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用于研究靶向微血管系统的细菌感染的人源化小鼠模型

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DOI：

10.3791/51134

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2014年4月1日

 ,  , 
1INSERM U970, Paris Cardiovascular Research Centre, 2Faculté de Médecine Paris Descartes, Université Paris Descartes

本文内容

摘要

Neisseria meningitidis 是一种特异性感染人类血管的人类病原体。在本方案中，通过将人类皮肤移植到免疫缺陷小鼠体内，从而在小鼠体内引入人类微血管。细菌广泛黏附于人类血管，导致血管损伤，并引发典型的紫癜样皮疹，这与人类病例中通常观察到的表现一致。

摘要

Neisseria meningitidis 当其进入人体血液后，会引起严重的、常导致死亡的败血症。感染会导致血管广泛受损，进而引发血管渗漏、紫癜样皮疹以及最终的组织坏死。由于该细菌具有高度的人类特异性，此前对这一感染发病机制的研究受到限制， 体内 使模型构建变得困难。在本方案中，我们描述了一种用于该感染的人源化模型，其中包含真皮微血管的人类皮肤被移植到免疫缺陷小鼠体内。这些血管与小鼠的循环系统发生吻合，同时保留其人类特征。一旦引入该模型， N. meningitidis 仅特异性黏附于人源血管，导致广泛的血管损伤、炎症反应，严重时可出现紫癜样皮疹。本方案描述了该模型在以下背景中的移植、感染及评估步骤 N. meningitidis 感染。该技术可应用于多种感染人体血液的人类特异性病原体。

引言

脑膜炎球菌败血症是一种由细菌病原体引起的、常可致命的血液感染 脑膜炎奈瑟菌脑膜炎球菌败血症患者常出现皮肤瘀点或紫癜样皮疹，既往认为这与循环中的细菌及其产物引起的血管破坏有关。1临床患者的皮肤活检显示细菌与微血管相关，常充满血管2除细菌外，紫癜区域还可见广泛的血栓形成、凝固、充血和血管渗漏3-5这种血管损伤可导致皮肤及周围组织广泛坏死，使得脑膜炎球菌感染幸存者需要清创，甚至截肢。了解感染如何引发此类血管损伤，对于优化预防和治疗策略至关重要。目前关于脑膜炎球菌败血症的大多数研究均在 体外 由于对人类的特异性，作用于人类细胞系 N. meningitidis感染的许多方面已被研究 体外 包括细菌黏附、宿主细胞反应以及细胞因子反应6-9IV型菌毛（Tfp）被认为是主要的黏附细胞器 N. meningitidis 在上皮细胞和内皮细胞上10. 还已证明，黏附作用 N. meningitidis 对宿主细胞的黏附依赖于剪切应力，因此被认为与微血管中的血流速率相关11这表明细菌所面临的动态压力 体内 对发病机制至关重要。然而，对小血管的微环境进行建模却非常困难 体外.

Neisseria Tfp 的黏附受体仍不明确，因此目前尚无法设想通过基因敲入策略在动物模型中实现细菌黏附。曾有研究提出 CD46 可能是 Tfp 的受体，并据此构建了转基因动物作为小鼠模型。然而，这些动物感染后并未出现广泛感染或皮疹形成12,13。针对 Neisseria 感染菌血症方面的其他动物模型，则考虑了该细菌对人转铁蛋白作为铁源的偏好性14,15。通过外源补充人转铁蛋白或由转基因表达该蛋白，均可使血液中的细菌载量在较长时间内显著增加，但该模型同样不表现出细菌黏附或皮疹形成16,17。

在本实验方案中，我们描述了一种人源化小鼠模型，该模型将包含真皮微血管系统的人类皮肤移植到免疫缺陷小鼠体内18,19。由此形成的功能性人类血管可与小鼠的循环系统连通并接受灌注。结合人源转铁蛋白的补充，该模型在活体（in vivo）环境中至少再现了脑膜炎奈瑟菌（N. meningitidis）感染的两个人类特异性因素，即人类内皮细胞和人源转铁蛋白。将脑膜炎奈瑟菌（N. meningitidis）通过静脉注射引入该模型后，细菌会特异性地黏附于人类内皮细胞，引发类似于临床患者中所报道的病理变化，包括血管损伤和紫癜样皮疹的形成18。

方案

1. 风险与许可

  1. 所有动物实验方案必须经过当地伦理委员会批准。本实验方案遵循法国和欧洲关于实验动物护理与使用的法规指南（法令 87-848、2001-464、2001-486 和 2001-131 以及欧洲指令 2010/63/UE），并已获得法国巴黎巴黎笛卡尔大学动物实验伦理委员会 Comité d'Ethique en matière d'Expérimentation Animale, Universite Paris Descartes 的批准。批准编号：CEE34.GD.002.11。
  2. 对于人体皮肤样本，已获得患者书面知情同意，所有操作均依照法国国家指南进行，并经法国巴黎当地伦理委员会 Comité d'Evaluation Ethique de l'INSERM IRB 00003888 FWA 00005881 批准。意见编号：11-048。
  3. N. meningitidis 是一种潜在致病性的人类病原体，在处理该生物体时必须采取所有必要的安全防护措施。这些措施包括接种疫苗以及在生物安全二级（Biosafety level 2）条件下操作。

2. 皮肤移植

  1. 尽可能在接近移植时间时采集人体皮肤。本研究中大部分皮肤来自腹部区域的整形外科手术。其他来源如乳房、腿部甚至面部也已成功使用。
  2. 用70%乙醇清洁皮肤表面，并将其平铺于洁净表面上进行处理，最好在通风橱内操作。
  3. 使用预设厚度的取皮刀从皮肤表面切取200–400 µm厚的切片。
  4. 检查皮肤切片的完整性，并将其切成2 cm × 2 cm的正方形；若立即进行移植，则置于不含二价阳离子的PBS中；若需短期保存（3–12小时），则置于含10%血清的DMEM中，4 °C保存。
  5. 通过腹腔注射给予6–8周龄SCID.bg小鼠（约20 g）氯胺酮（100 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）进行麻醉。
  6. 待小鼠麻醉后，通过脚趾夹捏测试检查疼痛反应，这是评估痛觉反射的标准方法。涂抹眼用凝胶以防止角膜干燥，并剃除动物肩部左侧用于移植区域的毛发。整个手术过程中将小鼠置于加热垫上以保持体温。
  7. 完成小鼠术前准备后，用70%乙醇清洁剃毛区域。
  8. 在移植部位局部涂抹表面麻醉剂（Tronothane），并使用弯头剪刀小心去除小鼠皮肤的表层组织，制备移植床。注意避免破坏下方的血管系统。
  9. 去除的皮肤区域应略小于人皮肤切片的面积。
  10. 将皮肤切片从PBS（或DMEM）中取出，覆盖于移植床上，确保表皮面朝上。步骤2.8–2.10应尽快完成，确保移植床不干燥。
  11. 先对齐一角或一边，并用组织胶固定。然后小心将皮肤切片其余部分贴合至移植床，在边缘处点加少量组织胶。应始终将人皮肤修剪至合适尺寸，而非扩大移植床面积。
  12. 不要将皮肤在移植床上拉得过紧，因为小鼠皮肤具有很高的延展性。
  13. 确保移植片的每个角均用组织胶固定牢固。
  14. 用碘溶液清洁操作区域。
  15. 使用创可贴覆盖移植部位，确保其缓冲部分正对移植区。注意创可贴应固定稳妥但不过紧，且不影响动物呼吸。
  16. 用敷料胶带进一步固定创可贴。
  17. 将动物置于温暖表面使其恢复。
  18. 待动物清醒后，将其放回笼中饲养。每笼饲养2–3只动物。
  19. 在恢复期间定期检查小鼠是否出现疼痛或痛苦迹象。移植后10–14天移除创可贴，操作时注意避免损伤移植组织。根据我们的经验，术后疼痛极轻微。尽管如此，动物应每日监测，尤其是术后最初几天。疼痛或痛苦的判断标准如下：
    • 体重减轻超过10%
    • 外观变化，包括毛发状态、弓背姿势、眼睛状况
    • 呼吸频率或心率升高
    • 活动减少或行为异常
    • 体温升高
    • 若发现疼痛迹象，应口服对乙酰氨基酚（300 mg/kg，每4小时一次）。如疼痛持续，须严格执行人道终点处理。
  20. 若移植组织表面干燥，每隔2–3天涂抹婴儿油以保持皮肤柔润。
  21. 移植后21天，移植组织即可用于实验。

3. 感染

  1. 感染前一天，将细菌菌株划线接种至含适当抗生素的 GCB 琼脂平板上，于 37 °C、5% CO2 条件下过夜培养。
  2. 细菌制备
    1. 将细菌重新接种至 5 ml 含 10% 血清的人类内皮细胞 SFM 培养基中，调整初始 OD600 至 0.05。
    2. 在 37 °C、5% CO2 的摇床培养箱中，松盖振荡培养 2 小时，直至细菌密度达到约 OD600 0.1。
    3. 以 15,000 rpm 离心细菌 3 分钟。
    4. 弃上清，用 PBS 重悬后再次离心。
    5. 重复洗涤步骤（2.2.4–2.2.5）两次。
    6. 将细菌沉淀用 PBS 重悬。
    7. 测定 OD600。
    8. 配制 OD600 0.1（108 CFU/ml）或 OD600 1.0（109 CFU/ml）的菌液，根据已知浓度稀释至 107 CFU/ml。尽量在注射前短时间内完成细菌制备。
  3. 小鼠操作
    1. 称量小鼠体重。
    2. 腹腔注射 Ketamine（100 mg/kg）和 Xylazine（10 mg/kg）对小鼠进行麻醉。
    3. 待小鼠入睡后，通过脚趾夹捏测试确认无痛觉反应，使用加热垫保温，并涂抹眼药膏防止角膜干燥。
    4. 每只小鼠腹腔注射 8 mg 人转铁蛋白，用生理盐水或 PBS 重悬。
    5. 从尾部取少量血液滴加至琼脂平板，检测感染前血液无菌状态。
    6. 通过眶后静脉或尾静脉静脉注射 100 µl 浓度为 107 CFU/ml 的细菌培养液（总计 106 CFU）。注射后 5 分钟测得的 CFU 值在不同注射位点间具有一致性。
    7. 注射数分钟后，剪取尾尖少量血液，进行 10 倍稀释后涂布于含适当抗生素的琼脂平板，以确定感染即刻的血液 CFU 水平。
    8. 使用组织胶封闭尾部切口。
    9. 注射后，将细菌接种物进行稀释并涂布于含适当抗生素的琼脂平板，以确定实际接种的 CFU 数量。
    10. 将小鼠置于加热垫上恢复，直至其能够自主活动。
    11. 感染后 6 小时，从尾部采集少量血液，稀释后涂布平板，测定 6 小时的 CFU 水平。
    12. 将所有琼脂平板置于 37 °C、5% CO2 条件下过夜培养。

4. 处死

  1. 在选定的感染时间，通过腹腔注射 Ketamine（100 mg/kg）和 Xylazine（10 mg/kg）对小鼠进行麻醉。
  2. 待小鼠失去意识后，使用加热垫保持其体温。
  3. 当痛觉反射消失（脚趾夹捏无反应）时，剪取尾端并采集血液。
  4. 将血液涂布于含有适当抗生素的琼脂平板上；分别接种 5 μl 原液和 10 µl 1:10 稀释液，以测定菌落形成单位（CFU）。
  5. 通过颈椎脱位法处死小鼠。
  6. 根据所有相关的机构和伦理指南处死小鼠后，通过确认无心跳来验证死亡状态。沿中线做切口，剪开肋骨 cage，然后在心脏上做切口。
  7. 尽可能从心脏/胸腔收集血液，并置于无菌管中。
  8. 将器官（e.g. 肝脏、脾脏、脑组织）取出并放入无菌培养皿中。
  9. 取出皮肤移植物及一段小鼠皮肤，放入无菌培养皿中。
  10. 妥善处理小鼠尸体。
  11. 采集的血液在室温静置凝固 15 分钟后，以 3,000 rpm 离心 15 分钟。
  12. 分离血浆并储存于 -80 °C，用于后续分析，例如通过 ELISA 或基于 FACS 的方法检测细胞因子。

5. 器官CFU计数

  1. 在采集活检样本前，称量每个含有 500 μl PBS 的匀浆管。
  2. 使用无菌活检打孔器从每种组织中采集 4 mm 的活检样本。
  3. 将活检样本放入预先称重的、含有 500 µl PBS 的匀浆管中。皮肤样本使用 2 mm 珠子进行匀浆，其他器官使用较小的珠子。
  4. 将剩余的组织置于 4% 多聚甲醛（PFA）中，4 °C 保存用于显微镜检查（见下文）。
  5. 称量含有活检样本的匀浆管，以确定活检样本重量（用于后续计算每毫克组织中的菌落形成单位数，CFU/mg 组织）。
  6. 匀浆样本。
    1. 以 6,000 rpm 转速匀浆肝脏、脾脏和脑组织，持续 30 秒。
    2. 以 6,000 rpm 转速匀浆皮肤样本，持续 30 秒，必要时重复操作。
  7. 将每个匀浆管中的稀释液涂布于琼脂平板，于 37 °C、5% CO2 条件下培养过夜，以测定各器官的菌落形成单位（CFU）数量。

6. 组织学/免疫组织化学

  1. 固定
    1. 将组织在4% PFA中于4 °C过夜固定。固定时间可更长；若需长期储存，请将组织置于0.25% PFA中。
    2. 用PBS冲洗组织，然后放入20%蔗糖溶液中，并于4 °C继续孵育过夜，或直至组织完全沉入溶液底部。
    3. 用PBS洗涤组织，修整至合适大小后置于OCT包埋剂中（可使用组织模具或将组织粘附于底板上）。
    4. 将组织置于漂浮于液氮中的培养皿上快速冷冻。
    5. 冷冻完成后，立即将组织转移至干冰上，随后保存于-80 °C。
  2. 切片
    1. 从-80 °C取出组织，在冷冻切片机中平衡至-20 °C。
    2. 将组织切成约10–15 µm厚度，并贴附于经处理的显微镜载玻片上。
    3. 将载玻片储存于-20 °C，待使用时取出。
  3. 染色
    1. 将载玻片恢复至室温。
    2. 使用疏水性笔在载玻片上的组织周围画圈，静置5–10分钟。
    3. 用PBS重新水化/洗涤组织切片5分钟，重复两次。
    4. 用含0.1% Triton的PBS溶液对切片进行通透处理，持续10分钟。
    5. 用PBS洗涤2–3次，每次5分钟。
    6. 用含0.1% Triton和1% BSA的PBS溶液封闭，封闭时间根据所用抗体或染料的不同，通常为10–60分钟。
    7. 去除封闭液，加入用封闭液按适当比例稀释的一抗，孵育指定时间（通常为室温1小时或4 °C过夜）。
    8. 用PBS洗涤2–3次，每次5分钟。
    9. 加入用封闭液适当稀释的二抗（通常在此步骤中加入DAPI），在避光条件下孵育指定时间（通常为室温1–2小时）。
    10. 用PBS洗涤2–3次，每次5分钟。
    11. 使用抗荧光淬灭封片剂封片，加盖盖玻片，并用指甲油密封边缘。
    12. 立即进行成像，或于4 °C保存备用。
    13. 使用共聚焦或荧光显微镜进行成像，根据所用荧光染料选择合适的滤光片或激光器。
  4. 组织学
    1. 将用于组织学分析的载玻片恢复至室温。
    2. 按照标准苏木精-伊红（H&E）染色流程对载玻片进行染色。
      1. 将载玻片放入染色架中。
      2. 按以下顺序将染色架连同载玻片依次转移至各溶液中：
      3. 流水冲洗2秒。
      4. 浸入过滤后的苏木精溶液中3分钟。
      5. 流水冲洗10秒。
      6. 蒸馏水中浸洗10秒。
      7. 100%乙醇中浸洗10秒。
      8. 浸入过滤后的伊红溶液中2秒。
      9. 流水冲洗10秒。
      10. 100%乙醇中浸洗10秒。
      11. 二甲苯中浸洗3次，每次2分钟（浴I、II、III）。
      12. 立即取出载玻片，每张滴加少量封固胶，盖上盖玻片，排除气泡，室温干燥数小时。
      13. 在标准白光显微镜下观察并成像。

结果

菌落形成单位计数

的 N. meningitidis 在这些代表性结果中使用的菌株是 N. meningitidis 8013克隆12，一种表达I类SB菌毛蛋白和Opa的C群临床分离株-Opc-PilC1+PilC2+ 20该菌株经基因工程改造，通过染色体插入表达绿色荧光蛋白（GFP）18通过计数琼脂平板上的菌落数量，并根据已知的接种体积计算每毫升血液或每毫克组织中的菌落形成单位（CFU），从而确定细菌菌落形成单位数量。血液计数结果显示，静脉注射后 5 分钟，106 菌落形成单位（CFU）细菌的平均数量为 1.5 x 105 血液中循环的CFU/ml（图1A）。6小时后，计数值平均为4.8 × 104 CFU/ml。至24小时时，平均计数为2.4 × 104 CFU/ml，但在该组10只小鼠中，5只未检测到循环细菌，而其余5只具有相对较高的菌落数图1A). 皮肤样本的菌落形成单位（CFU）计数显示，大多数小鼠在人皮肤上具有较高的定植量，平均达到 2.1 x 104 组织每毫克菌落形成单位在6小时为4.4 × 102 24 小时时每毫克组织的菌落形成单位（CFU/mg）图1B）。对侧小鼠皮肤样本在24小时时未检测到细菌计数，6小时时也仅有极少量，表明了明显的偏好性 N. meningitidis 到移植皮肤中的人类血管（图1B）。通常情况下，其他采集器官中的细菌计数极低或无法检测，尽管有2只动物显示出可能归因于血液污染的细菌计数，因其与较高的循环细菌数量相关。图1C也可用于确定毒力因子的作用 体内，例如 IV 型菌毛。具有特定突变的细菌菌株 pilD 基因21，从而获得一种缺乏Tfp以及其他成分的菌株 pilC1 基因8，缺乏拟议的Tfp“黏附素”的突变株被引入模型。这些突变在人皮肤移植物中未引起任何细菌黏附，证实了Tfp在黏附过程中发挥的关键作用 体内图1D).

免疫组织化学/组织学

在这些实验中，我们使用了 N. meningitidis 表达绿色荧光蛋白（GFP）的菌株，可在无需二次染色的情况下实现荧光检测。人源血管使用人内皮标志物进行染色，标志物为CD31（PECAM-1）或凝集素 荆豆凝集素 (UEA)18,22. UEA 与罗丹明偶联，实现一步染色（图 2A-C）。细胞核可用DAPI染色，以帮助识别组织结构（图2A-B). 组织学采用标准的苏木精/伊红染色进行。皮肤的表皮/真皮交界处清晰可辨。感染后24小时，炎症、血栓形成和血管渗漏主要集中于靠近该交界处的血管图2D）。在多个小型真皮血管中可见血栓形成，常伴有充血和炎症。可观察到红细胞渗出至周围组织，表明血管损伤程度较重。未感染小鼠移植皮肤的组织病理学表现正常，无明显炎症迹象。18在约30%的感染中，细菌在皮肤中的黏附可导致出现肉眼可见的紫癜图2E 和 2F).

细菌生长分析；菌落形成单位计数；比较图；感染研究；人与小鼠模型。
图 1. 菌落形成单位（CFU）计数。（A）感染后 5 分钟、6 小时和 24 小时每毫升血液中的细菌 CFU 计数。（B）感染后 6 小时和 24 小时人皮肤（HS）与小鼠皮肤（MS）样本中的细菌 CFU 计数比较。（C）感染后 24 小时取自其他器官的细菌 CFU 计数。（D）比较感染野生型 N. meningitidis 2C43 菌株（WT）、pilD 基因突变菌株（pilD）或 pilC1 基因突变菌株（pilC1）的小鼠在感染后 24 小时所取人皮肤和小鼠皮肤样本中的细菌 CFU 计数。所有图表均以原始数据展示，并标出中位数。该图改编自 Melicanet al.18 点击此处查看高清图像。

荧光显微镜图像；细胞分布；组织活检；组织学分析；比例尺。
图 2. 显微镜观察。（A）共聚焦图像堆栈的投影，显示靠近真皮（d）与表皮（e）交界处的人类微血管，经UEA凝集素染色呈红色，感染N. meningitidis（绿色）2小时后的情况。（B）一个光学切片及（C）切片投影，显示在皮肤移植组织中感染2小时后，N. meningitidis微菌落（绿色）定植于人血管（UEA – 红色）内。（D）感染N. meningitidis 24小时后的人类皮肤移植组织的苏木精/伊红染色图像。表皮（e）与真皮（d）交界清晰可见，真皮层中微血管出现广泛血栓形成和充血（箭头）。还可观察到炎症反应及部分血管渗漏（箭头所示）。（E）感染前的人类皮肤移植组织。（F）与（E）为同一皮肤移植组织，感染N. meningitidis 24小时后，可见紫癜样区域（箭头）。图 2B、2D、2E 和 2F 改编自 Melican et al.18 点击此处查看高清图像。

讨论

动物模型对细菌致病机制研究至关重要。完全模拟人体感染过程是不可能的 在体内 细胞培养环境中的各种因素正在逐渐被认识，宿主与病原体之间的相互作用受到多种动态因素的影响。某些临床上重要病原体对人类具有特异性，例如 N. meningitidis，HIV，HCV， 恶性疟原虫， 单核细胞增生李斯特菌， 和 伤寒沙门氏菌 限制了……的使用 体内 这些感染的模型。然而，随着我们对决定特异性的感染步骤的逐步了解，人源化模型正在被开发出来。本文所述方案即为这一方向的示范，通过将人源微血管引入小鼠体内，从而实现广泛的 体内 感染 N. meningitidis，导致血管损伤，偶尔出现紫癜性皮疹。

利用该模型，我们已明确Tfp的黏附特性参与了血管定植过程 体内 通过使用细菌突变体，并且在缺乏黏附的情况下血管损伤减少18此前，循环中的细菌产物被认为与这种损伤有关，但我们的研究结果提示局部黏附和血管定植具有决定性作用。这为开发新的治疗靶点提供了新的可能性。若能通过药物手段阻断致病菌的黏附，或许可预防皮肤病变的发生，从而改善脑膜炎球菌感染幸存者的预后，减少组织坏死、清创和截肢的发生。 这项工作还揭示了感染的复杂性以及免疫反应和凝血级联的参与。尽管感染小鼠体内存在的人源内皮细胞数量相对较少，我们仍在其血清中检测到人源细胞因子信号。18这表明存在显著的细胞因子反应，同时伴有小鼠免疫细胞群体向该区域的浸润。

动物模型当然无法完全复制人类疾病，因此必须始终牢记这一局限性来解读所有由此获得的结果。例如，在本模型中，血液和循环细胞均来源于小鼠，我们不能排除它们的行为可能与人类细胞存在差异。然而，正如我们近期发表的研究18所示，这一特点的一个优势在于能够区分来源于人源内皮细胞的信号与来源于循环小鼠细胞的信号。本模型所使用小鼠的免疫缺陷背景还允许异体移植人类免疫细胞群体，从而进一步增强“人源化”特性。然而，小鼠的免疫缺陷背景可能掩盖自然杀伤细胞（NK细胞）、T细胞或B细胞的作用，因为这些细胞在此模型中均缺失或功能缺陷。本模型采用的相对较短的时间范围（24小时）主要适用于研究先天免疫反应，而对于长期感染及免疫应答的形成，则可能需要探索其他模型。

皮肤是脑膜炎奈瑟菌（N. meningitidis）的重要感染部位，但由于人源血管数量相对较少，将所得数据外推至涉及多个器官的全身性感染仍存在困难。尽管该模型可用于研究皮肤病变的形成过程，但脑膜炎球菌感染的一些关键步骤，如跨越上皮细胞和血脑屏障的过程，并未包含在内。因此，仍需进一步优化这些人源化模型，以涵盖感染的其他方面。然而，该模型为多种人类特异性病原体——尤其是靶向血管的病原体——的研究提供了巨大潜力。

披露

作者声明不存在竞争性财务利益。

致谢

作者谨向Dumenil实验室的所有成员致以感谢，特别感谢Silke Silva对本文手稿的审阅。同时感谢欧洲乔治·蓬皮杜医院（Hôpital Européen Georges-Pompidou, HEGP）外科部门及David Maladry博士。  Michael Hivelin 和 HEGP 病理科的 Patrick Bruneval 博士。PARCC 动物实验中心由 Elizabeth Huc 负责。本研究工作得到以下资助机构的支持：Marie Curie IEF 奖学金（编号 273223，KM）、法国国家健康与医学研究院（INSERM）ATIP-Avenir 项目资助、CODDIM 设备资助（法兰西岛大区）、法国医学研究基金会（FRM）设备资助、IBEID 卓越实验室联盟、法国国家科研署（ANR）“Bugs-in-flow”项目资助。资助方在研究设计、数据收集与分析、发表决定或稿件撰写过程中均未发挥任何作用。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
DMEMGibco Invitrogen31885-023
磷酸盐缓冲液Gibco Invitrogen10010-056
氯胺酮 500Virbac France批号：VAL4243
赛拉嗪Bayer HealthcareAMM N° FR/8146715 2/1980批号：KPO809S
Optigel   Europhta
Lacrigel Medicament Autorisé
TronothaneLisa Pharma
GC 琼脂基础培养基Conda1106
人内皮细胞无血清培养基Gibco Invitrogen11111
胎牛血清P A AA15-101
人转铁蛋白Sigma-AldrichT3309
UEA 凝集素-罗丹明Vector LabsRL-1062
苏木精Sigma-AldrichH9627
伊红Sigma-AldrichE4009
二甲苯Sigma-Aldrich534056
Sober Hand 皮片机Humeca BV, Holland4.SB01
动物饲养笼具InnoviveM-BTM-C8
活检打孔器（4 mm）Dominic Dutscher30737
Fast-Prep 裂解基质 M 管MP Bio116923050
MagNA Lyzer Green BeadsRoche3358941001
MagNA LyzerRoche3358976001
VECTASHIELD 封片剂Vector LabsH-1000
Vetbond3M1469SB组织胶
OCT 包埋剂Sakura4583

参考文献

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