双色时间门控受激发射损耗（STED）纳米显微镜观察免疫突触

摘要

本文展示了在玻璃表面重现自然杀伤细胞（NK细胞）细胞毒性免疫突触，并通过双色STED超分辨显微镜对其进行成像的实验方案。利用该方法，我们可获得突触蛋白和细胞骨架的亚100 nm分辨率图像。

摘要

自然杀伤细胞通过形成严格调控且高度精确的免疫突触（IS），以裂解病毒感染细胞或肿瘤细胞。动态的肌动蛋白重组对自然杀伤细胞的功能及免疫突触的形成至关重要。传统上，对突触处F-肌动蛋白的成像依赖共聚焦显微镜，但光的衍射极限限制了包括共聚焦在内的荧光显微镜的分辨率，约为200 nm。近年来成像技术的进步推动了突破衍射极限的超分辨率成像技术的发展。为了可视化免疫突触处的F-肌动蛋白结构，我们通过将自然杀伤细胞黏附于玻璃表面的激活受体上，重建其细胞毒突触。随后，我们采用双色受激发射损耗显微镜（STED）对目标蛋白进行成像。该方法可在突触处实现<80 nm的分辨率。本文中，我们描述了样本制备步骤以及利用双色STED纳米显微镜对NK细胞免疫突触处F-肌动蛋白进行成像的图像采集过程。我们还展示了使用Leica SP8软件和时间门控STED技术优化图像采集的方案。最后，我们采用Huygens软件对图像进行去卷积后处理。

引言

免疫突触是由信号蛋白和细胞骨架成分构成的复杂微环境。杀伤性突触最初被描述为具有 "靶心" 具有环状肌动蛋白和黏附分子围绕中央分泌区域的结构^1-4然而，我们现在知道，它由微小的活性信号域组成，这些信号域的功能依赖于细胞骨架持续的动态重组^5-11我们目前所掌握的关于突触的许多信息都源于显微镜技术，而免疫学家一直是前沿成像技术的早期采用者。

其中一种新兴技术是超分辨率显微镜。传统的光学显微镜在空间分辨率上受到光的衍射极限限制，该极限使包括共聚焦显微镜在内的所有荧光显微镜的分辨率下限约为 200 nm。近年来，已发展出若干能够突破衍射极限实现更高分辨率的技术，包括受激发射损耗显微镜（STED）、结构光照明显微镜（SIM）、随机光学重建显微镜（STORM）和光激活定位显微镜（PALM）。这些技术在其他文献中已有详细综述^12-15，但下文将简要概述。每种系统以独特的方式实现亚衍射极限的分辨率，因此，超分辨率技术的选择应根据具体实验及所研究的实验体系而定。

利用高强度环形耗尽光束实现STED超分辨率成像，该光束在激发后选择性地"关闭"每个目标荧光分子周围的荧光，从而实现突破衍射极限的荧光显微成像^16-18。STED的一个优势是图像采集速度快，且所需的后期处理相对较少。虽然染料的选择取决于耗尽光束的光谱位置（在商用系统中该位置为592 nm），但已有多种 commercially available 的染料可供使用，使得两种荧光分子的组合成像成为可能。此外，诸如GFP等常用的荧光报告分子也可用于成像，因而能够开展活细胞实验^19,20。

我们先前已使用受激辐射损耗显微技术（STED）来识别并量化自然杀伤细胞（NK细胞）用于脱颗粒的F-肌动蛋白低密度区域^21,22。我们认为，STED是成像免疫突触的良好选择，因其具有相对灵活的荧光染料可用性，并且在x-y轴方向上的分辨率有显著提升。此外，在本实验所使用的商用STED系统中，采用高速（12,000 Hz）共振扫描器可实现快速图像采集，同时对样品的损伤最小。染料选择灵活性有限被认为是STED的一个缺点¹²，但使用多种市售荧光染料进行双色STED成像相对简便。将STED与激光扫描共聚焦显微镜整合，还可实现STED与共聚焦成像的联合使用，因此尽管STED仅限于两个通道，其他结构仍可通过共聚焦成像以约200 nm的分辨率进行观察（E. Mace，未发表观察结果）。尽管本文描述了STED在免疫细胞成像中的应用，但该技术也已广泛应用于多种细胞类型（包括神经细胞）以及多种细胞结构的可视化研究^23-26。

SIM 采用不同的方法来生成超衍射极限的图像。通过可视化已知的周期性激发模式，随后经过数学变换，可以获得关于待研究未知结构的信息²⁷。这使得横向分辨率提高至约 100 nm^28,29。SIM 的优势在于其与所有标准共聚焦染料和探针兼容，但缺点是图像采集速度较慢，且需要长时间的后期处理¹²。这也限制了其在活细胞成像中的应用。

最后，可通过荧光分子的随机光开关实现超分辨率成像。该策略被应用于光激活定位显微技术（photo-activated localization microscopy, PALM）和随机光学重建显微技术（stochastic optical reconstruction microscopy, STORM）。通过连续采集多帧相机图像，并对随机激活的分子进行定位，这些分子被依次开启 "开启" 和 "关闭" 随着时间的推移，通过累积的图像帧可生成分辨率为20-30 nm的图像^30-32 这种分辨率的代价是获取图像所需的时间。

本文详细展示了在受激辐射损耗（STED）显微镜中制备和成像双色样品的实验方案。该系统采用脉冲式可调谐白光激光器进行激发。由于激发光为脉冲形式，可实现时间门控检测，从而进一步提高分辨率。此外，系统配备了钆镓砷杂化（HyD）探测器，其灵敏度高于传统的光电倍增管，因而可降低激光功率需求。STED的耗尽光为连续施加，波长设定为592 nm，这决定了可用于双色STED的染料选择。常用的染料组合通常包括一种可被488 nm光激发的染料（如Alexa Fluor 488、俄勒冈绿、DyLight绿色染料或Chromeo 488）和一种可被458 nm光激发的染料（如Pacific Orange或Horizon V500）。因此，尽管两种染料的发射波长范围相近（均可被耗尽激光作用），但其激发波长不同。借助可调谐的白光激光器和可调谐探测器，可在最大程度上增强信号并消除光谱重叠，操作相对简便。因此，我们已成功应用多种市售染料组合，例如Pacific Orange与Alexa Fluor 488（本文所用）。  本实验方案主要针对人自然杀伤（NK）细胞的评估，因为这一直是我们实验室的研究重点。  在本示例中，我们特别采用了NK92细胞系，这是我们在实验工作中长期常规使用的细胞系^21,33。

方案

1. 用抗体包被盖玻片

1. 将 30 ml RPMI 10% FCS 培养基和 1 ml BD Cytofix/Cytoperm 在 37 °C 预热。
2. 在磷酸盐缓冲液（PBS）中配制浓度为 5 μg/ml 的纯化抗体溶液。激活 NK92 细胞系时，建议使用抗-CD18  和抗-NKp30 抗体。
   1. 使用 PAP 笔在 #1.5 盖玻片上为每种实验条件标记一个约硬币大小的圆圈。对于双色实验，应设置四种条件：未染色、双染色以及两种单染色条件。在每个区域加入 200 µl 抗体溶液，37 °C 孵育 30 分钟。
   2. 在室温下，将每张盖玻片轻轻浸入装有 50 ml PBS 的 50 ml 锥形管中进行洗涤。应在加细胞前立即进行洗涤，并注意避免盖玻片上的抗体干燥。

2. 在盖玻片上激活自然杀伤细胞；固定与通透处理

1. 按每种条件分离 5 × 10⁵ 个 NK92 细胞。离心后弃去上清液。用步骤 1.1 中预热的培养基 10 ml 洗涤一次。再次离心并弃去上清液。
   1. 将细胞重悬于步骤 1.1 中预热的培养基中，浓度为 2.5 × 10⁶/ml。
   2. 轻轻将 200 µl 加至第 1.2.1 节中形成的区域中央。在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 20 分钟。（注意：可根据所研究的生物学功能适当延长或缩短孵育时间。对于 NK 细胞颗粒极化，20 分钟已足够）。
2. 细胞孵育结束后，将每个盖玻片轻轻浸入装有 50 ml 室温 PBS 的 50 ml 锥形管中，进行轻柔洗涤。
3. 向 1 ml 步骤 1.1 中预热的固定/破膜溶液中加入 1 µl Triton X-100，并充分涡旋混匀。向细胞中加入 200 µl 固定/破膜缓冲液（步骤 2.3），进行固定和透化处理。室温避光孵育 10 分钟。

3. 染色细胞

1. 制备染色缓冲液：磷酸盐缓冲液（PBS），1% BSA，0.1% 皂苷。
   1. 在 200 µl 染色缓冲液中配制一抗溶液（见步骤 3.1）。（注意：使用前应对抗体进行滴定）。避免使用与盖玻片包被所用物种相同的宿主来源的一抗（步骤 1.2）。STED 成像时也应避免使用链霉亲和素-生物素连接系统。
   2. 参照第 2.3.1 节，用 50 ml 染色缓冲液轻柔洗涤盖玻片。用棉签轻拭 PAP 笔画区域边缘，去除多余缓冲液。加入在第 3.1.1 节中配制的一抗溶液。室温避光孵育 30 分钟。（建议：将盖玻片置于载片盒中，并在盒内放置湿润的纸巾以维持湿度）。
2. 在 200 µl 染色缓冲液中配制二抗溶液。推荐使用的荧光染料包括 Alexa Fluor 488、Pacific Orange 和 V500。通常，1:200 的稀释比例适用于 STED 成像。
   1. 用 50 ml 染色缓冲液轻柔洗涤盖玻片。用棉签轻拭 PAP 笔画区域边缘，去除多余缓冲液。加入二抗溶液。室温避光孵育 30 分钟。
3. 对其他目标蛋白重复洗涤和染色步骤。若使用鬼笔环肽（Phalloidin）检测 F-肌动蛋白，可将其与二抗同时孵育，通常稀释比例为 1:200。

4. 将盖玻片封固在载玻片上

1. 准备封片剂。注意：推荐使用 Prolong 或 Prolong Gold。必须避免使用 VECTASHIELD，因其与 STED 不兼容。若使用 Phalloidin，则必须避免使用 2,2-thiodioethanol。Mowiol 可以接受。
2. 在载玻片上滴加约 10–20 µl 封片剂。将盖玻片（细胞面朝下）翻转并轻轻封片，注意避免产生气泡。封片后将载玻片在室温下孵育 24 小时（盖玻片朝上），然后进行成像。
3. 用指甲油密封盖玻片边缘。

5. 实验设置

1. 启动所需的激光器和软件。以100%功率启动STED耗尽激光器。对STED激光器进行准直，对于商用系统而言，此步骤通常为自动化程序。
2. 使用目镜在显微镜下对样品进行聚焦，首先从单标记对照样品开始。

6. 参数优化

1. 扫描第一个通道，并优化激光功率、激发光束位置和检测器范围。如果可能，避免增益超过>100。在共聚焦模式下采集图像以优化设置。使用行平均和/或帧平均可提高分辨率。检查是否存在像素饱和。注意：在共聚焦成像中允许一定程度的饱和，因为后续应用STED技术会降低发射光强度。对于STED成像，理想的像素尺寸应低于30 nm，但更小的像素尺寸可获得更高的分辨率。成像区域的大小将决定像素尺寸的下限。更小的像素尺寸可能会增加光漂白。
   1. 施加STED耗尽光束并采集图像，起始耗尽激光功率设为50%。若观察到分辨率有所提升，可进一步增加耗尽激光功率。在此阶段，可能需要调整激发激光功率、行平均和/或增益。
   2. 应用时间门控以降低背景信号（最小值0.3纳秒）。调整参数直至分辨率优于共聚焦成像。分辨率可通过估算半高全宽（FWHM）来近似判断。 该值表示在感兴趣结构上绘制线轮廓时，高斯峰强度达到最大值一半处的宽度，是估算分辨率的常用方法。
   3. 当第一个通道的成像效果满意后，启动第二个序列进行顺序扫描。通常建议优先扫描长波长荧光染料。对第二个通道重复步骤6.1。
2. 通过使用两种扫描序列对单标记对照样本成像，确认无光谱重叠。软件中的光谱解混功能可校正轻微的光谱重叠，但应尽可能避免出现光谱重叠。

7. 图像采集

1. 获取图像。对于定量成像，建议每种条件下至少获取 20 张图像。  然而，具体数量应根据实验问题并结合样本量计算等统计学方法来确定。保存实验。

8. 去卷积

1. 使用反卷积软件或批量处理程序打开文件。通过软件检查每个通道的参数，特别确认每个通道的激发光谱和发射光谱、STED耗尽发射以及成像方向（若图像为三维，则需确认为向上或向下）。
2. 使用反卷积向导进行反卷积。默认设置通常已足够，但信噪比（SNTR）会因不同荧光染料而异，需针对每个通道和每个实验单独确定。

结果

显然，超分辨率成像的一个主要目标是优于传统的共聚焦显微镜成像。然而，存在一些常见陷阱，可能导致分辨率未达到最佳效果，因此需要对每个实验进行单独优化。在我们的代表性实验中，我们对通过抗体结合于玻璃表面而激活的自然杀伤（NK）细胞中的F-肌动蛋白网络进行成像。STED成像相对于共聚焦成像未能实现分辨率提升的常见原因及相应纠正措施如下：

1. 欠采样（图1a）。这可能导致图像颗粒状和像素信息丢失，如F-actin丝状结构分辨率差所示。通常可通过增加线平均或帧平均来校正此问题。
2. 漂白和/或过采样（图1b）。这可能是由于过度的线平均导致像素驻留时间过长所致。或者，也可能是成像前对图像扫描过度所致，包括耗尽激光使用过度。这种情况常导致图像模糊或不清晰。可通过在采集前仅最小程度地扫描目标区域来校正，或在可能的情况下提高激光扫描速度。如果问题仍然存在，可降低耗尽激光的功率。

通过优化像素驻留时间、激发激光功率和耗尽激光功率之间的平衡，可以获得分辨率更高且信息充足的图像（图 1c）。进一步结合反卷积处理，可进一步提高分辨率（图 1d）。当采集参数优化后，反卷积可在定性和定量两方面提升分辨率，实现常规下优于100 nm的分辨率。

图 1. STED 成像中采集参数的优化及常见问题。 NK92 细胞在包被了抗 CD18 和抗 NKp30 抗体的玻片上激活 20 分钟，随后固定、透化，并用 Phalloidin Alexa Fluor 488 对 F-肌动蛋白进行染色。a) 因欠采样导致图像信息丢失的示例。b) 因漂白或过采样导致分辨率下降的示例。c) 优化后的成像条件。d) 在优化条件下，去卷积可显著提升分辨率。比例尺 = 5 μm。

讨论

相较于共聚焦显微镜，分辨率的提升在一定程度上依赖于一些无法控制的因素。这些因素包括盖玻片厚度的微小偏差以及封片介质的不一致性。保持成像室内的温度和湿度尽可能稳定非常重要，且STED光束应大约每60分钟重新校准一次。如实验步骤中所述，必须避免使用VECTASHIELD封片剂，因其与STED不兼容。此外，应始终使用#1.5盖玻片，若条件允许，应选用经验证具有特定厚度的盖玻片。

该方法的一种改进是在共聚焦成像中增加额外的通道，使用发射波长大于STED光束的荧光染料。通过这种方式，最多可实现四个成像通道（两个用于共聚焦，两个用于STED）。然而，若采用此方法，必须首先采集那些荧光染料发射光波长大于STED耗尽激光的通道，因为施加STED光束会导致这些通道的光子被耗尽。该技术的一个优势是可应用时间门控，这还能通过消除短寿命光子的发射来提高共聚焦的分辨率³⁴。特别是，采用时间门控技术，使发射探测器的时序与脉冲激发STED同步，可在靠近盖玻片成像时减少来自盖玻片玻璃反射的背景荧光。即使在不适合使用STED的实验中，只要采用脉冲激发光源，时间门控也可作为提高共聚焦分辨率的有效工具。

有多种方法可用于提高STED的分辨率。一种方法是减小针孔尺寸，使其小于标准的1艾里单位，但这也会减少到达样品的光量。可通过增加激光功率或增益来补偿这一损失。另一种方法是提高扫描线平均次数，这将增加每个光子采集的信息量，从而改善分辨率。然而，这可能会加剧样品的光漂白，因此需要在分辨率与光漂白之间取得平衡。类似地，使用GFP等荧光蛋白时，需仔细优化实验条件以避免光漂白。如有必要，可通过降低STED激光功率来实现。延长成像时间点也有助于提高光子采集效率并减少光漂白。在分析活细胞STED数据时，应考虑光漂白的校正问题。

当然，STED 也可实现三维成像，相比传统共聚焦成像同样具有分辨率提升。当与去卷积技术结合使用时，效果尤为显著；但需注意校正沿 z 轴多层成像过程中发生的位置漂移。若使用 Huygens 软件进行去卷积，可通过“stabilize image”（图像稳定）功能实现该校正。采用此方法，z 轴方向的分辨率将得到改善。这一进步显著优于传统共聚焦成像（其轴向分辨率较差），甚至优于单独使用 STED 的情况（后者在轴向分辨率方面也相对有限） z-轴分辨率。在STED成像过程中采集多个图像堆栈时，需注意避免样品发生漂白；如有必要，可降低扫描线平均次数或激光功率强度以减少光漂白。再次需要指出的是，若对不适合STED成像的其他荧光染料进行成像，则在首次顺序扫描中施加的耗尽光束将抑制这些通道的荧光发射。因此，当对发射波长大于592 nm的通道采用共聚焦扫描时，混合STED/共聚焦成像策略将不适用于三维成像。

总之，我们选择STED技术是因为其应用相对简便，且分辨率优于标准共聚焦成像。在免疫突触成像方面，该技术已被证明是一种有效且有价值的方法，使我们能够观察到在分辨率高于200 nm时无法看到的F-肌动蛋白结构的细节。尽管其中许多细节看似微小，但它们可能对自然杀伤（NK）细胞功能产生深远影响。因此，我们正在应用最新的纳米级成像技术，以获取对维持人类健康至关重要的信息。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
#1.5 盖玻片	VWR	48393-172
BD Cytofix/Cytoperm	BD Biosciences	554722
牛血清白蛋白	Sigma	A2153
棉签	Fisher Scientific	S450941
Falcon 离心管（50 ml）	VWR	352070
胎牛血清（FCS）（500 ml）	Atlantic Biologicals	S11050
山羊抗兔 Pacific Orange	Life Technologies	P31584
实验室用擦拭纸	VWR	82003-820
指甲油	VWR	100491-940
NK-92 细胞	ATCC	CRL-2407
鬼笔环肽 Alexa Fluor 488	Life Technologies	A12379
磷酸盐缓冲液	Life Technologies	14190250
Prolong 抗荧光淬灭封片剂	Life Technologies	P7481
纯化抗 CD18 抗体	Biolegend	301202
纯化抗 NKp30 抗体	Biolegend	325202
纯化抗穿孔素抗体	Biolegend	308102
RPMI 1640 培养基（500 ml）	Life Technologies	11875-093
皂荚皂苷（来自皂荚树皮）	Sigma	S4521
Super PAP 笔	Life Technologies	008899
曲拉通 X-100	Electron Microscopy Sciences	22142
Huygens 去卷积软件	SVI	Contact company
Leica SP8 TCS STED 显微镜	Leica Microsystems	contact company