微管是本质上不稳定的多聚体，其在生长与缩短之间的转换具有随机性且难以控制。本文描述了使用带有可光解稳定帽的节段化微管的实验方案。通过高时间和空间分辨率触发节段化微管的去聚合，从而有助于分析由微管解聚末端所驱动的运动过程。
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摘要
摘要
微管去聚合可提供驱动力，用于运输不同的蛋白质复合物及蛋白质包被的微珠 体外其潜在机制被认为在细胞分裂过程中依赖微管的染色体运动中起关键作用，但相关蛋白质及其确切功能尚不明确。因此，迫切需要开发可用于研究此类运动的实验方法。 体外 使用纯化的组分和明确的生化环境。然而，微管本质上是不稳定的多聚体，其在生长与缩短状态之间的转换具有随机性且难以控制。本文所述的实验方案利用了带有光可消融稳定帽的节段化微管。此类节段化微管的去聚合可被高时间和空间分辨率地触发，从而有助于对微管解聚末端的运动行为进行研究。该技术可用于对荧光标记的蛋白质复合物中分子数量进行定量分析，这些复合物能够随着动态微管末端持续移动。为了优化本实验及其他定量荧光检测中的信噪比，应处理盖玻片以减少可溶性荧光标记蛋白的非特异性吸附。本文提供了详细方案，以校正荧光照明不均的问题，并通过等距高斯拟合确定单个荧光分子的强度。最后，我们描述了利用节段化微管研究蛋白包被微珠沿微管依赖性运动的方法，从而揭示不同马达蛋白和非马达蛋白将微管去聚合过程与货物持续运动相偶联的能力。
引言
微管是高度保守的细胞骨架结构，在细胞形态维持、细胞运动、细胞分裂和细胞内运输中具有重要作用1这些动态聚合物在GTP存在下由微管蛋白组装而成，并能自发地在生长与缩短状态之间转换2微管非常纤细（直径仅为25 nm），因此需采用特殊的光学技术以增强对比度，才能在光学显微镜下观察到微管。以往对这些聚合物的研究曾利用微分干涉差（DIC）技术来观察其动态行为。3。这项及类似的研究 体外 结果显示，在典型的实验条件下，微管发生 catastrophe 并转换为去聚合的现象很少发生，大约每 5-15 分钟一次（该频率对应于在 28-32 °C 下检测的 7-15 mM 可溶性微管蛋白浓度）4因此，人们提出了多种技术以可控的方式诱导微管去聚合。通过洗去可溶性微管蛋白，可触发微管缩短5,6，使用激光束切割微管7或使用片段化的微管8，如本文所述。先前利用被分割的微管以及随机切换状态的聚合物进行的研究发现，较小的细胞内货物（如染色体、囊泡和蛋白质包被的微珠）可在微管缩短的末端发生移动9-13这一现象被认为对有丝分裂细胞中染色体的运动具有直接影响，其潜在机制目前正处于积极研究之中14-16.
近年来，基于荧光的技术（包括全内反射荧光显微镜，TIRF）已被用于研究与动态微管末端相关的运动性<....
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方案
所需设备：下述实验需要配备微分干涉（DIC）和荧光成像功能的光学显微镜（表1）。使用LED明场照明可显著提高对盖玻片上附着的微管种子的检测灵敏度37，而使用常规卤素灯则难以观察到这些微管种子。为控制显微镜腔室中的液体流动，应使用蠕动泵以实现10–100 μl/min范围内的流速交换。也可使用注射泵，但在改变流速时需注意避免因流速突变而产生气泡。为操控蛋白包被的微珠（例如将其靠近分段微管壁），可将波长为1,064 nm的连续激光束引入显微镜光路，并通过高数值孔径物镜（1.3或更高）聚焦形成光镊。为对单分子荧光强度进行定量分析，激发光源应采用激光器，因其光强稳定性优于汞灯。为最大限度减少机械振动，显微镜应置于光学隔振台上。若需在恒定力条件下研究微珠随微管解聚末端的运动，以及测量单次力信号11,38,39，则需要更复杂的设备，相关方法将在其他文献中详述。
1. 制备可重复使用的流体室
可使用图1B中的示意图从当地玻璃制造厂家订购可重复使用的流动腔室载玻片（有关供应商的详细信息，请参见表2）。通过超声波铣削对普通显微镜载玻片（75 mm × 25 mm，厚度1.0 mm）进行加工，制备两条长度为15±1 mm、宽度为1.0±0.1 mm、深度为0.8±0.....
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结果
利用微管解聚末端进行蛋白质追踪。 酵母着丝粒组分 Dam1 是目前所知对微管解聚末端具有最强追踪能力的末端追踪蛋白14。该十亚基复合物可用 GFP 标记，并可从细菌细胞中高效表达并纯化18,38，因此我们建议将其作为末端追踪实验的阳性对照。能够追踪微管解聚末端的荧光蛋白在显微镜下表现为一个明亮的荧光斑点，持续向固定在盖玻片上的微管种子方向移动（视频 3）。在相应的线扫图（kymograph）中则呈现为一条倾斜的亮线（图 2E）。相反，若该蛋白无法实现末端追踪，则微管缩短过程中其末端不会出现荧光信号富集，例如人源 Ndc80-GFP 复合物的情况19（图 2F）。当观察到持续性追踪时，可通过追踪移动的荧光斑点，或测量线扫图中斜线的斜率来确定微管缩短速率。该参数可反映蛋白质与微管末端结合的强度45。与微管结合较强的蛋白质（如 Dam1 环状复合物）会减缓微管解聚的速率。然而，这种效应在很大程度上取决于末端追踪复合物的大小.......
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讨论
如今，许多单分子实验常规使用经过特殊处理的盖玻片，以显著减少非特异性蛋白质吸附。本文所述方法是对Howard实验室开发的原始方案32的改进。我们发现，即使在基于微分干涉差（DIC）的珠粒实验（不使用荧光）中，对盖玻片进行硅烷化处理也值得付出努力。使用此类盖玻片组装的样品室表面更洁净，在可溶性微管结合蛋白存在条件下获得的实验结果更具可重复性，尤其是在使用极低蛋白浓度时更为明显。
成功制备分段微管（MTs）最关键的步骤是：
- 微管蛋白浓度和孵育时间的优化（步骤 5.1–5.2）。本方案中提供的孵育时间和浓度为近似值，可能因微管蛋白制备物的差异、反应腔体积的不同而有所变化， 等等.
- 微管成核位点与盖玻片的特异性紧密附着，以及
- 准确控制流速的能力。在我们的实验中，使用密封的流动腔室进行实验时可获得最佳结果。
该方案的主要优势在于，微管去聚合过程可以被高时间分辨率和高空间分辨率地触发，从而有助于分析微管解聚末端的运动行.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢 F. I. Ataullakhanov 在可重复使用流动腔室的设计与制造方面提供的帮助，感谢 N. Dashkevich、N. Gudimchuk 和 A. Korbalev 提供图示所用图像，感谢 N. Gudimchuk 和 P. Zakharov 开发实验方案并提供用于制备地高辛标记微管种子的试剂，感谢 A. Potapenko 在文本编辑方面的协助，以及 Grishchuk 实验室其他成员提供的建议与讨论。本研究部分由 NIH 基金 GM R01-098389 及宾夕法尼亚肌肉研究所向 E.L.G. 提供的启动基金资助，E.L.G. 为基梅尔学者；F. I. Ataullakhanov 获俄罗斯基础研究基金会（RFBR）基金 12-04-00111-a、13-04-40190-H 和 13-04-40188-H，以及俄罗斯科学院主席团资助（分子系统整合机制和分子与细胞分子生物学项目）；J.R. McIntosh 获 NIH 基金 GM R01 GM033787 资助；V.A.V. 获得德米特里·齐明王朝基金会博士后奖学金资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 表1. 显微镜及其他设备。 | |||
| 显微镜 | 蔡司 尼康 | Axio Imager 2 Eclipse Ti | 其他能够进行微分干涉差（DIC）和落射荧光成像的显微镜型号也可使用 |
| 目标 | Zeiss 尼康 | 420490-9900-000 CFI Apo 100x Oil 1.49 | 100倍，微分干涉差（DIC），数值孔径1.3–1.49 |
| 目标加热器 | Bioptechs | 150803, 150819-19 | |
| 荧光滤光立方体 | 染色 | 49004 或 49008 41017 或 49020 | 适用于罗丹明荧光的优化条件 适用于GFP荧光的优化 |
| 采集软件 | 免费软件 MicroManager Molecular Devices | 不适用 MetaMorph 7.5 | http://valelab.ucsf.edu/~MM/MMwiki/ 其他软件可用于图像采集和颗粒追踪 |
| EMCCD相机 | Andor | iXon3, DU-897E-cs0-#BV | 高灵敏度EMCCD相机 |
| 捕获激光 | IPG Photonics | YLR-10-1064-LP | 1,064 nm 激光，10 W |
| 荧光激发激光器 | 相干公司 Coherent, Inc. | Sapphire 488 LP Sapphire 552 LP | 绿色荧光染料的激发 红色荧光染料的激发 |
| 等离子清洗仪 | Harrick Plasma | PDC-001 | |
| 商用流体腔室 | Warner Instruments | RC-20 或 RC-30 | |
| 灌流泵 | Cole Palmer 哈佛仪器 | Masterflex 77120-52 Pico Plus | 两种泵均可提供所需的液体流速，但蠕动泵在极低流速下可能会产生脉冲。注射泵在较宽的流速范围内流量更稳定，但该泵存在惯性。 |
| 表2. 显微镜观察室的制备 | |||
| 用于可重复使用腔室的改良载玻片 | 科罗拉多精密玻璃吹制公司 | 定制订购 www.precisionglassblowing.com | 使用示意图对载玻片进行超声开槽 图1 |
| 聚乙烯管 | Intramedic | 427410 | 内径 0.58 mm，外径 0.965 mm；使用这些管子将组装好的腔室连接至泵和废液容器 |
| 聚乙烯管 | Intramedic | 427400 | 内径 0.28 mm，外径 0.61 mm；使用这些管子制作可重复使用的样品室 |
| 普通显微镜载玻片 | VWR | 48312-003 | 其他类似的载玻片也可使用 |
| 盖玻片 | VWR | 48393-150, 48366-067 | 其他类似的盖玻片也可使用 |
| 硅密封胶 | 世界精密仪器公司 | KIT，5分钟固化硅酮密封胶 | |
| 环氧树脂胶 | Loctite | 83082 | |
| 氰基丙烯酸酯粘合剂 | 3M 透明胶带 | AD114 | 或其他制造商的氰基丙烯酸盐粘合剂 |
| 表3. 盖玻片的清洗与包被。 | |||
| 分子筛，564级 | Macron | 4490-04 | |
| 盖玻片染色缸 | Ted Pella, Inc. | 21036 | |
| 盖玻片陶瓷支架 | Thomas Scientific | 8542e40 | |
| PlusOne Repel Silane | GE Healthcare Biosciences | 17-1332-01 | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | |
| 抗地高辛抗体 | 罗氏应用科学 | 11093274910 | |
| 表4. 种子及分段微管的制备 | |||
| 微管蛋白 | 从牛脑中纯化 细胞骨架公司 | T238P | 纯化方案详见 49–51 未标记的猪源微管蛋白 |
| 标记的微管蛋白 | 细胞骨架公司 Invitrogen Invitrogen | TL590M C1171（罗丹明） A-2952（地高辛） | 罗丹明标记的猪微管蛋白 微管蛋白可用任何胺反应性染料进行标记，方法见参考文献52. |
| GMPCPP | Jena Biosciences | NU-405 | 分装并储存在 -70 °C |
| VALAP | 按质量比1:1:2的凡士林、羊毛脂和石蜡 | 参见参考文献9 |
参考文献
- Desai, A., Mitchison, T. J. Microtubule polymerization dynamics. Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 13, 83-117 (1997).
- Mitchison, T. M., Kirschner, M. W. Dynamic instability of microtubule growth. Nature. 312 (15), 237-242 (1984).
- Walker, R. A., Brien, O., et al.
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重印与许可
