Drosophila 温度偏好行为及其昼夜节律的设计与分析

摘要

我们近期鉴定出一种新的黑腹果蝇（Drosophila）昼夜节律输出——温度偏好节律（temperature preference rhythm, TPR），即果蝇在白天偏好的温度升高，而在夜间偏好的温度下降。TPR 的调控独立于另一项昼夜节律输出——运动活动节律。本文中 我们描述了黑腹果蝇（Drosophila）TPR 的实验设计与分析方法。

摘要

昼夜节律钟调控着生命的诸多方面，包括睡眠、运动活动和体温（BTR）节律^1,2我们最近鉴定出一种新型 果蝇 昼夜节律输出，即温度偏好节律（TPR），其中果蝇在白天偏好的温度升高，夜间则下降 ³令人意外的是，体温调节节律（TPR）和运动活动由不同的昼夜节律神经元调控。³. 果蝇 运动活动是一种被广泛研究的行为指标 已知的昼夜节律行为输出，为发现多种保守的哺乳动物昼夜节律钟基因及机制作出了重要贡献⁴因此，理解温度周期反应（TPR）将有助于揭示迄今未知的分子与细胞昼夜节律机制。本文描述了如何开展并分析TPR实验。该技术不仅可用于解析TPR的分子与神经机制，还能为大脑整合不同环境信号并调控动物行为的基本功能机制提供新的见解。此外，我们近期发表的数据表明，果蝇的TPR与哺乳动物的BTR具有共同特征。³. 果蝇 是变温动物，其体温通常通过行为进行调节。因此，TPR 是一种在这些果蝇中产生节律性体温的策略^5-8我们相信，对 黑腹果蝇 TPR 将有助于阐明动物体温调控机制的基础。

引言

温度是一种普遍存在的环境线索。动物会表现出多种行为以避免有害温度并寻找适宜的温度。Drosophila表现出强烈的温度偏好行为^6,7。当果蝇被释放到18–32 °C的温度梯度环境中时，它们会避开高温和低温区域，最终在早晨选择25 °C作为其偏好的温度³。高温感受器是一类表达Drosophila瞬时受体电位（TPR）通道TRPA1的热感受神经元，即AC神经元^6,9。冷温度感受器位于第三触角节段，因为去除第三触角节段会导致果蝇丧失对低温的回避行为⁶。最近，TRPP蛋白Brivido（Brv）被鉴定出来¹⁰。由于Brv在第三触角节段中表达并介导冷刺激的感知，因此Brv是一种可能的冷感受分子，对温度偏好行为至关重要。综上所述，果蝇利用这两种温度感受器来避开高温和低温，从而找到其偏好的温度。

尽管哺乳动物通过产生热量来调节体温，变温动物通常则使自身体温适应环境温度¹¹。已知某些变温动物表现出昼夜性的温度偏好行为（TPR），这被认为是一种调节其基础体温节律（BTR）的策略¹²。为了确定果蝇是否表现出TPR，我们在24小时内的多个时间点重复进行了温度偏好行为分析。我们发现，Drosophila 具有昼夜性的TPR，表现为早晨偏好温度较低，傍晚偏好温度较高，其变化模式与人类的基础体温节律....

方案

1. 果蝇的准备

1. 光暗（LD）实验
   1. 在25 °C、相对湿度40-60%的培养箱中，以12小时光照/12小时黑暗（LD）循环条件饲养果蝇。培养箱内的光照强度约为500-1,000 lux。
   2. 需要两个培养箱才能完成为期24小时的行为检测。两个培养箱均应配备可编程的照明系统，具备开关功能，并且应具有不透光的实心门。即 无玻璃或有机玻璃
      注意：应指定一个培养箱为“白天”培养箱，并设置为12小时光照/12小时黑暗（LD）循环 光照和12小时 暗。第二个培养箱应指定为“夜间”培养箱，其设置与第一个相反，即12小时 12小时黑暗，随后12小时光照 光照。夜间培养箱必须放置在黑暗条件下可进入的房间内，以便于在夜间条件下进行实验时能够方便地接触果蝇。
   3. 将果蝇管置于白天或夜间培养箱中。收集新羽化的果蝇至新管中，每管20–30只，用于实验，并在相同培养箱中继续培养2–3天。
   4. 2-3天后，使用果蝇进行温度偏好行为实验。
      1. 对于白天（ZT 0-12）实验，从白天培养箱中收集果蝇。
      2. 行为实验开始前，立即将收集的果蝇试管从日间培养箱中取出。
      3. 对于夜间（ZT 13-24）实验，从夜间培养箱中收集果蝇。
      4. 行为实验开始前，将收集好的果蝇管从夜间培养箱中....

结果

温度偏好节律的一个示例如图5所示。如果行为实验操作成功，果蝇应表现出温度偏好节律（TPR），即在早晨偏好较低温度，而在傍晚偏好较高温度。在一天的过程中，应观察到温度偏好在白天上升约1–1.5 °C，这一现象与遗传背景无关，因为我们已证明w¹¹¹⁸、yw和Canton S品系的果蝇在白天表现出相似的温度偏好³。

图1. 在DD白天条件下果蝇制备的示意图。.......

讨论

本文详细介绍了温度偏好行为装置及TPR行为的分析方法。Drosophila表现出显著、稳定且可重复的生物钟调控TPR特征。然而，我们的数据表明，至少有两个因素——环境光和年龄——会显著干扰TPR行为表型。

我们观察到光显著影响黑腹果蝇（Drosophila）的温度偏好。这一现象与以下事实一致：在明暗循环（LD）条件下饲养的w¹¹¹⁸果蝇在白天偏好的温度高于在持续黑暗（DD）条件下饲养的果蝇，尽管在LD和DD条件下温度偏好的节律性变化仍然保持³。因此，光对果蝇温度偏好的影响独立于昼夜节律钟。由于目前尚不清楚需要多强的光强度以及何种机制调控这种光依赖性的温度偏好，我们在实验中采用相同的光强度（约500–1,000 lux）以获得可重复的结果。

果蝇的年龄也会影响其温度偏好。我们避免使用第1天的果蝇，因为第1天果蝇（孵化后一天）的温度偏好反应（TPR）表型具有变异性。尽管第4天及更年长的果蝇表现出稳定的TPR行为，但它们比2至3天龄的果.......

材料

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温度计	Fluke	Fluke 52II
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