利用荧光蛋白可视化和定量衣原体液泡生长动态的活细胞

摘要

描述了一种基于活细胞荧光蛋白的照明含有衣原体的细胞液泡（包涵体）的方法。该策略能够快速、自动地测定样品中的衣原体感染性，并可用于定量研究包涵体生长动力学。

摘要

专性细胞内细菌衣原体给全球公共卫生造成了沉重的负担。C. trachomatis 沙眼衣原体是性传播感染的主要细菌原因，也是世界上可预防失明的主要原因。衣原体成功感染宿主细胞的一个重要决定因素是细菌能够从称为包涵体的新型液泡隔室内纵宿主细胞信号传导。衣原体从内含物中获得其 2-3 天发育生长所需的营养，并且它们还会将一组效应蛋白分泌到液泡膜的胞质表面并进入宿主胞质溶胶。然而，我们对衣原体生物学的理解存在差距，这为可视化和分析这个细胞内隔室带来了重大挑战。最近，描述了一种使用表达 GFP 的宿主细胞可视化包涵体的反向成像策略。这种方法合理地利用了包涵膜对 GFP 等大分子的固有不渗透性。在这项工作中，我们描述了如何产生表达 GFP 或 mCherry 的宿主细胞，以便随后对衣原体包涵体进行可视化。此外，该方法被证明可以有效地替代昂贵的基于抗体的计数方法，可以与其他荧光标记（例如表达 GFP 的衣原体）结合使用，并且可以利用从一系列衣原体物种和菌株中获得有关包涵膜生长的关键定量数据。

引言

引起细胞内细菌衣原体种传染病引起全球健康的一大负担，包括性传播疾病，盆腔炎，失明，肺炎和动脉粥样硬化有可能^1-4。 衣原体到与宿主细胞相互作用，从一个液泡内的能力（称为包含），是一个重要的决定因素的成功细胞和宿主的感染。列入是一种新型的致病隔室，使衣原体生长和在整个衣原体 ^5的整个 2-3天的发育循环被动态地修改。衣原体的专性细胞内的性质提出了直接学习列入独特的生物学无数挑战，研究界，尤其如此。一个主要的障碍已经无法有效地可视化或者细胞内沙眼或将其列入荧光方法ES在活细胞。最近发现终于露出来产生绿色荧光蛋白表达C.手段衣原体 ^6;然而，这一发现还没有导致列入特异性标记。一些技术已经被描述用于细菌和夹杂物^7,8的标记，但是它们从缺点，例如非特异性，顷刻和易感性漂白受损。一个重要的发现我们集团成立了一个新的战略，利用绿色荧光蛋白表达的宿主细胞⁹照明列入。这一战略合理利用纳入膜的固有抗渗性的分子大于520大^10。当细胞改造成稳定表达特定的细胞内荧光蛋白（ 如 GFP或mCherry）， 衣原体夹杂物具有显着的清晰度荧光他们完全排除可见。这种倒车影像战略使夹杂物的所有叶绿素即时可视化amydia物种，它可以容易地适用于大多数感兴趣的宿主细胞。由于其效用的演示，这种方法以前用来揭示和定义细胞退出途径衣原体属^9。

在这里，我们进一步说明此方法的执行，并且可以被利用来导出关于夹杂物的生长动力学键的定量数据。此外，它可以有效地替代昂贵的基于抗体的枚举的方法和可以串联与其他荧光标记，如mKate2表达衣原体 ¹¹被使用。这个强大的工具结合，使生活在宿主细胞内的衣原体包涵体膜的物理性质的探索。

方案

1.代荧光宿主细胞系

1. 以^2×10 6个细胞/孔，于6孔板天1.板293T细胞（或其它逆转录病毒包装线）为〜75％汇合的第二天。如果需要的话，所用板的孔一式两份每个逆转录病毒。
2. 第2天，吸细胞和加2ml新鲜生长培养基（DMEM + 10％FBS + 2mM的L-谷氨酰胺）。转染细胞用5-8微克每逆转录病毒载体（含有GFP）和包装载体的（如，pVSVg）使用Lipofectamine 2000或类似试剂，并按照制造商的说明。
3. 孵育细胞用DNA 4-6小时在37℃ _的 CO 2培养箱，并且随后替换培养基用1ml生长培养基中。
4. 孵育细胞48小时在37℃ _的 CO 2培养箱中培养。
5. 第3天板靶细胞（例如，HeLa细胞）上的6孔板上^，10 5个细胞的近似密度/孔，为〜50％汇合的明天。通过在倒置显微镜监测GFP荧光验证在293T细胞阳性转染。
6. 第4天收集通过0.45μm的醋酸纤维素过滤器的注射器用吸管和过滤上清上清关闭293T细胞含有逆转录病毒。
7. 从HeLa细胞中删除，并添加含有16微克/毫升聚凝胺0.5毫升生长培养基。添加〜0.5毫升过滤逆转录病毒的细胞逐滴孵育细胞在37℃ _的 CO 2培养箱24小时。存储任何剩余的反转录病毒（例如，从复制孔）在4℃下。
8. 日5.如果复孔被做产生额外的逆转录病毒，重复步骤1.7至连续用剩下的逆转录病毒颗粒感染。
9. 天6.通道转染的HeLa细胞中1:1到10厘米培养皿含有选择抗生素（例如，500微克/ ml新霉素的）。
10. 等待足够的时间转导的细胞重新生长在选择antibio存在抽动，然后将细胞可通过标准技术来传播，但有选择抗生素的浓度较低（例如，200微克/ ml新霉素的）。
    注:细胞也可以被克隆选择亮度理想在这个时候，如果有必要的。

2代的绿色荧光蛋白表达沙眼衣原体

1. 制备2× _氯化钙缓冲液（20mM的Tris pH值7.4，100mM的_氯化钙 2）和4SP缓冲液（0.4M的蔗糖，16毫_的 Na 2 _HPO 4）。
2. 每日1次解冻冷冻C.衣原体股票在冰上，并立即稀释10微升细菌进入50微升2倍氯化钙₂缓冲区。加入3微克质粒DNA（例如，帕斯克-GFP-mKate2-L2），拌匀，孵育30分钟，在25℃。
3. 在此步骤期间，通过胰蛋白酶McCoy细胞的T 75烧瓶入离心管中制备的宿主细胞。离心细胞悬浮液，在50×g离心5分钟，丢弃上清液。 Resuspen在1× _氯化钙缓冲适当卷D细胞沉淀，得到的^4×10 7个细胞/ ml的终浓度。
4. 在30分钟温育（来自步骤2.2）后，加入100微升制备McCoy细胞以转化混合物管（总体积200微升）并孵育另外的20分钟，在25℃。加入100微升此转化细胞混合物的单个井从6孔板和覆盖用2ml生长培养基中。 _在 CO 2培养箱2天在37℃。
5. 天3.裂解McCoy细胞感染C.由沙眼用1毫升的dh _{2 O}与弯曲1000微升枪头更换培养基和刮细胞。加入1毫升4SP缓冲区，并通过一个27.5摹针通过悬挂〜5次，C的高效细胞裂解，并释放衣原体 。
6. 含C的细胞裂解物转移2 ml的衣原体到T-75烧瓶中含有新鲜镀MCC的汇合单层OY细胞;加入8 ml的DMEM（无FBS），并培育2小时，在25℃，以允许℃。衣原体坚持细胞。
7. 抽吸细胞，并添加补充有10U / ml青霉素G和1μg/ ml的放线菌酮的新鲜生长培养基中。孵育烧瓶48小时在37℃ _的 CO 2培养箱中培养。
8. 4日通过光学显微镜的细胞被感染和夹杂物含有异常衣原体检查。确定夹杂亮泡在一个标准的光学显微镜，以及异常的机构衣原体夹杂物是大于2微米直径内环形物体。
9. 日5.裂解文化通过用2毫升的dh _{2 O}更换培养基和刮细胞成混悬液。加入2ml 4SP缓冲区，并通过一个27.5摹针通过悬挂〜5倍。
10. 用2 ml的细胞裂解物去感染McCoy细胞的新鲜单层在单个孔在6孔板中。孵育细胞裂解物2小时在25℃，吸液和添加新鲜的生长中含有青霉素G和放线菌酮。
11. 孵育细胞在37℃ _的 CO 2培养箱中3-5天，这取决于细胞的一般健康状况。
12. 重复步骤2.9-2.10一次或多次，根据需要，传代培养进新鲜的孔中一个6孔板直到正常寻找夹杂物（不含异常机构）已经出现。此时使用倒置荧光显微镜来检查C.衣原体表达mKate2（红色）。
13. 扩大感染的培养物中产生高滴度衣原体股，例如通过从在T-150瓶中生长感染的McCoy或HeLa细胞收获衣原体转化体。

3.感染细胞衣原体

1. 板的GFP HeLa细胞上所需的培养容器，用于高分辨率成像为IFU测定和多孔筛例如玻璃底培养皿或室载玻片，或24孔板中。
2. 解冻来回含C.禅管衣原体，C。 muridarum或 C. 肺炎在冰上并在HBSS中稀释至感染复数（MOI）的所需多样性，例如MOI = 1。
3. 执行基于特定衣原体菌株，将用于静态或离心辅助感染。
   1. 对于感染C.衣原体轻型货车血清型L2或C. muridarum，洗的GFP HeLa细胞用HBSS，并在25℃下孵育稀释的细菌2小时。 ，洗板细胞与HBSS，并培育细胞生长培养基37℃的_二氧化碳培养箱。
   2. 对于感染沙眼衣原体血清型D或C.肺炎 ，洗GFP-HeLa细胞与HBSS，并添加稀释细菌细胞。在吊桶式转子连接在台式离心机的多孔板架放置多孔板或玻璃底菜（用胶带多孔板盖子固定）。
   3. 离心细胞，在900×g离心，在25℃1小时。
   4. 从离心机并置于37℃ _的 CO 2培养箱中取出培养容器1小时。
   5. 吸细胞的生物安全柜，两次HBSS洗涤细胞，并加入新鲜的生长培养基。位置细胞在37℃ _的 CO 2培养箱中培养。

衣原体夹杂物4.活细胞可视化

1. 除去衣原体感染的GFP的HeLa从_二氧化碳培养箱细胞用RPMI替换培养基无酚红+ 5％FBS中。
2. 摩细胞在倒置荧光显微镜（尼康的Eclipse的Ti-E或类似），使用20X或更高的油价目标。
3. 使用图像处理软件（Volocity 6或类似），专注于识别和衣原体感染GFP-HeLa细胞:含有大量的黑洞（ 衣原体包涵体）绿色细胞。
4. 马克包含目的使用映像软件衣原体 -感染的细胞区域的XYZ位置（卷ocity 6或类似）。通过手动'加分'，而在XY舞台视图模式下执行此。以这种方式，XYZ坐标值保存为每个标记的位置。
5. 在采集设置对话框中，配置软件获得绿色（GFP，HeLa细胞细胞质）和红色（mKate2， 沙眼衣原体 ）通道，并在每个通道的新帧，每5分钟的速度。
6. 获取使用协议通过单击"捕捉/记录"按钮上面输入采集的图像序列。

5.定量的活细胞夹杂物生长参数

1. 在期望的时间后感染（如，24，48 HPI）取出衣原体感染GFP-HeLa细胞从孵化器，并安装在一个倒置荧光显微镜。注意:用高NA 20X或40X空气目标是最适合于24孔板，并且一个40X油物镜推荐用于玻片。生长细胞或者基质这个屁股唉。
2. 着眼于细胞，其中包裹体是在其最大直径的中平面和屈服清晰的边缘。
3. 获取图像用于许多领域中的每个孔中（至少每孔10）;井通常代表复制或实验变量。
4. 手动枚举夹杂物的数量，由眼（夹杂物是黑色的隔室中的GFP HeLa细胞），或使用成像软件算法来自动识别和计数的内含物。
   1. 发现GFP-HeLa细胞荧光强度（"找对象"命令），并调整基于细胞的相对强度荧光阈强度。
   2. 使用这些保留仅大于5微米²的大小准则筛选选定的对象。这是"人口1"。
   3. 应用"填写对象洞"利用"人口1"作为输入的命令。此步骤生成'人口2'。
   4. 从'P减"人口1"opulation 2"产生积极的标记衣原体夹杂物，被指定为"人口3"。
   5. 适用尺寸过滤器，以'人口3'（"过滤人口'命令），例如保持对象大于25微米²为在感染的细胞24小时或更长的内含物。对于早期感染倍，如之前18小时，设定尺寸过滤器，以保持物体大于4微米^2，因为这些夹杂物要小得多。尺寸过滤结果被指定为"夹杂物"的对象的人口。
   6. 计算从图像的定量数据，例如，包括数字，夹杂物尺寸，以及夹杂物周，使用图像处理软件。

结果

表达胞质荧光蛋白（例如，GFP）的哺乳动物细胞可被工程化以使衣原体夹杂照明活，感染的细胞培养物。一旦感染衣原体 ，夹杂物如黑点在宿主细胞中（图1）容易看见。荧光缺乏夹杂物的清晰度可以被利用为夹杂物的整个视和/或处理（ 图1）众多领域的自动识别。一旦已经产生荧光的宿主细胞，一个强大的新工作流启用实验样本中衣原体感染水平的快速，定量分析。一个主要的应用是确定衣原体夹杂形成单位（IFU）的活，感染的细胞（ 图2）。此实验策略避免了需要对于在该领域常规使用的免疫过程，它们是既耗时和昂贵的。

所描述的成像方法的另一关键特征是，它可以容易地应用于任何衣原体种或菌株，并且，此外，可开采的衣原体夹杂物重要的生物学特性的推导。作为一个例子，GFP-HeLa细胞的经时分析感染C.衣原体 LGV血清型L2，C。衣原体血清型研发，C. muridarum和 C. ...

讨论

在这里，我们描述实验的策略产生荧光宿主细胞进行实时可视化和衣原体夹杂物的分析。这种液泡可视化方法赋予强大能力来照亮，跟踪和定量测定衣原体夹杂物的动态属性跨细胞群或单细胞中随着时间的推移， 衣原体夹杂在荧光蛋白标记的细胞惊人地明确定义，使得它们很容易识别而不需要附加的免疫处理。此外，这种方法是足够敏感的解决签名形态差异，不同的衣原体物种和菌株拥有，如每个细胞和夹杂曲率空泡号码。此外，我们展示如何成像软件能够适于自动识别中表达GFP的宿主细胞中的内含物。免疫荧光标记步骤为金正日的obviation衣原体夹杂lumination在显著节省时间和成本，端点检测用户结果如夹杂形成单位（IFU）的测定。此外，在活细胞中的能力，以图像夹杂允许感染的细胞的同一人群以精确的时间来分析在衣原体发育周期，从而降低井或必要板的时间进程研究的数目。胞浆GFP，mCherry 等 ，产生明亮，稳定的信号，不从漂白遭受;这个功能对于漫长的时间推移成像实验的关键。最后，由于该技术是独立衣原体发育基因的表达，这是同样有效的蜂窝感染衣原体所有阶段。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668
Opti-Mem	Invitrogen	31985
聚凝胺		Sigma H9268
0.45 µm 过滤器	Fisher	09-719D
G418	Invitrogen	10131
HBSS	Invitrogen	14025
DMEM	Invitrogen	11995
RPMI 1640	Invitrogen	11875
RPMI 1640 w/o 酚红	Cellgro	17-105-CV
青霉素 G	Sigma	13752
放线菌	Sigma	C7698
玻璃底培养皿	MatTek	P35G-1.5-14-C
腔室载玻片，Lab-Tek II	Nunc	154526,154534