多蛋白复合物的比较分析新方法基于 15Ñ代谢标记和定量质谱

Summary

所描述的比较，定量蛋白质组学方法的目的是获得见解多蛋白复合物的组成不同的条件下，并证明通过比较基因不同的菌株。为定量分析从蔗糖密度梯度不同的馏分等体积完全由质谱混合并进行分析。

Abstract

所引入的协议提供了在类囊体膜多蛋白复合物的分析工具，通过在不同条件下揭示见解复杂的组合物。在这个协议中的方法被证明通过比较蛋白复合物负责在莱茵衣藻的循环电子流（CEF），分离自遗传上不同的菌株的组合物。该方法包括类囊体膜的分离，随后通过基于差分代谢标记^（14 N / ¹⁵ N）分离成多蛋白复合物通过蔗糖密度梯度离心法，SDS-PAGE，免疫检测和比较，定量质谱（MS）分析菌株。洗涤剂溶解的类囊体膜对蔗糖密度梯度装在平等的叶绿素浓度。超速离心后，将梯度分离成各种馏分，这是由大量spectromet分析RY基于等量。这种方法允许梯度组分中的成分进行调查，此外，分析不同蛋白质的迁移行为，尤其是专注于ANR1，CAS和PGRL1。此外，这种方法被证明了通过从以往的研究支持的结果（即先前描述的是CEF-超复合如PGRL1，FNR的一部分的蛋白质的识别和PSI-依赖的迁移，并在确认的结果与免疫印迹和另外细胞色素F）。值得注意的是，这种方法适用于解决范围广泛的有本协议可以通过， 例如用于多蛋白复合物成分从不同的环境条件下分离出的比较分析问题。

Introduction

在植物和藻类类囊体膜的光合过程可以以线性和环状的方式发挥作用。在线性电子流（LEF）光系统I（PSI），光系统II（PSII）和细胞色素b ₆ / f电子转移，最终从水到NADP + ^1，导致NADPH和ATP ²的产生。与此相反，循环电子传递（CEF），这被称为像状态2 ³和厌氧条件^4，结果在由注入电子返回到电子传递链的再还原氧化的PSI不同的环境条件下被诱导。这个过程可以发生在任何的色素b ₆ / f复合体¹的基质侧或在质体醌库⁵并产生ATP，但没有NADPH ^2。

所提出的协议的目的是展示一个质谱（MS）基于米法认列在莱茵衣藻的类囊体膜多蛋白复合物来获得不同的条件（通过比较基因不同的菌株例举）下洞察这些配合物的组合物的比较，定量分析。这种方法在出版物由寺岛等被使用。在2012年呈现持续进修基金C中的^钙离子依赖的调节衣藻由多蛋白复合物包括蛋白CAS号，ANR1和PGRL1 ⁶介导的。该过程将通过比较分析CEF-超复合两种基因不同菌株的组成，从而采取贴标两个....

Protocol

1。 衣藻的培养

1. 以下三莱茵衣藻株在本研究中使用:WT cc124，WT CW15-arg7（细胞壁缺陷和精氨酸营养缺陷型），一个ΔPSI突变体菌株²⁹和一个pgrl1敲除菌株^4。
2. 所有菌株均生长在Tris-乙酸盐-磷酸盐（TAP）的介质^30，在25℃用20-50的连续光强度μE/米²秒，振摇在120rpm。 ΔPSI的文化应该被包裹着一些纸巾<5μE/米²秒的曝光。
3. 标记株（ΔPSI和WT cc124，分别）的培养物含有7.5 mM的¹⁵ N的NH _{4 Cl等} ，而文化对于未标记株（WT CW15-arg7和pgrl1，分别）含有7.5 mM的^{14 N}的NH _{4 Cl等} 。细胞具有生长为至少4 GENERAT离子全部实现标签和必须保持在指数生长期。
4. 于实验开始计数并稀释细胞至1×10 ⁶个细胞/在至少为750毫升/应变的体积ml的密度的前一天。

请注意，两种类型的不连续蔗糖密度梯度在以下方案中描述。根据Takahashi 等人 ⁹

Results

所引入的定量蛋白质组学方法的目的是多蛋白复合物的组成表征由基因不同C. CEF-超复合成分的比较分析表明类囊体膜衣藻株。所描述的方法已经被成功地由寺岛等人 ⁶施加，并且包括从厌氧生长的培养物类囊体膜，随后洗涤剂增溶的隔离。随后，样品装载到蔗糖密度梯度的基础上平等的叶绿素量和复合物通过超速离心分级。用于定量质谱分析从不同菌株2梯度组分等体积混合，并比较分析（ 图1）。所呈现的结果包括WT CW15-arg7和ΔPSI以及野生cc124和pgrl1之间分别持续进修基金，超复合分数的比较。

图2A和2B）被选为^6， 图3示出了相对于蛋白质之比为WT ^/ΔPSI（14 N / ¹⁵ N）为几个PSI的核心和LHCI蛋白（PSI也被命名为LHCA蛋白的捕光蛋白）以及对于分配与CEF-超复合蛋白。正如预期的那样，PSI核心蛋白是由两种组分无穷比率表明野生样.......

Discussion

利用稳定同位素标记不同的蛋白质组定量研究已经发表在最近几年。在这些实验中通常有两种不同的样品进行比较，其中一个样品都标有一个稳定的同位素。其后，两个样品的蛋白质或肽组合在相等的比率，并进一步处理一起^48。这种研究常常想比较定义孤立的细胞区室（ 例如叶绿体，线粒体，或类囊体膜）暴露于不同应激条件^26,34,49调查向上或向下调节特定蛋白质。所描述的比较，定量蛋白质的方法的目的是分析在类囊体膜的多蛋白复合物的组成和，相对于上述的研究中，基于混合的样品相同体积的类囊体膜的蔗糖密度分离以相等的叶绿素浓度之前加载后超速离心化。这种方法有效地寺岛等^。6谁比较分析的CEF-超复合从WT和一个ΔPSI应变，以确定蛋白质在蔗糖密度梯度迁移的PSI依赖性隔离的组合物施用。

为实现这一策略的是由一个事实，即MS-结果由免疫检测进一步支持了证实。此外，寺岛等人可以从先前的研究证实的结果（ 即已经描述的是CEF-超复.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
<强>化学品
乙酸	AppliChem	A0662	http://www.applichem.com/home/
丙酮	AppliChem	A2300	http://www.applichem.com/home/
乙腈Optigrade für LC-MS	Diagonal	9340	有害，戴手套工作。有关进一步的预防措施，请参阅协议文本。 https://www.diagonal.de/
氯化铵 15N	剑桥同位素实验室	39466-62-1	http://www.isotope.com/cil/index.cfm
氯化铵 14N	AppliChem	A0988	http://www.applichem.com/home/
磷酸氢铵	AppliChem	A3583	http://www.applichem.com/home/
硫酸铵	AppliChem	A3598	http://www.applichem.com/home/
考马斯亮蓝 R-250	Fisher Scientific	10041653	http://www.de.fishersci.com/index.php/deindex
正十二烷基-β;-D-麦芽糖苷	AppliChem	A0819	http://www.applichem.com/home/
EDTA	AppliChem	A2937	http://www.applichem.com/home/
甲酸	AppliChem	A3858	http://www.applichem.com/home/
HEPES	AppliChem	A3724	http://www.applichem.com/home/
氯化镁	AppliChem	A4425	http://www.applichem.com/home/
甲醇	AppliChem	A2954	http://www.applichem.com/home/
亚磷酸	AppliChem	A0989	http://www.applichem.com/home/
磷酸氢二钾	AppliChem	A1042	http://www.applichem.com/home/
磷酸二氢钾	AppliChem	A1043	http://www.applichem.com/home/
氢氧化钠	AppliChem	A1551	http://www.applichem.com/home/
蔗糖	AppliChem	A1125
http://www.applichem.com/home/ Tricine	AppliChem	A3954	http://www.applichem.com/home/
Tris	AppliChem	A2264	http://www.applichem.com/home/
胰蛋白酶（测序级修饰）和胰蛋白酶缓冲液	Promega	V5111	http://www.promega.de/
设备
雾化器（BioNeb 细胞破碎器）	Glas-Col		http://www.glascol.com/product/subproduct/id/75
离心管 （14 mm x 89 mm）	Beckman Coulter	331372	http://www.beckmancoulter.de/
离心管 25 mm x 89 mm	Beckman Coulter	344058	用于制备类囊体分离梯度。 http://www.beckmancoulter.de/< / p>
库尔特Avanti离心机J-20 XP	贝克曼库尔特		http://www.beckmancoulter.de/
Fuchs-Rosenthal细胞嘟嘟室	对角线	449/72	https://www.diagonal.de/
均质器（波特）50毫升	Fisherbrand	10618242 http://www.de.fishersci.com/index.php/defisherbrand
Pistil 用于均质机	Fisherbrand	105252220	http://www.de.fishersci.com/index.php/defisherbrand
超速离心机（Optima XPN-80 超速离心机）	贝克曼库尔特		网站：http://www.beckmancoulter.de/
Other
抗体	Agrisera		http://www.agrisera.com/en/index.html