活体培养神经元抗体孵育后细胞表面与内化蛋白的差异标记

摘要

我们描述了一种利用特异性多克隆抗体标记活神经元表面蛋白的方法，该抗体针对细胞外表位。通过内吞作用被抗体结合并在细胞表面内化的蛋白，可与在孵育期间仍停留在表面或转运至表面的蛋白区分开来。

摘要

为了验证一种假定的跨膜受体在培养神经元中的细胞表面定位，我们使用针对该蛋白胞外区域产生的特异性一抗，对活神经元表面的蛋白进行了标记。由于受体蛋白会在细胞表面与内部之间转运，如果在固定后对细胞进行通透处理，则同一标记的二抗将同时检测到位于细胞表面和细胞内部的蛋白。在此，我们改进了一种用于研究蛋白转运的方法（“抗体饲喂”法），以区分在抗体孵育期间通过内吞作用被内化的蛋白，以及在此期间仍保留在细胞表面或被转运至细胞表面的蛋白。这种区分两种蛋白池的能力，依赖于在初始孵育步骤中使用荧光标记的二抗处理未通透的神经元后，加入一个过夜的封闭步骤——即用高浓度的未标记二抗进行封闭。封闭步骤完成后，对神经元进行通透处理，即可利用另一种带有不同荧光染料标记的荧光二抗检测被内化的蛋白池。通过该技术，我们获得了关于这种假定受体亚细胞定位的重要信息，证实其确实在神经元中被转运至细胞表面。该技术具有广泛的适用性，可应用于多种细胞类型和细胞表面蛋白，前提是存在针对胞外表位的合适抗体。

引言

在确定新发现蛋白质的功能时，研究该蛋白质的亚细胞定位及其在细胞内的转运过程，可为推测其可能发挥的作用提供重要线索^1,2。对发育中新皮质转录组的生物信息学分析³为我们提供了一份在小鼠大脑皮层发生过程中表达发生改变的基因列表。随后我们采用基因敲除方法证实，其中某个基因sez6所编码的蛋白质在神经元发育中具有关键作用。我们观察到，与惊厥相关的基因6（Seizure-related gene 6），即Sez6蛋白，定位于发育中的树突，并存在于树突棘中；树突棘是树突上接收和整合兴奋性信号的特化结构。此外，当该蛋白质缺失时，树突和兴奋性突触无法正常形成⁴。该蛋白质最可能的主要同工型具有跨膜受体的特征；然而，通过共聚焦显微镜或免疫电镜观察免疫标记蛋白的亚细胞分布时发现，大部分（即使不是全部）信号均与胞体-树突区室中的小囊泡相关，而在细胞表面的质膜上几乎检测不到或完全检测不到蛋白标记信号。

为了确证这种具有预测的大分子胞外结构域的假定受体是否被转运至细胞质膜，我们采用了一种活细胞方法，利用我们针对该蛋白胞外区域制备的抗血清来标记细胞表面的蛋白。通过将这种“抗体孵育”方法与两次使用不同荧光标记的二抗进行孵育相结合，并在两次孵育之间加入充分的封闭步骤和透化步骤，我们能够识别出两个不同的蛋白池，它们可通过结合携带不同荧光标签的荧光标记二抗加以区分。因此，我们能够区分在抗体孵育期间通过内吞作用被内化的蛋白，以及在此期间仍停留在细胞表面或被转运至细胞表面的蛋白。利用该方法，我们证实了目标蛋白在神经元中存在向细胞表面的转运以及从细胞表面的内化过程。因此，尽管所有这些技术均使用了相同的兔多克隆抗血清，但该相对快速且简便的技术所提供的信息量优于传统的免疫细胞化学方法或包埋前免疫胶体金电镜技术。只要存在针对胞外结构域表位的优质抗体，该技术可广泛适用于任何跨膜蛋白的研究。此前该技术已被用于研究谷氨酸受体GluR1亚基的受体转运过程⁵。

方案

1. 分离的海马神经元培养

1. 准备盖玻片（硼硅酸盐玻璃）：
   1. 用100%乙醇洗涤。
   2. 在紫外照射下风干。
   3. 用多聚-D-赖氨酸（0.5 mg/ml 溶于 0.15 M 硼酸盐缓冲液，4 °C 过夜）包被。
   4. 次日（培养当天），用 PBS 洗涤 3 次，然后在 37 °C 下用含 2.5 μg/ml 天然小鼠层粘连蛋白和 5% v/v 热灭活胎牛血清（FCS）的 PBS 溶液包被 2 小时。
2. 解剖胚胎第18天（E18）大鼠海马，收集至含钙和镁的磷酸盐缓冲液（PBS）中，冰上冷藏。注：所有涉及动物的实验方案均经墨尔本大学动物伦理委员会批准。
3. 根据Papase解离试剂盒的说明书配制木瓜蛋白酶和脱氧核糖核酸酶I溶液。
   1. 向1 ml木瓜蛋白酶溶液中加入50 μl DNase I溶液。
   2. 注意：初次配制后，木瓜蛋白酶溶液和DNase I溶液可分别分装成等份（木瓜蛋白酶为0.5 ml，DNase I为25 μl），于-20 °C保存，待用。
4. 尽可能吸除 PBS，将一个胎鼠窝的胚胎海马组织置于 1 ml 木瓜蛋白酶/脱氧核糖核酸酶 I 溶液中，于 37 °C 孵育 15–20 分钟。孵育期间轻弹管壁两次，以混匀内容物。
5. 用火焰抛光的硅化巴斯德移液管轻轻吹打海马组织10-15次（避免产生气泡），直至细胞充分分散，仅残留少量或无未解离的组织块。
6. 将解离后的细胞悬液小心地铺在3 ml含添加剂的汉克斯平衡盐溶液（HBSS）中4% w/v牛血清白蛋白（BSA）的上层⁺；参见第1.6.1节。
   1. 在含有 2 mM CaCl 的 HBSS 中，于室温下不搅拌溶解 BSA，制备此步骤梯度溶液₂，1 mM MgSO₄₄，4 mM NaHCO₃₃ 和 40 mM 葡萄糖（HBSS⁺）然后经无菌过滤，4 °C 保存。
7. 离心，100 × g，7 分钟，使用带有摆动转子的台式离心机。
8. 移除上清液时需小心，避免吸出细胞沉淀。
9. 用火焰抛光（硅化）的巴斯德移液管（或1 ml蓝色移液器吸头）在1 ml完全Neurobasal培养基（含2% B27、0.5 mM L-谷氨酰胺并补充1% FCS）中轻柔重悬细胞沉淀。
10. 使用血细胞计数板计数两份10 μl样品（注意：仅将相位明亮的细胞计为“活细胞”）。
11. 将原代神经元接种于预先制备的包被玻璃盖玻片上（0.75–1 × 10⁵/18 mm 盖玻片置于12孔板中)。铺板前立即吸去盖玻片上多余的层粘连蛋白/血清溶液，并更换为初级神经元培养基（见下文）。注意：所需盖玻片数量需提前确定，因为盖玻片的准备工作需在培养前一天开始（见步骤1.1）。
12. 培养大鼠原代E18海马神经元长达21天 体外 在含有2% B27、0.5 mM L-谷氨酰胺和1% FCS（热灭活）的Neurobasal培养基中培养至7天体外培养（DIV），之后每周进行半量换液。在7 DIV时加入抗有丝分裂剂氟脱氧尿苷/尿苷（每种核苷的10 mM母液按1/1,000稀释），以抑制胶质细胞过度生长。

2. 抗体与活神经元的孵育

1. 在培养的第一周内，神经元正在发育树突分支，到第2-3周时，神经元已充分成熟，能够进行突触形成^6,7。
   1. 在选定的实验时间点，将一抗加入含有原代胚胎神经元的盖玻片培养孔中（每组设三个重复孔）。将一抗分装液直接加入原代神经元的培养基中，达到所需的最终稀释比例。注：在本示例中，使用针对重组分泌型蛋白制备的兔多克隆抗血清，按1/500稀释比例，取2 μl加入1 ml培养基中；在取抗体分装液前，可先以13,000 × g、室温离心10分钟，以去除任何颗粒物，有助于降低背景信号。
   2. 对于免疫前血清对照组，加入等量的免疫前血清（达到相同的最终稀释比例）。若无免疫前血清，可加入等体积的Neurobasal培养基或PBS（无一抗对照）。或者，若存在可识别该蛋白胞内区域的合适一抗，可将其加入对照孔，以验证表面染色的特异性。
   3. 将细胞放回培养箱孵育1-4小时（该孵育时间可根据实验经验确定）。在我们的实验中，抗体在整个孵育期间持续存在，但实验设计也可采用脉冲式加入抗体，随后洗去抗体并继续孵育（即脉冲-追踪实验），以评估内吞过程的时间进程。
      可选步骤：如有需要，可在室温或冰上进行此孵育，以减缓基础蛋白内吞速率。若在无CO₂控制的环境中操作，应在加入抗体/抗血清前更换为非碳酸氢盐缓冲体系的培养基。注意：成熟神经元培养物（>14天，尤其是培养的小鼠胚胎神经元）对完全换液耐受性较差。
2. 我们曾尝试将该一抗内吞步骤的孵育时间设为1小时、2小时和4小时，均获得良好结果，但最佳时间取决于目标蛋白的丰度以及研究细胞中蛋白转运的动力学特征。
   注：代表性结果中的双色图像是在37 °C组织培养箱中孵育1小时后获得的。
3. 在所需孵育时间结束后，吸除含抗体的培养基，用室温PBS轻柔且迅速地洗涤各孔一次。

3. 对固定但未通透的细胞进行二抗孵育

1. 在 pH 7.2 的磷酸盐缓冲液中用 4% 多聚甲醛固定神经元，室温下作用 5 分钟。注意：为获得最佳效果，应使用新鲜配制的固定液； alternatively 可使用储存于 -20 °C 并已完全解冻、无可见多聚甲醛沉淀的固定液。注意：多聚甲醛固定液应在通风橱中配制和操作。
2. 从孔中移除固定液（转移至通风橱中的液体废液容器），并用 PBS 洗涤 3 次。
   1. 可选步骤：如需节省抗体试剂，可用镊子小心地将盖玻片从12孔板中取出，细胞面朝上，放置于一次性培养皿底部预先铺好的Parafilm膜上。
   2. 然后可将溶液轻轻移液至盖玻片上，使其完全覆盖盖玻片，但溶液不得溢出盖玻片边缘至Parafilm上。
   3. 该技术适用于短期孵育（1-2 小时），但更长时间的孵育（例如 应在加湿孵育盒中进行过夜孵育。或者，可将盖玻片放回12孔板的孔中进行过夜孵育，并加入足够体积的液体以确保盖玻片不会干燥。
3. 封闭30分钟 在室温下用含5% BSA的PBS处理（注意： 此阶段切勿向封闭液中添加去污剂，因为必须确保细胞不被通透化。
4. 为了在检测内化蛋白之前标记表面蛋白，需加入选择的第一种荧光标记的二抗。
   注意：在本示例中，一抗血清由兔（本实验室抗体）针对一种重组分泌型异构体产生⁴因此，为了检测未透化的神经元表面跨膜亚型的胞外区域，针对第一种二抗，我们使用了Dylight 649标记的驴抗兔抗体（用含5% BSA的PBS按1:200稀释）。建议在使用前将稀释后的二抗溶液离心（10分钟，13,000 × g，室温）。
5. 将盖玻片在室温下孵育2小时。
6. 用 PBS 清洗盖玻片（在孔中），每次 5 分钟，共洗 2 次。

4. 使用过量未标记的二抗进行封闭

1. 使用高浓度（>0.1 mg/ml）的未标记二抗对未透化的神经元进行封闭。
   1. 该未标记二抗应针对一抗所来源的物种（本例中为兔）产生，于室温下孵育过夜。
   2. 本实验方案中使用了浓度为 0.13 mg/ml 的 AffiniPure F_ab 片段山羊抗兔 IgG（H+L）。
      注意：过夜孵育至关重要，较短的孵育时间（2 小时）不足以完全封闭未被标记二抗充分结合的一抗。
2. 用 PBS 洗涤盖玻片（在孔中），每次 5 分钟，共洗 2 次。
3. 此封闭步骤后，用含磷酸盐缓冲液（pH 7.2）的 4% 多聚甲醛在室温下固定细胞 5 分钟。去除固定剂后用 PBS 漂洗（2 次）（将固定剂转移至通风橱内的液体废弃物容器中）。

5. 透化及施加第二种荧光标记的二抗

1. 在室温下用含0.1% Triton-X-100的5% BSA PBS溶液对细胞进行通透和封闭，处理30分钟。
2. 移除封闭液（注意避免盖玻片干燥）。加入另一种带有不同荧光染料标记的荧光偶联二抗。
   1. 注意：所选荧光染料必须能够与先前使用的荧光染料相区分，具体取决于共聚焦显微镜可用的激发/发射滤光片（见下文）。
   2. 本方案示例中使用了Alexa Fluor 488标记的驴抗兔二抗（1/200稀释于含5% BSA和0.1% Triton-X-100的PBS中），室温孵育2小时，然后移除二抗溶液。
3. 用PBS洗涤盖玻片3次，每次5分钟，最后用去离子水短暂洗涤。

6. 封片与成像

1. 使用含抗荧光淬灭剂的水性封片剂将盖玻片封固于玻璃载片上例如 VECTASHIELD）并使其自然干燥。为最佳保存荧光信号强度，需避光保存于4 °C。
2. 在共聚焦显微镜下观察免疫荧光染色的细胞。
   1. 必须具备用于检测两种荧光信号的合适激发滤光片和发射滤光片。
   2. 若需比较不同实验条件（例如，去极化状态下内化速率的差异）^8,9 或对照条件）下，确保来自不同条件的所有重复盖玻片均使用相同的图像采集参数进行成像。标准感兴趣区域的积分密度或斑点属性（例如 数量、大小）可使用标准图像分析软件从所得图像中进行测量（例如 Fiji/ImageJ，Metamorph

结果

本文介绍的双色荧光免疫染色技术可用于标记活细胞中跨膜蛋白的胞外结构域（示意图见图1）。在孵育过程中，免疫球蛋白会结合可接近的表位，部分蛋白分子群体连同已结合的抗体被内吞进入细胞。此外，新合成的蛋白可通过正向运输到达细胞表面，而循环回收的蛋白分子也可能重新返回质膜¹⁰。

该方法已针对同一靶蛋白的两种不同蛋白池——细胞表面蛋白和内化蛋白的检测进行了优化，使用针对目标蛋白的同一种特异性一抗。通过在细胞透化前对固定后的细胞加入一种荧光标记的二抗，可检测固定时位于细胞表面的蛋白。通过充分的封闭步骤，阻止未与初始二抗结合的剩余蛋白-一抗表面复合物发生非特异性结合，从而可在后续步骤中利用另一种不同荧光素标记的二抗检测在孵育期间被内吞的蛋白-抗体复合物（图 1）。

采用该方法获得的双色标记代表性图像如图2所示。加入长时间（过夜孵育）的封闭步骤，使用相应的未标记二抗，旨在饱和结合任何残留的表面蛋白/一抗复合物，这一操作被证...

讨论

本文所述技术可作为细胞表面生物素化方法（由 Arancibia-Càrcamo et al. 综述）¹² 的补充，是保存内化蛋白亚细胞定位信息的首选方法，前提是存在针对细胞外表位的合适一抗。此外，通过在活细胞与一抗孵育过程中的不同时间点固定盖玻片，可实现对蛋白转运/内化过程随时间变化的定量分析，而无需制备蛋白提取物。

可在共聚焦图像中测量并比较不同条件下（例如，刺激状态与基础水平^8,9）感兴趣区域内的染色强度或点状结构的数量和大小（例如，锥体神经元胞体的顶端区域或距胞体一定距离的近端顶树突）。随后，可将内化受体的信号强度归一化至表面受体的信号强度。 Alternatively，该技术可通过增加一步抗体剥离步骤以去除细胞表面残留的抗体，再经孵育使先前已内化并结合抗体的蛋白重新返回细胞表面，从而适用于定量受体向细胞膜的再循环过程¹³。

利用该方法，我们得以证实Sez6（一种假定的膜受体）能够到达并定位于神经元的细胞表面。因此，该技术成功地实现了此前...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
含钙和镁的 PBS	Invitrogen	14040182
Neurobasal 培养基	Invitrogen	21103-049
B27 添加剂	Invitrogen	17504-044
L-谷氨酰胺	Invitrogen	25030-081
木瓜蛋白酶解离系统	Worthington Biochemical Corporation	PDS
牛血清白蛋白	Sigma Aldrich Australia	A9418
不含钙、镁和酚红的 Hank's 平衡盐溶液	Invitrogen (Gibco)	14175-079
多聚-D-赖氨酸	Sigma Aldrich Australia	P0899
天然小鼠层粘连蛋白	Invitrogen	23017-015	分装前需在冰上解冻
胎牛血清 HyClone	Thermo Fisher
氟脱氧尿苷	Sigma Aldrich Australia	F0503
尿苷	Sigma Aldrich Australia	U3003
18 mm 圆形玻璃盖玻片	Menzel Gläser	CB00180RA1
VECTASHIELD 水性封片介质	Vector Laboratories	H1400
驴抗兔 Dylight 649	Jackson ImmunoResearch Laboratories	711-495-152
AffiniPure Fab 片段山羊抗兔 IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch Laboratories	111-007-003
多聚甲醛	Sigma Aldrich Australia	P6148	有毒 - 需在通风橱中操作
吐温-100	Sigma Aldrich Australia	T8787
Alexa Fluor 488 标记的驴抗兔二° 抗体	Invitrogen - Molecular Probes	A21206