间隔。排除盖子的墙壁或天花板上的任何果蝇。
  3. 计算每条泳道中每个温度范围内果蝇的百分比。通过将每个温度区间的果蝇百分比与其对应温度的乘积相加，计算出平均偏好温度，如下所示：
    %的果蝇 × 18.5 °C + %的果蝇 × 19.5 °C + %的果蝇 × 20.5 °C + … + %的果蝇 × 31.5 °C + %的果蝇 × 32.5 °C
  4. 计算每个时区的平均偏好温度：温度偏好行为实验进行如下 >每个时间区（ZT 1-3、4-6、7-9、10-12、13-15、16-18、19-21 和 22-24）内重复5次。为计算每个时间区的平均偏好温度，将每次试验的偏好温度均值进行平均。标准误（s.e.m.）误差线表示各次试验之间的误差。

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结果

温度偏好节律的一个示例如图5所示。如果行为实验操作成功，果蝇应表现出温度偏好节律（TPR），即在早晨偏好较低温度，而在傍晚偏好较高温度。在一天的过程中，应观察到温度偏好在白天上升约1–1.5 °C，这一现象与遗传背景无关，因为我们已证明w1118、yw和Canton S品系的果蝇在白天表现出相似的温度偏好3。

白天和夜间DD实验示意图；培养箱光照/黑暗时间安排，转移步骤已标出。
图1. 果蝇在DD日...

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讨论

本文详细介绍了温度偏好行为装置及TPR行为的分析方法。Drosophila表现出显著、稳定且可重复的生物钟调控TPR特征。然而，我们的数据表明，至少有两个因素——环境光和年龄——会显著干扰TPR行为表型。

我们观察到光显著影响黑腹果蝇（Drosophila）的温度偏好。这一现象与以下事实一致：在明暗循环（LD）条件下饲养的w1118果蝇在白天偏好的温度高于在持续黑暗（DD）条件下饲养的果蝇，尽管在LD和DD条件下温度偏好的节律性变化仍然保持3。因此，光对果蝇温度偏好的影响独立于昼夜节律钟。由于目前尚不清楚需要多强的光强度以及何种机制调控这种光依赖性的温度偏好，我们在实验中采用相同的光强度（约500–1,000 lux）以获得可重复的结果。

果蝇的年龄也会影响其温度偏好。我们避免使用第1天的果蝇，因为第1天果蝇（孵化后一天）的温度偏好反应（TPR）表型具有变异性。尽管第4天及更年长的果蝇表现出稳定的TPR行为，但它们比2至3天龄的果...

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致谢

我们感谢 Aravinthan Samuel 博士和 Marc Gershow 博士，他们协助开发了行为实验装置的初始版本，以及 Matthew Batie 对该装置进行了改进。本研究得到了辛辛那提儿童医院信托基金、JST/PRESTO、March of Dimes 以及美国国立卫生研究院（NIH）R01 GM107582 项目对 F.N.H. 的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
明亮实验室 Jr. 安全灯Amazon#B00013J8UY暗室用红光灯
Rain XSOPUS 产品公司防水剂：用于涂覆聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）盖板
C 型夹钳Home Depot
温湿度计Fisher15-077-963
帕尔贴器件TE Technology, Inc.HP-127-1.4-1.15-71P
温度计FlukeFluke 52II
台式控制器Oven Industries5R6-570-15R 和 5R6-570-24R
温度传感器探头Oven IndustriesTR67-32
通用 480 瓦 ATX 电源计算机散热系统
MCR220-QP-RES 双 120 毫米带储液罐散热器 Swiftech计算机散热系统
MCP350 直列式 12V 直流泵Swiftech计算机散热系统
MCW50 显卡液冷散热器Swiftech计算机散热系统
Scythe Kaze-Jyuni SY1225SL12SH 风扇Crazy PC计算机散热系统

参考文献

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温度偏好节律果蝇生物钟温度梯度实验帕尔帖装置设置果蝇行为分析昼夜节律神经元定位温度偏好测量环境控制方案数据采集方法神经环路研究
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