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方法文章

利用荧光蛋白在活细胞中可视化并定量分析Chlamydia包涵体的生长动态

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DOI：

10.3791/51131

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2015年10月13日

 ,  , 
1Division of Allergy and Infectious Diseases, Department of Medicine, University of Washington, 2Program in Infectious Diseases, School of Public Health, University of California at Berkeley

本文内容

摘要

本文介绍了一种基于活细胞荧光蛋白的方法，用于标记含有Chlamydia的细胞液泡（包涵体）。该策略可实现对样品中Chlamydia感染性的快速、自动化测定，并可用于定量研究包涵体的生长动态。

摘要

专性胞内细菌 沙眼衣原体 对全球公共卫生构成了巨大负担。 C. 沙眼衣原体 是导致性传播感染的主要细菌性病原体，也是全球可预防性失明的首要原因。沙眼衣原体成功感染宿主细胞的一个关键决定因素，是其在一种称为包涵体（inclusion）的新型空泡样区室内操控宿主细胞信号通路的能力。在包涵体内，沙眼衣原体获取其2-3天发育生长所需的营养物质，并且还会向空泡膜的胞质面以及宿主细胞质中分泌一系列效应蛋白。然而，目前对沙眼衣原体生物学特性的认知仍存在空白，这为观察和分析这一胞内区室带来了重大挑战。最近，已有研究描述了一种利用表达GFP的宿主细胞进行反向成像以可视化包涵体的策略。该方法合理地利用了包涵体膜对GFP等大分子物质固有的不通透性。在本研究中，我们阐述了如何构建表达GFP或mCherry的宿主细胞，以实现对衣原体包涵体的后续可视化观察。此外，该方法被证明可有效替代成本较高的基于抗体的计数方法，并可与其他荧光标记（如表达GFP的标记物）联合使用 沙眼衣原体，并可被用于从多种来源获取关于包涵体膜生长的关键定量数据 沙眼衣原体 物种与菌株

引言

由胞内细菌属物种引起的传染病 沙眼衣原体 对全球健康造成重大负担，包括性传播疾病、盆腔炎、失明、肺炎，以及可能的动脉粥样硬化1-4. 该能力 沙眼衣原体 在空泡（称为包涵体）内与宿主细胞相互作用，是衣原体成功感染细胞及宿主的关键决定因素。包涵体是一种新型的致病性区室，可支持衣原体的生长，并在整个2–3天的发育周期中动态改变 沙眼衣原体5. 衣原体的专性细胞内寄生特性给科研界带来了诸多挑战，尤其是在直接研究包涵体独特生物学特性方面。主要障碍之一是无法高效地对细胞内 沙眼衣原体 或通过荧光方法将其引入活细胞。最近的一项发现终于揭示了生成表达GFP的 C. trachomatis6；然而，这一发现尚未实现对包涵体的特异性标记。已有若干技术被用于细菌和包涵体的标记7,8，但这些方法存在非特异性、瞬时性以及易发生光漂白等缺点。我们课题组的一项重要发现是，利用表达GFP的宿主细胞建立了一种标记包涵体的新策略9该策略合理地利用了包涵体膜对分子量大于520 Da的分子具有内在不可渗透性的特性。10当细胞被改造为稳定表达某种胞质荧光蛋白时（例如，GFP 或 mCherry）， 沙眼衣原体 包涵体由于完全排除荧光，呈现出极为清晰的可见性。这种反向成像策略可实现对所有包涵体的即时可视化 沙眼衣原体 物种，并且可轻松适用于大多数目标宿主细胞。为展示其应用价值，该方法此前已被用于揭示并界定细胞外排途径 沙眼衣原体 种（复数）9.

在此，我们进一步演示该方法的操作过程，并说明如何利用该方法获取有关包涵体生长动态的关键定量数据。此外，该方法可有效替代成本较高的基于抗体的计数方法，并可与其他荧光标记联用，例如表达 mKate2 的Chlamydia11。这种强大的工具组合使得研究人员能够在活体宿主细胞内探究沙眼衣原体包涵体膜的物理特性。

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方案

1. 荧光宿主细胞系的构建

  1. 第1天。将293T细胞（或其他逆转录病毒包装细胞系）以每孔2 × 106个细胞的密度接种于6孔板中，使细胞在次日达到约75%融合度。如需要，可为每种逆转录病毒设置重复孔。
  2. 第2天。吸除培养基，每孔加入2 ml新鲜生长培养基（DMEM + 10% FBS + 2 mM L-谷氨酰胺）。使用Lipofectamine 2000或类似转染试剂，按照制造商说明，将5–8 µg逆转录病毒载体（含GFP）和包装载体（例如，pVSVg）共转染入细胞。
  3. 在37 °C CO2培养箱中将细胞与DNA共孵育4–6小时，随后更换为1 ml生长培养基。
  4. 在37 °C CO2培养箱中继续孵育细胞48小时。
  5. 第3天。将靶细胞（例如，HeLa细胞）以约105个细胞/孔的密度接种于6孔板中，使细胞在次日达到约50%融合度。通过倒置显微镜观察GFP荧光，确认293T细胞转染成功。
  6. 第4天。用移液器收集293T细胞的含病毒上清液，并通过0.45 µm醋酸纤维素注射器滤器过滤上清液。
  7. 吸除HeLa细胞的培养基，加入含16 µg/ml聚凝胺的0.5 ml生长培养基。将约0.5 ml过滤后的病毒液逐滴加入细胞中，在37 °C CO2培养箱中孵育24小时。剩余病毒液（即，来自重复孔的病毒）可于4 °C保存。
  8. 第5天。若已制备重复孔以获得额外病毒，可重复步骤1.7，进行连续感染，利用剩余的病毒颗粒再次感染细胞。
  9. 第6天。将转染后的HeLa细胞按1:1比例传代至含筛选抗生素（例如，500 µg/ml新霉素）的10 cm培养皿中。
  10. 在筛选抗生素存在下培养足够时间，使转导细胞恢复生长，之后可用较低浓度的筛选抗生素（例如，200 µg/ml新霉素）通过常规方法进行扩增。
    注意：如有需要，此时也可对细胞进行克隆筛选，以获得理想荧光强度的单克隆。

2. 表达GFP的生成 沙眼衣原体 沙眼衣原体

  1. 配制2x CaCl2缓冲液（20 mM Tris pH 7.4，100 mM CaCl2）和4SP缓冲液（0.4 M蔗糖，16 mM Na2HPO4）。
  2. 第1天。将冻存的C. trachomatis菌种置于冰上解冻，并立即将10 µl细菌稀释至50 µl 2x CaCl2缓冲液中。加入3 µg质粒DNA（例如，pASK-GFP-mKate2-L2），充分混匀，于25 °C孵育30 分钟。
  3. 在此期间，通过胰酶消化T-75培养瓶中的McCoy细胞，将其转移至离心管中。将细胞悬液以50 × g离心5分钟，弃去上清液。用适量1x CaCl2缓冲液重悬细胞沉淀，使最终细胞浓度为4 × 107 个细胞/ml。
  4. 在步骤2.2的30分钟孵育结束后，向转化混合物管中加入100 µl制备好的McCoy细胞（总体积200 µl），再于25 °C孵育20分钟。将100 µl该转化细胞混合物加入6孔板中的一个孔，并覆盖2 ml生长培养基。在37 °C的CO2培养箱中孵育2天。
  5. 第3天。通过更换培养基为1 ml dH2O并用弯曲的1,000 µl移液枪头刮取细胞，裂解被C. trachomatis感染的McCoy细胞。加入1 ml 4SP缓冲液，并将悬液通过27.5 G针头反复吹打约5次，以有效裂解细胞并释放C. trachomatis。
  6. 将含有C. trachomatis的2 ml细胞裂解液转移至含有新鲜接种且已形成融合单层的McCoy细胞的T-75培养瓶中；加入8 ml DMEM（不含FBS），于25 °C孵育2小时，使C. trachomatis能够附着于细胞。
  7. 吸除培养基，加入新鲜生长培养基，补充10 U/ml青霉素G和1 µg/ml放线菌酮。将培养瓶置于37 °C CO2培养箱中孵育48小时。
  8. 第4天。通过光学显微镜观察确认细胞已被感染，且包涵体中含有异常的沙眼衣原体。在标准光学显微镜下，包涵体表现为明亮的空泡，而异常的沙眼衣原体结构则表现为直径大于2 µm的环状物，位于包涵体内。
  9. 第5天。通过更换培养基为2 ml dH2O并刮取细胞形成悬液，裂解培养物。加入2 ml 4SP缓冲液，并将悬液通过27.5 G针头反复吹打约5次。
  10. 取2 ml细胞裂解液用于感染6孔板中单个孔内的新鲜McCoy细胞单层。于25 °C与裂解液共孵育2小时，吸除液体后加入含青霉素G和放线菌酮的新鲜生长培养基。
  11. 将细胞置于37 °C CO2培养箱中孵育3–5天，具体时间根据细胞整体健康状况而定。
  12. 根据需要重复步骤2.9–2.10一次或多次，将培养物传代至6孔板中的新孔，直至出现形态正常的包涵体（无异常结构）。此时使用倒置荧光显微镜检查确认C. trachomatis表达mKate2（红色荧光）。
  13. 扩大感染培养规模以制备高滴度的沙眼衣原体储备液，例如从T-150培养瓶中培养的感染McCoy细胞或HeLa细胞中收获衣原体转化子。

3. 用沙眼衣原体感染细胞

  1. 将表达GFP的HeLa细胞接种至所需的培养容器中，例如用于高分辨率成像的玻璃底培养皿或腔室载玻片，或用于IFU测定和多孔筛选的24孔板。
  2. 解冻含有冷冻管 C. trachomatis, C. muridarum，或 C. pneumoniae 置于冰上，并用HBSS稀释至所需的感染复数（MOI），例如MOI = 1。
  3. 根据所使用的沙眼衣原体菌株，选择进行静态感染或离心辅助感染。
    1. 对于感染 C. trachomatis LGV 血清型 L2 或 C. muridarum，用HBSS洗涤GFP-HeLa细胞，并与稀释后的细菌在25 °C孵育2小时。吸除液体，用HBSS洗涤细胞，随后将细胞置于37 °C CO₂培养箱中，在生长培养基中继续孵育2 培养箱
    2. 对于沙眼衣原体D血清型的感染 C. pneumoniae，用HBSS洗涤GFP-HeLa细胞，并将稀释后的细菌加入细胞中。将多孔板或玻璃底培养皿（用胶带固定在多孔板盖内）放入台式离心机摆桶转子附件的多孔板支架中。
    3. 在25 °C下以900 x g离心细胞1小时。
    4. 从离心机中取出培养容器，并置于37 °C CO₂培养箱中2 孵育1小时。
    5. 在生物安全柜中吸除细胞，用HBSS洗涤细胞两次，并加入新鲜培养基。将细胞置于37 °C CO₂培养箱中。2 培养箱

4.  活细胞成像可视化 沙眼衣原体 包涵体

  1. 从 CO2 培养箱中取出感染Chlamydia的GFP-HeLa细胞，并将培养基更换为不含酚红的RPMI + 5% FBS。
  2. 使用20倍或更高倍数的油镜，将细胞置于倒置荧光显微镜（Nikon Eclipse Ti-E 或类似型号）上进行观察。
  3. 利用成像软件（Volocity 6 或类似软件），聚焦并识别感染Chlamydia的GFP-HeLa细胞：即含有大型黑色空泡（Chlamydia包涵体）的绿色细胞。
  4. 使用成像软件（Volocity 6 或类似软件），在XY载物台视图模式下手动“添加点”，标记出目标感染Chlamydia细胞所在区域的xyz位置。通过此方式，每个标记位置的xyz坐标将被保存。
  5. 在采集设置对话框中，配置软件以采集绿色（GFP，HeLa细胞质）和红色（mKate2，C. trachomatis）通道的图像，并设置每个通道每5分钟采集一帧新图像。
  6. 点击“Capture/Record”按钮，按照上述设置的采集程序获取图像序列。

5. 活细胞中包涵体生长参数的定量分析

  1. 感染后预定时间点例如，24，48 hpi）去除 沙眼衣原体 从培养箱中取出感染的GFP-HeLa细胞，置于倒置荧光显微镜下观察。注意：对于24孔板，建议使用20X或40X的高数值孔径（NA）干镜；对于腔室载玻片，推荐使用40X油镜。本实验可在上述任一基质上培养细胞。
  2. 聚焦细胞的中位面，此处包涵体直径最大，边缘清晰。
  3. 在每个孔中获取多个视野的图像（每孔至少10个）；孔通常代表重复样本或实验变量。
  4. 通过肉眼手动计数包涵体数量（包涵体为GFP-HeLa细胞中的黑色区室），或使用成像软件算法自动识别并计数包涵体。
    1. 通过荧光强度（“Find Objects”命令）寻找GFP-HeLa细胞，并根据细胞的相对荧光强度调整荧光阈值强度。
    2. 使用尺寸筛选标准，仅保留大于 5 µm 的选定对象2这是“群体1”。
    3. 使用“population 1”作为输入，执行“填补物体中的孔洞”命令。此步骤生成“population 2”。
    4. 将“群体2”减去“群体1”，以获得正向标记的群体 沙眼衣原体 被指定为“群体3”的包涵体。
    5. 对“population 3”应用尺寸过滤器（“Filter Population”命令），例如保留大于25 µm的对象2 用于感染24小时或更长时间后细胞内包涵体的检测。对于早期感染时间（如18小时之前），应设置尺寸过滤器以保留大于4 µm的物体2，因为这些包涵体要小得多。尺寸过滤后得到一组被定义为“包涵体”的对象群体。
    6. 使用成像软件从图像中计算定量数据，例如包涵体数量、包涵体大小和包涵体周长。

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结果

表达胞质荧光蛋白（例如，GFP）的哺乳动物细胞可经基因工程改造，用于在活体感染细胞培养物中显示Chlamydia包涵体。感染Chlamydia后，包涵体在宿主细胞中清晰可见，表现为黑色斑点（图1）。缺乏荧光的包涵体具有明显对比度，可被用于在大量视野和/或不同处理条件下自动识别包涵体（图1）。一旦获得表达荧光蛋白的宿主细胞，即可建立一种强大的新工作流程，用于对实验样本中Chlamydia感染水平进行快速、定量分析。其中一个重要应用是测定活感染细胞中的Chlamydia包涵体形成单位（IFU）（图2）。该实验策略避免了领域内常规使用的免疫荧光染色步骤，后者既耗时又昂贵。

所述成像方法的另一个关键特征是，它可轻松应用于任何Chlamydia物种或菌株，并且还可用于推导沙眼衣原体包涵体的重要生物学特性。例如，对感染了C. trachomatis LGV血清型L2、C. tra...

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讨论

在此，我们描述了用于生成荧光宿主细胞的实验策略，以实现对活细胞中生物学过程的实时可视化与分析 沙眼衣原体 包涵体。这种液泡可视化方法能够强有力地揭示、追踪并定量测量衣原体包涵体在细胞群体中或随时间推移在单个细胞中的动态特性。 沙眼衣原体 荧光蛋白标记细胞中的包涵体轮廓清晰，无需额外的免疫荧光处理即可轻松识别。此外，该方法的灵敏度足以分辨出不同特征性的形态学差异 沙眼衣原体 物种和菌株所具有的特征，例如每细胞空泡数量和包涵体曲率。此外，我们展示了如何调整成像软件以自动识别表达GFP的宿主细胞中的包涵体。无需进行免疫荧光标记步骤即可显示沙眼衣原体包涵体，从而在终点检测（如包涵体形成单位（IFU）测定）中为使用者节省大量时间和成本。 Furthermore，能够在活细胞中成像包涵体，使得同一群体的感染细胞可在沙眼衣原体发育周期的精确时间点被反复分析，从而减少了时间进程研究所需的孔板数量。细胞质GFP、mCherry， 等等。，产生明亮且稳定的信号，不会发生光漂白；这一特性对于长时间的延时成像实验至关重要。最后，由于该技术不依赖于 沙眼衣原体 发育基因表达...

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披露

作者声明不存在相互竞争的经济利益。

致谢

作者感谢 Ian Clarke 和 P. Scott Hefty 分别提供了质粒 pGFP-SW2 和 pASK-GFP-mKate2-L2。我们感谢 Paul Miller 提供的技术支持以及 Richard Stephens 提供的其他资源。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 AI095603（KH）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Lipofectamine 2000Invitrogen11668
Opti-MemInvitrogen31985
PolybreneSigmaH9268
0.45 µm 过滤器Fisher09-719D
G418Invitrogen10131
HBSSInvitrogen14025
DMEMInvitrogen11995
RPMI 1640Invitrogen11875
不含酚红的 RPMI 1640Cellgro17-105-CV
青霉素 GSigma13752
放线菌酮SigmaC7698
玻璃底培养皿MatTekP35G-1.5-14-C
腔室载玻片，Lab-Tek IINunc154526, 154534

参考文献

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