解剖 Xenopus laevis 神经嵴用于 体外 组织块培养或 体内 移植

摘要

本方案描述了如何从胚胎中分离出迁徙前的颅神经嵴（NC） Xenopus laevis 神经胚。这些外植体可接种于纤维连接蛋白上进行培养 体外或移植回宿主胚胎中。该技术可用于研究神经嵴上皮-间充质转化、迁移及分化的机制。

摘要

神经嵴（NC）是一类短暂存在的背侧神经管细胞群，在神经管形成末期经历上皮-间质转化（EMT），广泛迁移至多种器官，并分化为多种衍生物（包括神经元、胶质细胞、软骨与骨、色素细胞及内分泌细胞）。在本方案中，我们描述了如何分离颅部神经嵴的迁移前细胞 Xenopus laevis 胚胎，用于研究神经嵴发育 体内 和 体外青蛙模型在研究早期发育方面具有诸多优势：可获得大量卵批次，胚胎发育迅速， 体内 功能获得与功能缺失策略可用于在供体和/或受体胚胎神经嵴（NC）解剖分离前调控基因表达。神经嵴外植体可接种于纤连蛋白（fibronectin）包被的培养板上，并用于后续实验。 体外 研究。它们可以在无血清的限定培养基中培养数天。我们还描述了如何将神经嵴（NC）外植体重新移植回宿主胚胎中，以研究神经嵴的迁移和分化 体内.

引言

神经嵴（NC）是脊椎动物胚胎中一种短暂存在的胚胎细胞群体，于神经胚形成末期从神经管中产生。调控神经嵴细胞特化的信号通路和遗传事件早在原肠胚形成阶段即已启动。神经嵴细胞在神经外胚层与非神经外胚层交界处被确定，其特化过程受到周围背侧组织信号的调控。在神经胚形成结束时，神经嵴细胞经历上皮-间质转化（EMT），并沿着特定路径在胚胎内广泛迁移 ，这一过程依赖于对周围导向信号的响应。当它们到达最终目的地后，可分化为多种细胞类型，例如神经元、胶质细胞、骨、软骨以及色素细胞^1-5。由于神经嵴细胞在多种细胞类型和胚胎组织的发育中发挥重要作用，从其诱导到终末分化的任一阶段发生异常，均可能导致一类被称为“神经嵴细胞病”的先天性综合征⁶。在不同发育阶段——包括特化、EMT、迁移和分化——对发育中的神经嵴进行实验性操控，将有助于加深我们对神经嵴细胞病的理解，并为设计潜在的治疗策略提供依据。

的 Xenopus laevis 胚胎是研究神经嵴发育的首选模型。胚胎易于大量获取，且体外受精使得研究者能够观察发育的最初阶段。已有多种实验工具可用于对其进行操作。 X. laevis 胚胎发育。通过显微注射早期囊胚的单个细胞，可轻松实现基因的过表达和基因敲降。胚胎组织可进行切割以 体外 再结合 ^7-11 或回移移植实验^12,13.

在本方案中，我们描述了如何分离出迁移前的头部神经嵴 X. laevis 晚期神经胚，迁移前阶段。这些外植体可在纤连蛋白包被的培养板上培养，以在受控条件下研究细胞迁移与分化 体外 实验条件。神经嵴外植体也可移植到正常或经处理的宿主胚胎中，以研究其迁移与分化过程 体内.

方案

实验遵守国家和欧洲关于用于科学目的动物保护的法规，以及国际公认的替代、减少和优化原则。

1. 纤连蛋白包被培养皿的制备¹⁴

1. 将500 ml用1× 磷酸盐缓冲液（PBS）稀释的10 mg/ml培养级纤维连接蛋白加入标准塑料培养皿（Ø 40 × 11 mm）中。37 °C孵育1小时。注意：若后续成像使用玻璃培养皿或盖玻片，请使用100 mg/ml的纤维连接蛋白溶液。
2. 用1× PBS冲洗三次。
3. 将PBS替换为500 ml含0.1%牛血清白蛋白（BSA）的1× PBS。37 °C孵育30分钟。
4. 用1× PBS冲洗三次。
5. 加入1× PBS并置于4 °C保存备用（通常为24–48小时）。

2. 神经嵴外植体的解剖

1. 配制 3/4 正常两栖类培养基（NAM）（110 mM NaCl，2 mM KCl，1 mM Ca(NO₃)₂，1 mM MgCl₂，5 mM HEPES，pH 7.5）₃)₂，1 mM MgSO₄₄，0.1 mM EDTA，1 mM NaHCO₃₃，0.2x PBS，50 mg/ml 庆大霉素^10,15）。用于解剖的样品存放时间不要超过1周，需在4 °C保存。较老的NAM可用于制备琼脂糖包被的解剖培养皿（见下文）。
2. 准备用于解剖的60 mm培养皿，每皿中加入10 ml含2%琼脂糖的3/4 NAM培养基进行包被。
3. 收集解剖工具：塑料巴斯德吸管、固定在针座上的最细昆虫针（参见材料表参考）、一个 "解剖刀" （使用嵌有眉毛毛发的石蜡封于玻璃巴斯德移液管尖端制成）¹⁶），两把精细解剖镊、P1000移液器及吸头、放大倍数为8-40X至50X的双目立体显微镜、带光纤导光束的明亮光源。所有解剖工具应保持清洁；每次实验后，先用蒸馏水冲洗两次，再用100%乙醇冲洗一次，晾干后存放于无尘环境中。
4. 用新鲜的NAM将解剖皿几乎注满至顶部。
5. 获取 X. laevis 根据标准操作程序处理胚胎¹⁰ 并培养至神经胚阶段16期（根据Nieuwkoop和Faber发育表）¹⁷).
6. 使用塑料巴斯德吸管将16期胚胎放入解剖皿中。
7. 在体视显微镜下进行后续所有步骤。使用两对镊子去除卵黄膜，注意不要损伤胚胎的背侧部分。
8. 等待胚胎发育至17期后再开始解剖。17期较为合适，因为此时神经嵴已明显与神经管分离，而早期阶段则尚未分离。17期之后，神经嵴细胞开始迁移并与周围的间充质细胞混杂。
9. 用镊子在琼脂糖中挖一个小孔，为胚胎创造一个容纳空间，以便在解剖过程中固定胚胎。将一个胚胎背侧朝上放置。注意：可使用模型黏土代替在琼脂糖中挖孔来固定胚胎。
10. 用眉刀和昆虫针在前神经褶的侧部做切口。注意不要切入胚胎过深：应仅切割2-3层细胞（切勿达到原肠深度！）。在整个解剖过程中， 切勿让解剖后的组织接触气液界面 因为 X. laevis 胚胎组织通过表面张力裂解。
11. 使用相同的工具，在神经褶更背侧的部分做第二条平行切口。
12. 如有需要，将培养皿旋转90°。使用眉刀和昆虫针在前两处切口的后方做第三个垂直切口。神经嵴位于外胚层色素化外层下方，呈较厚的细胞团块，位于神经管的外侧。
13. 使用眉刀的尖端从第三次切口边缘开始，将色素化的外胚层与下方的神经嵴分离。
14. 使用眉刀的侧面从第三个切口处开始分离神经嵴组织。神经嵴组织呈灰白色，而其下方的头端中胚层为白色。小心地将神经嵴组织与中胚层分离。
15. 将视泡前方的神经嵴组织分离，并在此水平切割以游离出外植体。作为初次实验的对照，进行检查 snail2 表达（一种典型的神经嵴标志物）在某些外植体中 原位 建议进行杂交.

3. 在纤连蛋白上接种外植体

1. 用改良Danilchick培养基（MDM，含53 mM NaCl、5 mM Na2CO₃、4.5 mM K葡萄糖酸盐、32 mM Na葡萄糖酸盐、1 mM MgSO₄、1 mM CaCl₂、0.1% BSA，用1 M Bicine调节pH至8.3¹⁸）填充纤维连接蛋白包被的培养皿。
2. 使用P1000移液器将外植体转移至纤维连接蛋白包被的培养皿中。切勿让外植体接触气液界面。首先在移液枪头中吸入部分液体，然后吸入外植体，再吸入部分液体。在将外植体转移至纤维连接蛋白包被的培养皿过程中，切勿让空气进入枪头。当枪头进入培养皿中的液体后，让外植体依靠重力缓慢沉降，或极其轻柔地推出。避免过快弹出外植体。
3. 使用眉刀将10–30个外植体放置于培养皿中。避免靠近培养皿边缘，因为这些区域不适合后续成像。
4. 在外植体附着于纤维连接蛋白之前（约需15–30分钟），尽量不要移动培养皿。如确需移动，应极其小心地进行。
5. 将培养皿置于冷藏培养箱中（温度控制在15–20 °C之间，温度参考图表见¹⁷）。在15 °C条件下培养约6小时后，细胞通常可有效迁移并发生散射（具体时间可能因实验而异）。

4. 将外植体移植到宿主胚胎中

1. 使用粗镊子将细玻璃盖玻片切割成非常小的碎片，碎片大小约为 1.5 mm²。用镊子将碎片浸入含有 3/4 NAM 或 PBS 的培养皿中。
2. 宿主胚胎的准备：在 3/4 NAM 中按照步骤 3) 所述方法小心分离宿主神经嵴组织，注意在去除卵黄膜和解剖神经嵴时不要损伤宿主胚胎。组织张力容易导致切除区域扩大：在解剖供体胚胎时，可让宿主胚胎部分愈合。
3. 在另一个涂有琼脂糖的培养皿中，或在同一培养皿的另一区域，按照方案 3 所述方法从供体胚胎中分离出神经嵴外植体。按照方案 3 所述方法，小心将神经嵴移植物转移至含有宿主胚胎的培养皿中。
4. 立即用镊子将神经嵴外植体放置到宿主被切除的区域，外植体应部分附着。将一小片玻璃盖玻片置于移植胚胎上，以固定移植物位置。选择比胚胎稍大的玻璃碎片，以避免损伤胚胎。此时胚胎会略微变扁。
5. 等待至少 15–20 分钟后，轻轻移除盖玻片。让胚胎再恢复约 10 分钟，然后使用塑料巴氏移液管小心将其移入盛有 3/4 NAM 的洁净培养皿中。

结果

当接种在纤连蛋白上时，神经嵴外植体迅速贴附（15–30 分钟），并在 2 小时内展平（图 1A）。在 3–6 小时后，细胞开始分散。在 15 °C 培养 24 小时后，许多细胞已从外植体迁移出去（图 1B 和 图 1C）。卵黄使细胞在相差显微镜下显得非常明亮（图 1B）。经鬼笔环肽染色标记肌动蛋白细胞骨架后，细胞突起（丝状伪足和片状伪足）清晰可见（图 1C）。

在原位移植实验中，将GFP mRNA注射到供体胚胎中，以便在未标记的宿主胚胎中追踪移植的细胞。宿主胚胎的一侧颅神经嵴被消融；手术后30-60分钟，移植物已愈合，取代了被消融的宿主颅神经嵴（图1D，移植后2小时）。数小时后，GFP阳性细胞从外植体迁移出来，并沿神经嵴细胞典型的迁移路径向颅面部腹侧区域迁移（图1E）。在蝌蚪中，神经嵴来源的颅面结构已发育形成（图1G

讨论

本方案描述了一种简便的技术，用于分离头颅部神经嵴前体细胞 X. laevis 胚胎。用于此类实验的胚胎必须健康且具有良好的愈合能力。弃用任何一批不健康的胚胎。此外，需在不同温度下（12至18-20 °C）培养胚胎，以便在发育第17期进行神经嵴切除，而不应晚于该时期。超过第17期后，神经嵴可能与头颅中胚层混合，无法完全分离。 非洲爪蟾 组织愈合迅速，随后会失去与其他组织的黏附性。因此，操作需迅速，将神经嵴外植体从供体切除后应立即植入宿主。

关于 体外 实验过程中，纤连蛋白培养皿在数天后可能受到细菌或真菌污染。应尽可能使用抗生素以及洁净或无菌的材料和溶液。

该实验方案已针对颅神经嵴细胞进行优化。实际上，这一细胞群体在17期的Xenopus胚胎中具有明确的定义和定位。遗憾的是，该模型不适用于对躯干神经嵴（NC）进行此类实验。对于希望操作躯干神经嵴细胞群体的研究者而言，鸟类胚胎是更为合适的模型。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
牛血浆来源的纤连蛋白	Sigma	F4759-1MG
牛血清白蛋白，第五组分	Euromedex	04-100-811-C	较低纯度级别可能 适用于此应用
不锈钢昆虫针，000号	FST	26001
Dumont #5 镊子，0.05 mm × 0.02 mm	FST	11252-20