方法文章

制备分段微管以研究由微管末端解聚驱动的运动

DOI：

10.3791/51150

⸱

2014年3月15日

 ,  , 
1Center for Theoretical Problems of Physicochemical Pharmacology, Russian Academy of Sciences, 2Federal Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology, Moscow, Russia, 3Physiology Department, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

微管是本质上不稳定的多聚体，其在生长与缩短之间的转换具有随机性且难以控制。本文描述了使用带有可光解稳定帽的节段化微管的实验方案。通过高时间和空间分辨率触发节段化微管的去聚合，从而有助于分析由微管解聚末端所驱动的运动过程。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

微管去聚合可提供驱动力，用于运输不同的蛋白质复合物及蛋白质包被的微珠 体外其潜在机制被认为在细胞分裂过程中依赖微管的染色体运动中起关键作用，但相关蛋白质及其确切功能尚不明确。因此，迫切需要开发可用于研究此类运动的实验方法。 体外 使用纯化的组分和明确的生化环境。然而，微管本质上是不稳定的多聚体，其在生长与缩短状态之间的转换具有随机性且难以控制。本文所述的实验方案利用了带有光可消融稳定帽的节段化微管。此类节段化微管的去聚合可被高时间和空间分辨率地触发，从而有助于对微管解聚末端的运动行为进行研究。该技术可用于对荧光标记的蛋白质复合物中分子数量进行定量分析，这些复合物能够随着动态微管末端持续移动。为了优化本实验及其他定量荧光检测中的信噪比，应处理盖玻片以减少可溶性荧光标记蛋白的非特异性吸附。本文提供了详细方案，以校正荧光照明不均的问题，并通过等距高斯拟合确定单个荧光分子的强度。最后，我们描述了利用节段化微管研究蛋白包被微珠沿微管依赖性运动的方法，从而揭示不同马达蛋白和非马达蛋白将微管去聚合过程与货物持续运动相偶联的能力。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

微管是高度保守的细胞骨架结构，在细胞形态维持、细胞运动、细胞分裂和细胞内运输中具有重要作用1这些动态聚合物在GTP存在下由微管蛋白组装而成，并能自发地在生长与缩短状态之间转换2微管非常纤细（直径仅为25 nm），因此需采用特殊的光学技术以增强对比度，才能在光学显微镜下观察到微管。以往对这些聚合物的研究曾利用微分干涉差（DIC）技术来观察其动态行为。3。这项及类似的研究 体外 结果显示，在典型的实验条件下，微管发生 catastrophe 并转换为去聚合的现象很少发生，大约每 5-15 分钟一次（该频率对应于在 28-32 °C 下检测的 7-15 mM 可溶性微管蛋白浓度）4因此，人们提出了多种技术以可控的方式诱导微管去聚合。通过洗去可溶性微管蛋白，可触发微管缩短5,6，使用激光束切割微管7或使用片段化的微管8，如本文所述。先前利用被分割的微管以及随机切换状态的聚合物进行的研究发现，较小的细胞内货物（如染色体、囊泡和蛋白质包被的微珠）可在微管缩短的末端发生移动9-13这一现象被认为对有丝分裂细胞中染色体的运动具有直接影响，其潜在机制目前正处于积极研究之中14-16.

近年来，基于荧光的技术（包括全内反射荧光显微镜，TIRF）已被用于研究与动态微管末端相关的运动性17-24该方法的优势在于能够利用不同荧光染料标记的蛋白质，实时观察微管与微管结合蛋白之间的相互作用。研究发现，多种蛋白复合物可随着延伸和/或缩短的微管末端进行持续性移动，其中包括微管相关蛋白Dam110,12,18Ska119，以及 XMAP21520，以及驱动蛋白马达Kif18A21,22，MCAK23 和 CENP-E24这些蛋白质表现出具有持续性的尖端追踪行为，这与经典的尖端追踪蛋白（如 EB1）的追踪方式在本质上不同。25尽管EB1分子及其相关伙伴似乎稳定地与动态微管末端结合，但单个分子与微管尖端的结合仅持续约0.8秒，随后便与可溶性分子库快速交换。26相比之下，像 Dam1 这样的持续性末端追踪蛋白能够随微管末端移动数微米，其与微管末端的结合可持续数十秒。末端结合时间以及由此产生的追踪速率在很大程度上取决于形成末端追踪复合物的分子数量。27较大的蛋白质复合物通常具有更优的追踪微管末端的能力。例如，分离的酵母着丝粒复合体等大型复合结构可与微管末端持续耦合数小时28一些微管结合蛋白， 例如 Ndc80着丝粒蛋白复合物在单分子水平上被发现无法追踪微管末端，然而Ndc80在偶联微珠货物运动方面却非常高效19,29-31因此，为了理解不同蛋白质复合物在尖端追踪中的机制及其生物学功能，有必要研究尖端追踪行为如何依赖于尖端追踪复合物中分子数量的变化，并确定这些复合物在珠状货物表面表现出集体运动能力的情况。

以下我们提供了制备和开展分段微管实验的详细方案（图1A）。首先，将市售的玻璃载玻片进行改造，以连接短段聚乙烯管（方案1）。然后，将该载玻片与经过化学或等离子清洗并硅烷化的盖玻片组装成可重复使用的显微镜流动室（方案2）32-34。最终形成的流动室体积仅为20–25 μl （或低至15 μl，详见方案1中的注意事项3），包括进样管路的体积。也可使用市售的流动室，但其体积通常较大，会导致蛋白质的不必要浪费。若使用较大的流动室，则下述方案中所有溶液的体积应按比例相应放大。随后制备微管种子，例如使用缓慢水解的GTP类似物GMPCPP（Guanosine-5’-[(α,β)-methyleno]triphosphate）（方案3，另见Hyman 等35）。将种子固定在清洁的盖玻片表面，并对表面进行封闭处理，以防止其他蛋白质的非特异性吸附32（方案4描述了使用地高辛标记进行种子固定的步骤）。随后可使用方案5制备分段微管。该方法的主要原理在于：在GTP存在下形成的动态微管聚合物，可通过添加含有GMPCPP的稳定微管蛋白短段“帽”结构而暂时稳定。这些帽结构中还含有罗丹明标记的微管蛋白，因此只需用530–550 nm的激光或汞弧灯照射视野，即可将其去除（方案6）36。随后可利用尖端追踪信号的荧光强度来估算随解聚微管末端移动的分子数量，同时需考虑显微镜照明视野的不均匀性（方案7）。类似的方法也可用于研究去聚合微管与蛋白包被微珠之间的相互作用，微珠的制备方法如文献27所述（方案8）。某些蛋白质可直接结合到分段微管的管壁上，也可使用光镊将微珠固定在微管壁附近，从而促进其结合。

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方案

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所需设备： 下述实验需要配备微分干涉（DIC）和荧光成像功能的光学显微镜（表1）。使用LED明场照明可显著提高对盖玻片上附着的微管种子的检测灵敏度37，而使用常规卤素灯则难以观察到这些结构。为控制显微镜腔室中的液体流动，应使用蠕动泵进行溶液更换，其流速范围需达到10–100 μl/min。也可使用注射泵，但需注意避免在流速突变时产生气泡。在操作蛋白包被的微珠（例如将其移近分段微管壁）时，可将波长为1,064 nm的连续激光束引入显微镜光路，并通过高数值孔径物镜（1.3或更高）聚焦，从而形成光镊。为对单分子荧光强度进行定量分析，激发光源应采用激光器，因其光强稳定性优于汞灯。为最大限度减少机械振动，显微镜应放置在光学平台上。若需在恒定力条件下研究微珠随微管去聚合末端的运动，以及测量单次力信号11,38,39，则需要更复杂的设备，相关方法将在别处详述。

1. 制备可重复使用的流动室

可使用图1B中的示意图从当地玻璃制造厂家订购可重复使用的流动腔室载玻片（有关供应商的详细信息，请参见表2）。通过超声波铣削对普通显微镜载玻片（75 mm × 25 mm，厚度1.0 mm）进行加工，制作两条长度为15±1 mm、宽度为1.0±0.1 mm、深度为0.8±0.05 mm的沟槽。两条沟槽最近端之间的距离应为14±1 mm；该距离与22 mm × 22 mm的盖玻片组装成的腔室最为匹配。其他材料清单见表2。

  1. 在载玻片的每个凹槽中放置一根100 mm长的聚乙烯管（外径0.61 mm，表2），使管子在凹槽内端留出约5 mm的伸出部分。使用氰基丙烯酸酯胶水将管子固定在凹槽内，确保管子完全嵌入凹槽中。
  2. 用环氧树脂胶填充凹槽，注意避免胶水流入管内。让胶水干燥约1天。
  3. 用锋利的剃刀刀片从每个固定位置远端3-4 mm处切割已固化的胶块，去除靠近载玻片中心的近端部分。管子应保留在其凹槽内。去除近端部分的同时也会切断并移除内部的伸出部分，从而形成一个具有两个管口的平整表面。
  4. 用注射器吸取水，测试管路是否通畅。若液体可自由流动，则在凹槽的外端滴加一滴环氧树脂胶（直径约5 mm），干燥1天（图1D）。这将增强腔室的耐用性，使其可重复使用数月。
    注1：若需制备用于倒置显微镜的腔室，需对载玻片进一步改造，在凹槽两端相对位置打两个小孔（图1C）。将管子从孔中穿入，弯曲并紧密嵌入凹槽内（图1E）。按步骤1.2-1.4操作，但需将用于构建流动腔室的整个表面的环氧树脂胶完全去除。
    注2：为减小腔室体积，可通过铣削加工在载玻片上形成两个深度为0.050±0.005 mm的凹陷区域，中间部分保留宽度为5.0±0.5 mm并略为凸起（见图1B和图1C中的“蚀刻区域”）。当流动腔室组装完成后（如下所述），将双面胶带置于这些凹陷区域内。
    注3：为重复使用这些改造后的载玻片，在实验结束后用剃刀刀片移除盖玻片和双面胶带。通过剥离密封剂并用70%乙醇擦拭载玻片进行清洁。将载玻片放入含1-2%实验室洗洁剂的容器中，连接管路至蠕动泵，灌流50-70 ml溶液，随后用等体积去离子水冲洗，干燥后存放于无尘环境中。

2. 盖玻片的准备

本方案耗时6-8小时，可制备12个盖玻片。您需要一个陶瓷盖玻片架和三个带盖的盖玻片染色罐；每个罐的容积应为15 ml，以便每个罐中可叠放4个盖玻片。请使用一个带盖的玻璃瓶（250 ml）用于盖玻片与硅烷的孵育。使用标准的1号玻璃盖玻片（22 mm × 22 mm 或 22 mm × 30 mm，材料清单见表2和表3）。所有操作步骤均应在通风橱中进行，并佩戴手套。

  1. 将盖玻片放入玻璃盖玻片染色罐中，并向罐中加入丙酮。孵育1小时，用去离子水洗涤10次。
  2. 用乙醇孵育盖玻片10分钟，再用去离子水洗涤10次。
  3. 配制“piranha”溶液。将60 ml过氧化氢溶液（30%水溶液）加入耐热玻璃容器中，缓慢加入100 ml浓硫酸（酸与过氧化氢溶液的最终比例为5:3）。溶液会发热，此现象正常，但需谨慎操作。Piranha溶液具有极强腐蚀性！请穿戴厚实的实验服、手套和护目镜！
  4. 用“piranha”溶液填充盖玻片染色罐，盖紧盖子，将罐子置于预热至90 °C的水浴中孵育1小时。
  5. 倒出“piranha”溶液，并按照工作场所的安全规定进行废弃处理。用去离子水洗涤盖玻片10次。
  6. 向盖玻片染色罐中加入0.1 M KOH溶液，孵育10分钟，再用去离子水洗涤10次。此步骤可中和“piranha”处理后残留在盖玻片上的酸性残留物。
  7. 逐个使用聚四氟乙烯（Teflon）涂层平头镊子夹取盖玻片（以尽量减少对玻璃表面的损伤），同时用压缩干燥氮气吹扫，使其干燥。确保盖玻片完全干燥，因为硅烷溶液对水具有高度反应性。
  8. 将干燥后的盖玻片逐个叠放于陶瓷支架中（每个支架可放置12片），陶瓷支架应预先用氮气充分干燥。保持陶瓷支架加盖，防止灰尘附着在盖玻片表面。
  9. 在250 ml玻璃广口瓶（直径6 cm）底部铺上分子筛（564型），用于吸水。
  10. 向瓶中加入200 ml PlusOne Repel Silane溶液，缓慢将装有盖玻片的陶瓷支架浸入瓶中，盖紧瓶盖，在室温下孵育5分钟。此步骤将在盖玻片表面形成疏水涂层。
  11. 缓慢将装有盖玻片的支架从瓶中取出，逐个将盖玻片转移至盛有甲醇的盖玻片染色罐中。
  12. 将金属或玻璃支架放入超声水槽的水槽中，使盖玻片染色罐浸入水中约2/3高度。在70 W功率下超声20分钟，每5分钟更换一次甲醇溶液，然后用去离子水冲洗10次。若硅烷化处理成功，盖玻片从水中取出时应呈现干燥状态。
  13. 同上，使用氮气彻底去除残留水分。
  14. 用Kimwipes纸将盖玻片隔开，避免盖玻片之间表面接触。处理好的盖玻片可在密封容器中室温保存数周。
    注意1：步骤2.1–2.6可用等离子清洗仪清洗盖玻片15分钟（功率30 W）替代，可显著缩短总制备时间。清洗腔内压力设定为100–200 mTorr，可使用大气压或压缩氧气。将经等离子清洗的盖玻片叠放于陶瓷支架中，随后进行步骤2.7。

3. GMPCPP稳定微管种子的制备

该操作过程约需1小时，所得微管种子在室温下可稳定保存1-2天。试剂列表详见表4。

  1. 在冰上混合：
    • 10 μl 未标记微管蛋白（100 μM，表4）溶于BRB-80缓冲液（80 mM Pipes，1 mM EGTA，4 mM MgCl2，用KOH调节pH至6.9；每次实验使用新鲜分装的1-2 mM DTT进行补充）。
    • 2.6 μl 地高辛标记的微管蛋白（表4）。根据制备情况调整体积，使标记与未标记微管蛋白的最终比例约为1:10。用移液器充分混匀。
    • 1.4 μl 10 mM GMPCPP（终浓度为1 mM）
  2. 在35 °C孵育15分钟，微管种子将生长至2-3 μm长。若需不同长度的微管，可调整孵育时间。
  3. 加入35 μl BRB-80缓冲液（预热至35 °C），用移液器混匀，然后在室温下以25,000 × g离心15分钟，沉淀微管种子。
  4. 弃去上清液，通过轻轻加入并吸出50 μl预热的BRB-80缓冲液洗涤沉淀。
  5. 将沉淀充分重悬于25 μl BRB-80缓冲液中。

4. 微管种子与盖玻片的连接

方案4和5各需要2-3小时，因此每天使用两个流式室装置。

  1. 按照制造商的说明使用硅烷化盖玻片组装流动室，并进行步骤 4.2。如果使用自制盖玻片（方案 1），请执行以下步骤。
    1. 将两段双面胶（5 mm × 30 mm）沿中央约 5 mm 宽的区域粘贴，将硅烷化盖玻片置于胶带上并用力按压。
    2. 通过其中一根管子向室内加入 BRB-80 缓冲液，并用圆形牙签堵住两端管口。
    3. 将少量双色 Kwik Cast 封胶剂挤在小型塑料培养皿表面，用牙签快速而充分地混合。封胶剂会变为绿色，应立即使用，仔细密封盖玻片的所有边缘。若封胶剂渗入盖玻片下方过深，可拔出其中一根管子的牙签塞，施加轻微压力，防止封胶剂流入管内。
    4. 让流动室干燥 10 分钟，并确认液体流动未受阻后再继续操作。
  2. 将流动室置于预热至 32 °C 的显微镜载物台上，并将其中一根管子连接至泵以排出液体。进液管长度应尽量缩短，以避免试剂不必要的损耗：推荐长度为 5–7 cm。将此端浸入装有 0.5 ml BRB-80 缓冲液的样品瓶中。本步骤及后续所有溶液均应预热至 32–35 °C。
  3. 通过泵施加轻微压力，或简单抬高出口管末端，以排出可能在移除进液管塞子时偶尔形成的气泡。
  4. 将泵速设定为 100 μl/min。用 2 个室体积的抗地高辛抗体溶液（以 BRB-80 按 1:30 稀释）清洗，孵育 15 分钟，使抗体充分吸附。
  5. 用 5–10 个室体积的温热 BRB-80 缓冲液清洗，随后在 BRB-80 中加入 1% Pluronic F-127，孵育 10 分钟，以封闭硅烷化盖玻片的疏水表面。
  6. 用 5–10 个室体积的运动缓冲液（BRB-80 添加 0.4 mg/ml 酪蛋白）清洗。
  7. 将泵速降低至 10 μl/min，用 30–40 μl 运动缓冲液稀释微管种子（稀释比例为 1:200–1:600），灌注进入流动室。孵育 15 分钟，促进种子与盖玻片上吸附的抗体结合。
  8. 以 100 μl/min 的流速用 400 μl 运动缓冲液清洗流动室，以去除未结合的物质。
    注意 1：最终种子密度应为每个显微镜视野 10–30 根（图 2A）。若需排查问题，可在聚合过程中使用荧光标记的微管蛋白（步骤 3.1），以便更易检测附着于盖玻片的种子。
    注意 2：衣藻（Chlamydomonas40）或其他生物来源制备的轴丝，以及裂解并去纤毛的四膜虫（Tetrahymena）细胞的皮层结构41，也可作为微管成核剂。这些成核剂适用于构建小型微管阵列，当需要特定原纤维数量的微管时尤为适用（GMPCPP 种子可成核一条包含 ≥14 条原纤维的微管42）。这些结构可通过非特异性吸附连接至清洁的盖玻片，但与基于抗体的连接方式相比，其附着稳定性通常较低，尤其是在使用硅烷化盖玻片时。

5. 分段微管的制备

以下所有溶液的体积均适用于15-20 μl的腔室体积；若使用更大的腔室，应按比例增加体积。

  1. 将未标记的微管蛋白混合液（45 μl 运动缓冲液，添加 1 mM Mg-GTP 和 10–15 μM 未标记微管蛋白）在 35 °C 预热 30 秒。以 30 μl/min 的流速灌注。
  2. 使用微分干涉差（DIC）光学系统监测微管生长（图 2B，视频 1）。在 5–7 分钟的孵育期间，微管通常生长至约 10 μm 长。
  3. 配制罗丹明标记的微管蛋白混合液（65 μl 运动缓冲液，添加 0.5 mM GMPCPP 和 2–5 μM 罗丹明标记的微管蛋白，罗丹明与微管蛋白的摩尔比为 0.5–1），并在 35 °C 预热 30 秒。
  4. 立即以 30 μl/min 的流速灌注。孵育 8–10 分钟，以促进在微管末端形成稳定的荧光帽。稳定的微管片段也会自发成核，并可通过 DIC 光学系统观察到。
  5. 以 20 μl/min 的流速用 100 μl 运动缓冲液充分洗涤样品室，以去除微管蛋白、核苷酸以及可溶性微管碎片。
  6. 使用 DIC 确认微管可见（图 2D）；然而，其数量应有所减少，因为在加帽过程中许多微管会发生解聚（视频 2 显示了一个典型的含有片段化微管的视野）。
    注意 1：片段化的微管非常稳定，可至少使用 2 小时。然而，若溶液更换过于频繁，或成像缓冲液中使用了 2-巯基乙醇，则这些微管的寿命会缩短。

6. 蛋白质随微管去聚合末端运动的实验观察

  1. 在10 μl/min的流速下，向腔室中引入30–50 μl荧光蛋白（0.1–20 nM）。若观察到蛋白明显黏附于盖玻片，可在运动缓冲液中添加4–8 mg/ml BSA。Alexa488-Dam1末端追踪实验还需添加10 mM DTT或0.5–1% βME。10.
  2. 使用显微镜视场光阑限制照明范围，以避免微管发生不必要的漂白和解聚。
  3. 使用GFP滤光片立方体开始视频采集，然后在不中断图像记录的情况下切换至Rhodamine滤光片立方体。微管末端的红色片段应清晰可见；它们将迅速开始褪色并解体（视频 3).
  4. 继续照射直至帽状结构几乎消失（通常为10–20秒，但对于使用较低罗丹明标记比率生长的帽状结构，所需时间更长），然后切换回GFP通道，记录蛋白质在微管解聚过程中的追踪情况。
  5. 通过构建明场图像序列（kymographs）分析所得序列， 即 使用 MetaMorph、免费的 ImageJ 或其他图像处理软件，生成在观察期间不同时间点沿微管轴向的荧光强度二维图像）图2E).
    注意1：应根据所观察事件的时间特性调整采集速率。对于移动缓慢、呈环状的Dam1复合物，推荐速率为每秒2-3帧（fps）。27 但单分子的采集时间应为 >20 fps19.
    注2：高灵敏度EMCCD， 例如 ANDOR iXon3 用于快速记录微管去聚合过程中的尖端追踪事件。推荐的 Andor iXon3 相机设置为：增益 5x，EM 增益 200，读出速度 1 MHz，传感器模式 16 位，曝光时间 80 毫秒。
    注意3：使用全内反射荧光显微镜（TIRF）可提高信噪比，但应使用较短的微管，以确保荧光标记的稳定帽结构仍处于隐逝场的作用范围内。

7. 微管末端追踪复合物分子大小的定量分析

该方法的原理是通过计算尖端追踪复合物的总荧光强度与单个荧光基团强度的比值，来确定尖端追踪复合物中分子的数量。此方法可应用于GFP-蛋白融合蛋白以及用荧光染料标记的蛋白，但如果样品中部分蛋白分子不具荧光性，则可能低估尖端追踪复合物中的分子数量。

  1. 记录荧光标记蛋白分子的光漂白动力学。
    1. 使用未修饰的玻璃载玻片、两条双面胶带和一片洁净的盖玻片组装常规显微镜观察室，该观察室可按照完整的方案2制备，或仅通过本方案的步骤2.1–2.6制备。
    2. 加入约 50 nM 蛋白质至运动缓冲液中，用运动缓冲液短暂洗涤，并用 VALAP 密封样品池表4）。优化蛋白浓度以获得斑点均匀分布的视野（图3A），代表单个分子及其小聚集体（三聚体和四聚体，这些聚集体可能在溶液中自发形成，也可能因多个单分子彼此靠近且无法分辨而出现）。此步骤对于获得光漂白步数的多峰分布以及准确确定步长（见下文）至关重要。
    3. 将照明激光强度降至单个荧光点仍可见的最低水平；较低的照明强度可延长光漂白时间，从而获得更长的光漂白轨迹。同时尽量缩短曝光时间，以降低单帧内多个荧光分子发生漂白的概率。Andor iXon3 相机的推荐设置为：增益 5.0x，EM 增益 999，读出速度 10 MHz，曝光时间 50–100 毫秒。
    4. 聚焦于盖玻片表面，关闭照明快门，移动至新的视野，打开照明快门并持续采集图像，直至所有复合物完全漂白（此后称为 img(x,y)).
  2. 校正所获取图像的照明不均匀性（图3B).
    1. 配制任意荧光染料溶液， 例如 1 µM 异硫氰酸荧光素（FITC）的BRB-80溶液。该溶液可预先配制，分装后于-20 °C保存。
    2. 按照第7.1.1节的方法组装一个腔室，但使用普通盖玻片。加入荧光染料溶液，并用VALAP密封腔室。
    3. 收集 >整个显微镜视野的50张图像：在关闭照明快门的情况下将载物台移动至新的未漂白区域，然后在打开快门后立即采集图像。
    4. 使用 ImageJ 或其他软件对该图像序列创建平均投影，并用半径为 5 像素的高斯模糊进行滤波图3C）。所得图像代表了该视场照明强度的分布情况（Illum(x,y)，其中 x 和 y 对应像素的坐标。
    5. 确定该图像的最大像素亮度（最大光照强度).
    6. 关闭照明快门，使用与第 7.2.3 节相同的相机设置采集一幅图像，确定该图像的平均像素强度；此值对应于相机噪声 CN。
    7. 使用上述数值和图像（Illum(x,y)) 以标准化实验图像（img(x,y)）使用以下表达式：
      Equation for image normalization; formula for adjusting illumination; mathematical expression.
      使用生成的图像 图片标准(x,y) 用于对静止荧光复合物的亮度进行定量分析，并对含有尖端追踪复合物的图像进行归一化处理图3D).
  3. 测定单个荧光团的强度。
    1. 使用归一化图像 图片标准(x,y) 使用任意图像处理软件，选择一个直径为5-6像素的圆形区域内的荧光点，测定其在所有帧中的积分强度，从而生成光漂白轨迹。避免选择过亮的荧光点（> 比较暗的信号亮5倍。
    2. 使用相同的圆形区域工具，选择至少3个无斑点区域，生成相应的光漂白轨迹，进行平均后用指数衰减函数拟合。
    3. 将该背景强度曲线进行制表，使其与实验时间点对应，并从光漂白曲线中减去该背景值。
    4. 平滑光漂白曲线（使用3-5个数据点的滑动窗口进行平均）。目视检查所得曲线，剔除显示荧光突然增加或无明显漂白趋势的曲线图3E).
    5. 对于其余每条曲线（通常占总曲线数的50-70%），在荧光点完全漂白后，目视选择最终的平台期。将该段截短，仅保留约100个数据点，并对这些强度值取平均。将此平均值从截短后的光漂白曲线中减去，以最小化背景水平的微小波动，并减小背景峰的大小（如下所示）。
    6. 绘制 20 条或更多光漂白曲线在所有时间点的强度直方图（>1,000 个时间点）。直方图应至少显示 4 个明显的峰（见注释 2）。
    7. 用等距高斯分布拟合直方图10,43 使用 MATLAB、Mathematica 或类似软件（图3F):
      Gaussian sum formula; scientific equation diagram for data fitting and analysis.
      其中 Ai 和 σi , d 和 N 为拟合参数。参数 Ai 和 σi 对应于振幅和宽度 i-峰； d 为峰与峰之间的距离； N 为整数，对应于分布中峰的总数。如果前3个或更多峰的中心在视觉上与拟合直线吻合良好，则这些峰之间的距离（参数 d）对应于单个荧光分子的荧光强度。
      注意1：如果显微镜系统存在显著振动或存在其他噪声来源，应增加检测的点数量（第7.3.6节）例如 不稳定的激光束
      注意2：必须获得 >3 个峰通过等距高斯拟合实现准确分析。如果获得的峰少于该数量，则为假（例如 当照明条件不理想时，可获得双倍步长。 例如 当荧光点漂白过快且单步变化无法清晰分辨时。
  4. 确定端粒追踪复合物的分子大小。
    1. 使用方案6采集的图像，并选择快门打开后立即获取的前2-4帧。如果在观察尖端追踪之前视野已 illumination 一段时间，则根据相同实验条件下光漂白动力学估算原始荧光强度。
    2. 对选定的帧进行平均，并按照第7.2.5-7.2.7节中的方法对所得图像进行归一化处理。
    3. 使用与第7.3.1节相同的区域大小，测量荧光尖端追踪复合物的积分强度。
    4. 测量位于尖端追踪复合体附近的3个背景区域的积分强度，使用相同的区域范围，对这些值取平均，并从第7.4.3节中尖端追踪复合体的强度中减去该平均值。
    5. 将第7.4.4节测得的荧光强度除以第7.3.5节测得的单个荧光分子的强度，计算复合物中荧光分子的数量。
      注意1：第7.4节的照明和采集设置应与第7.1节中的设置保持一致。如果在这些步骤中调整了曝光时间或激光强度，则应对获得的荧光值进行相应校正。然而，此类校正的准确性应通过成像同一样本予以验证例如 在这些不同条件下测量荧光时间并计算所得强度的比值。

8. 利用蛋白包被的微珠追踪微管末端

  1. 通过如方案6所述触发微管解聚，使用尖端追踪微珠进行实验。应降低DIC光源的强度，以便在进行DIC成像的同时观察罗丹明荧光。
  2. 按照Grishchuk 等10 和 Asbury 等11 的方法制备微珠。以10 μl/min的速度将30–50 μl微珠悬浮液注入样品腔。建议微珠浓度为10-16–10-17 M。
  3. 若使用正置显微镜，需将样品腔从显微镜载物台上取下并倒置5–10分钟，使微珠沉降到盖玻片表面。这有助于微珠更好地结合到固定在盖玻片上的微管，但该方法对0.5 μm的聚苯乙烯微珠效果不佳，因其在如此短时间内几乎不发生重力沉降。
  4. 选择一个连接在固定于盖玻片的微管上的微珠；该微珠应沿明显的弧形轨迹运动44（图4A）。被固定的微珠应位于距盖玻片表面1–3 μm的位置，该距离可通过观察偶尔附着在盖玻片上且保持静止的微珠而清晰判断。
  5. 切换至罗丹明滤光片组，并在使用DIC照明的同时开始采集图像。
  6. 打开快门，使用汞灯或530–550 nm激光照射成像区域（通过视场光阑限制照明范围）。持续记录，直至微珠脱离或随解聚中的微管末端移动（图4D、4F和4G）。
    注意1：可使用光镊促进微管壁与蛋白包被微珠之间的相互作用。此方法在使用驱动蛋白马达包被的微珠时尤为有用（图4E–G）。遵循上述相同方案，但在运动缓冲液中添加2 mM Mg-ATP。在步骤8.3中，使用1,064 nm激光束捕获一个自由漂浮的微珠，移动载物台使被捕获的微珠靠近分段的微管壁。使用低光照DIC和罗丹明滤光片组开始成像，并等待微珠开始向加帽的微管末端行走。观察到微珠定向运动后，关闭捕获光束的快门，打开荧光照明的快门。持续记录，直至微珠脱离或随解聚中的微管末端移动。

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结果

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利用去聚合微管末端进行蛋白质追踪。 酵母着丝粒组分 Dam1 是目前所知对去聚合微管末端追踪能力最强的蛋白14。这一由10个亚基组成的复合物可被GFP标记，并能从细菌细胞中高效表达和纯化18,38，因此我们建议将其作为末端追踪实验的阳性对照。当一个荧光蛋白能够随微管去聚合末端移动时，在显微镜下会呈现为一个明亮的荧光斑点，持续向附着在盖玻片上的微管种子方向移动（视频 3）。在相应的明暗图（kymograph）中，该信号表现为一条倾斜的直线（图 2E）。相反，如果该蛋白无法实现末端追踪，则微管缩短过程中其末端不会出现荧光信号的富集，例如人源 Ndc80-GFP 复合物的情况19（图 2F）。当观察到持续性追踪时，可通过追踪移动的荧光点或测量明暗图中斜线的斜率来确定微管缩短速率。这可以提供有关蛋白质与微管末端结合强度的信息45。像 Dam1 环状复合物这样与微管紧密结合的蛋白质，会减缓微管去聚合的速率。然而，这种效应在很大...

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

如今，许多单分子实验常规使用经过特殊处理的盖玻片，以显著减少非特异性蛋白质吸附。本文所述方法是对Howard实验室开发的原始方案32的改进。我们发现，即使在基于微分干涉差（DIC）的珠粒实验（不使用荧光）中，对盖玻片进行硅烷化处理也值得付出努力。使用此类盖玻片组装的样品室表面更洁净，在可溶性微管结合蛋白存在条件下获得的实验结果更具可重复性，尤其是在使用极低蛋白浓度时更为明显。

成功制备分段微管（MTs）最关键的步骤是：

  1. 微管蛋白浓度和孵育时间的优化（步骤 5.1–5.2）。本方案中提供的孵育时间和浓度为近似值，可能因微管蛋白制备物的差异、反应腔体积的不同而有所变化， 等等.
  2. 微管成核位点与盖玻片的特异性紧密附着，以及
  3. 准确控制流速的能力。在我们的实验中，使用密封的流动腔室进行实验时可获得最佳结果。

该方案的主要优势在于，微管去聚合过程可以被高时间分辨率和高空间分辨率地触发，从而有助于分析微管解聚末端的运动行...

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披露

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作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者感谢 F. I. Ataullakhanov 在可重复使用流动腔室的设计与制造方面提供的帮助，感谢 N. Dashkevich、N. Gudimchuk 和 A. Korbalev 提供图示所用图像，感谢 N. Gudimchuk 和 P. Zakharov 开发实验方案并提供用于制备地高辛标记微管种子的试剂，感谢 A. Potapenko 在文本编辑方面的协助，以及 Grishchuk 实验室其他成员提供的建议与讨论。本研究部分由 NIH 基金 GM R01-098389 及宾夕法尼亚肌肉研究所向 E.L.G. 提供的启动基金资助，E.L.G. 为基梅尔学者；F. I. Ataullakhanov 获俄罗斯基础研究基金会（RFBR）基金 12-04-00111-a、13-04-40190-H 和 13-04-40188-H，以及俄罗斯科学院主席团资助（分子系统整合机制和分子与细胞分子生物学项目）；J.R. McIntosh 获 NIH 基金 GM R01 GM033787 资助；V.A.V. 获得德米特里·齐明王朝基金会博士后奖学金资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
表 1.显微镜和其他设备.
Microscope蔡司
尼康		Axio Imager 2
Eclipse Ti		可以使用其他能够进行 DIC 和落射荧光成像的显微镜型号
镜蔡司
尼康		420490-9900-000
CFI Apo 100x 油 1.49		100X， DIC， 1.3-1.49 NA
物镜加热器Bioptechs150803， 150819-19
荧光滤光片立方体Chroma49004 或 49008
41017 或 49020		针对罗丹明荧光进行了优化 
针对 GFP 荧光采集
软件免费软件 MicroManager
分子设备		不适用
MetaMorph 7.5		http://valelab.ucsf.edu/~MM/MMwiki/
其他软件可用于采集图像和粒子跟踪
EMCCD 相机AndoriXon3， DU-897E-cs0-#BV高灵敏度 EMCCD 相机
捕获激光IPGPhotonicsYLR-10-1064-LP1,064 nm 激光器，10 W
荧光激发激光器Coherent， Inc.
Coherent， Inc.		蓝宝石 488 LP
蓝宝石 552 LP		绿色荧光基团激发
荧光基团
等离子体清洗剂Harrick 等离子体PDC-001
商用流动室Warner InstrumentsRC-20 或 RC-30
灌注泵Cole Palmer
Harvard Apparatus		Masterflex 77120-52
Pico Plus		两种泵都提供所需的液体流速，但蠕动泵可能以非常慢的速度脉冲。注射泵的流量在较宽的速率范围内更加一致，但该泵具有惯性。 
表 2.显微镜腔室制备.
用于可重复使用腔室的改性显微镜载玻片科罗拉多州的精确玻璃吹制定制订单www.precisionglassblowing.com 使用示意图在载玻片中 图 1
聚乙烯管Intramedic427410内径 0.58 mm，外径 0.965 mm;使用这些管子将组装好的腔室连接到泵和废液容器
聚乙烯管Intramedic427400内径 0.28 mm，外径 0.61 mm;使用这些管子制作可重复使用的腔室
常规显微镜载玻片VWR48312-003可以使用其他类似载玻片
盖玻片VWR48393-150， 48366-067可以使用其他类似的盖玻片
密封胶World Precision Instruments套件，硅密封胶 5 分钟固化
环氧胶乐泰83082
氰基丙烯酸酯胶粘剂Scotch 3MAD114或其他厂家的氰基丙烯酸酯胶
表 3.盖玻片清洁和涂层.
分子筛，564 级Macron4490-04
盖玻片染色罐Ted Pella， Inc.21036
盖玻片陶瓷支架Thomas Scientific8542e40
PlusOne Repel SilaneGE Healthcare Biosciences17-1332-01
Pluronic F-127Sigma-AldrichP2443
抗地高辛 AB罗氏应用科学11093274910
表 4.从奶牛脑中纯化的种子和分段微管的制备
微管蛋白
Cytoskeleton， Inc
T238P		有关纯化方案，请参见 49–51
未标记的猪微管蛋白
标记的微管蛋白Cytoskeleton， Inc
Invitrogen
Invitrogen		TL590M
C1171（罗丹明）
A-2952（地高辛）		罗丹明标记的猪微管蛋白
微管蛋白可以用任何胺反应性染料标记，如 reference52。
GMPCPPJena BiosciencesNU-405分装并储存在 -70 °C;C
VALAP凡士林、羊毛脂和石蜡质量为 1：1：2参见 reference9
物进行了优化 激发 硅，

参考文献

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