解剖 腹横肌 用于全组织神经肌肉接头分析的肌肉

摘要

在本视频中，我们演示了一种解剖小鼠大脑海马区的实验方案 腹横肌 小鼠肌肉组织的免疫荧光染色与显微镜下神经肌肉接头的观察

摘要

神经肌肉接头形态学分析可为特定运动神经元的生理状态提供重要信息。与传统常用的较厚肌肉（如后肢肌肉）相比，薄而扁平的肌肉分析具有显著优势。例如. 腓肠肌。薄层肌肉可全面展示特定肌肉的完整神经支配模式，从而能够识别出选择性易损的运动神经元池。这些肌肉还允许分析运动单位大小、轴突分支以及终末/结状芽生等参数。使用这类肌肉的一个常见障碍是获得解剖所需的技术专长。在本视频中，我们将详细说明解剖该肌肉的方案 腹横肌 从小鼠的胫骨前肌（TVA）中进行免疫荧光染色以观察神经轴突和神经肌肉接头（NMJs），我们证明该技术可全面展示TVA肌肉的神经支配模式 可用于研究脊髓性肌萎缩症（一种儿童运动神经元疾病）小鼠模型中的神经肌肉接头病理变化。

引言

神经肌肉接头（NMJ）是下运动神经元与骨骼肌纤维之间的突触连接。传统上认为，它是一种三联突触结构，由神经元（突触前终末）、肌纤维（突触后终末）和终末施万细胞¹组成。在多种运动神经元疾病及其小鼠模型中，NMJ似乎是病理过程中早期且重要的靶点^2,3。典型的病理表现包括去神经支配，即运动终板失去突触前神经支配，突触前终末肿胀，以及NMJ形态复杂性的降低^4-11。同时可观察到代偿性反应，例如终末和结状出芽，即轴突从残留的突触终末或郎飞结延伸出来，重新支配已去神经的终板^12,13。由于突触活动与NMJ形态之间存在紧密关联，通过分析NMJ的形态可获得关于运动神经元功能状态的大量信息。由于NMJ的丧失通常是神经肌肉病理变化的最早表现之一^4,10，对神经支配水平进行定量分析可为病理进展及潜在治疗干预的效果提供重要信息。此外，鉴于NMJ的丧失是疾病进展中的关键环节，开发能够稳定神经肌肉连接并促进其再生的治疗方法可能带来显著的临床益处。

在分析神经肌肉接头（NMJ）形态时，肌肉的选择至关重要。需要考虑的主要因素可能包括肌纤维类型、身体部位以及与人类疾病状态的可比性。此外，若实验涉及物质注射或创伤性神经损伤等操作，还需考虑肌肉的实验可及性。通常情况下，最好选择分布在身体不同部位、代表多种运动单位亚型的肌肉进行综合分析。然而，实际操作中肌肉的选择往往受解剖难易程度的影响。因此，神经肌肉接头的分析常局限于肢体中较大的肌肉，例如 腓肠肌为了在这些肌肉中获得良好的神经肌肉接头染色，通常需要对肌纤维进行切片或机械性破坏。其结果可能导致神经支配模式受损，从而影响对神经支配模式、神经芽生及去神经状态的全面且高质量的分析。另一种方法是使用无需切片的薄而扁平的肌肉，这类肌肉可整体进行染色和封片，从而实现对整块肌肉神经支配情况的全面观察。可用于此类分析的肌肉有多种，包括一组颅肌（涵盖 耳上提肌, 耳上肌，以及 长耳收肌)¹⁴，胸肌（例如. 胸骨三角肌)¹⁵，以及腹部（例如 腹横肌 （TVA）肌肉。使用这些肌肉的主要障碍在于，需要具备高超的技术水平才能在不造成损伤的情况下完成其解剖分离。

在本视频中，我们提供了一种从小鼠中分离胸腰椎前外侧腹肌（TVA）并进行免疫荧光标记的实验方案，以全面分析其神经支配模式及神经肌肉接头（NMJ）的形态。TVA 肌肉是一种以慢缩纤维为主的肌肉，构成腹部肌层最深层，由下部肋间神经支配。既往研究表明，在多种脊髓性肌萎缩症（SMA）——一种儿童运动神经元疾病——的小鼠模型以及其他早发性运动神经元变性小鼠模型中，TVA 肌肉始终表现出高度的病理易损性^4,16。因此，我们认为 TVA 肌肉是研究周围神经病变中 NMJ 变化的理想肌肉组织。

方案

所有操作均应遵循机构规定的动物护理标准。

1. 小鼠腹部肌肉组织的解剖

1. 开始前，配制4%多聚甲醛（PFA）。注意：操作PFA时务必在通风橱内进行，并穿戴适当的防护装备。
2. 采用批准的方法处死小鼠。注意： 视频中的小鼠通过过量CO₂吸入及颈椎脱位法处死。该小鼠为4周龄野生型小鼠，品系背景为CD1/C57Bl6杂交系。该小鼠由中国台湾渥太华大学动物实验中心从最初购买的小鼠繁殖而来。
3. 在髋部水平处的皮肤做初始切口，并环绕小鼠身体一周完全切开皮肤。
4. 向上剥离皮肤，直至前肢水平位置。
5. 在髋部水平切开腹壁肌肉，并继续切开至脊柱位置。
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6. 此时开始向上切开肌肉和肋骨，直至到达上肢位置。
7. 横向直接切开，直至对侧脊柱位置。
8. 向下切开，直至回到起始点。
9. 从下方松解膈肌（注意不要损伤TVA肌），并将其置于含磷酸盐缓冲液（PBS）的SYLGARD包被解剖皿中，使用0.2 mm解剖针固定。
10. 将肋骨连同相关肌肉组织在解剖皿中铺开，浅层朝上，确保肌肉完全伸展。
11. 吸去1×PBS，更换为4% PFA。
12. 加盖后置于室温摇床上固定15分钟。
13. 在室温下用1×PBS洗涤3次，每次10分钟。

* 此时，固定好的肌肉可在冰箱中放置过夜，然后再进行后续解剖。

2. TVA 肌的分离

1. 在解剖显微镜下进行TVA肌肉的分离时，首先在最后几根肋骨水平处切开腹外斜肌（参见图1中的标注示意图）。
2. 沿腹白线旁垂直向下切开（注意不要切到下方的TVA肌肉），直至到达腹内斜肌起始部位。
3. 然后横向切开，将上方的rectus abdominis和腹外斜肌从下方TVA肌肉的上部游离出来。
4. 清除TVA肌肉上的血管及任何覆盖的脂肪组织。
5. 将肌肉从上方最后一根肋骨处松解。
6. 沿肌肉边缘进行环切，将其完整剥离并转移至含有PBS的24孔板中。

3. TVA 肌肉的免疫荧光标记与显微镜观察

后续所有步骤中，使用细尖移液器去除液体，并将培养板置于摇床上。除非另有说明，所有后续步骤均在室温下进行。

1. 在含有1:1,000荧光标记的α-银环蛇毒素的PBS中孵育30分钟，以标记神经肌肉接头（NMJs）。此步骤可在避光环境或锡箔纸包裹下进行。
2. 每孔加入300 µl含2% Triton X-100的PBS，对肌肉组织进行通透处理，并置于摇床上孵育30分钟。
3. 在封闭液（4% BSA，1% Triton溶于PBS）中孵育30分钟。
4. 在含一抗（神经丝蛋白抗体1:100；突触小泡蛋白2抗体1:250）的封闭液中，4 °C过夜孵育。
5. 用1× PBS洗涤3次。
6. 在含1:250二抗的PBS中孵育2–4小时。
7. 用1× PBS洗涤3次。
8. 取适量荧光封片剂将肌肉组织贴附于玻璃载片上，并加盖盖玻片。
9. 使用标准落射荧光显微镜配备双通道滤光片观察载片效果最佳。
10. 建议使用配备至少40X 物镜的共聚焦显微镜，通过z轴序列投影成像以获得最佳NMJ图像。

结果

上述方案指导对TVA肌肉进行分离和染色，以用于神经肌肉接头（NMJ）分析。该方法可实现对肌肉神经支配模式的整体观察，以及对NMJ形态的高分辨率分析（图2）。该技术已成功应用于揭示运动神经元疾病小鼠模型中的NMJ病理变化，例如脊髓性肌萎缩症（SMA）^4,17（图3）。在SMA小鼠模型中，肌肉内的病理表现存在显著差异，但TVA肌肉始终受到严重影响。这表现为运动终板失神经支配、突触前终末神经丝积聚以及终末侧枝出芽（图3）。因此，本文展示的结果表明，上述技术可作为一种有力的方法，全面评估小鼠模型中的神经支配状况及NMJ病理变化。

图1. 小鼠腹部肌肉组织的概览。（A）图像显示了附有腹部肌肉组织的胸廓结构，该组织取自一只刚被实施安乐死的小鼠，并将其腹侧朝上固定于解剖皿中（A）。（B）对（A）中的解剖结构进行了标注，以标示腹部肌肉的大致边界。解剖图左侧可见浅层腹部肌肉，包括腹外斜肌（以蓝色轮廓标出）和rectus abdominis（以红色轮廓标出）。在解剖图右侧，浅层肌肉已被去除，从而可观察到腹横肌（transversus abdominis，以绿色轮廓标出）和腹内斜肌（以黄色轮廓标出）。本实验方案的目标是指导解剖腹横肌（TVA）上部区域，该区域在此图中以实心绿色三角形表示。点击此处查看高清图像。

图2. TVA肌中神经肌肉接头的全装整体概览。 图像显示了通过神经丝蛋白（NF；绿色）、突触小泡蛋白2（SV2；绿色）和竹芋毒素（BTX；红色）免疫荧光染色可视化TVA肌中的典型神经肌肉接头（NMJ）。图像为拼接的荧光显微照片，展示整个肌肉（A），或共聚焦显微镜下显示的NMJ群组（B）及单个NMJ（C）。比例尺 = 800 µm（A），70 µm（B），25 µm（C）。 点击此处查看高分辨率图像。

图 3. SMA 小鼠模型 TVA 肌肉中的神经肌肉接头病理变化。共聚焦显微图像显示了通过神经丝蛋白（NF；绿色）、突触小泡蛋白 2（SV2；绿色）和竹荪毒素（BTX；红色）免疫荧光染色标记的 TVA 肌肉中的神经肌肉接头（NMJ），样本来自对照组（Smn^2B/+）或 SMA 小鼠模型（Smn^2B/-）。注意，在对照组小鼠中可观察到正常的 NMJ 形态，而在 Smn^2B/- 小鼠的 TVA 肌肉中，则可见完全去神经支配（白色箭头）、部分去神经支配（紫色箭头）、终末出芽（蓝色箭头）以及突触前肿胀（黄色箭头）的迹象。此外，突触后终板结构也较简单，提示表型明显更不成熟。比例尺 = 50 µm。 点击此处查看高分辨率图像。

讨论

在本视频中，我们详细介绍了从小鼠中分离TVA肌肉以及对肌肉内神经肌肉接头进行全组织免疫荧光标记的实验方案。我们还展示了相关数据，表明该肌肉可用于分析脊髓性肌萎缩症（SMA）小鼠模型中的神经肌肉接头病理变化。

该技术的成功依赖于多个因素。以下列出了一些最常见的问题。首先：免疫组织化学染色效果差。造成这一问题的原因可能有多种，其中最常见的原因之一是使用了本方案中未列出的试剂。确保使用高质量的电子显微镜级PFA对获得良好的染色结果至关重要，同时本方案中所列抗体的选择也极为重要。此外，在较年老的动物中（即. > 3个月后），获得高质量的染色可能更加困难。这是由于包裹肌肉的筋膜增厚，以及腹外斜肌之间脂肪堆积增加所致。 腹横肌 在进行免疫荧光染色之前，必须去除脂肪组织。有时还需要去除覆盖在肌肉表面的筋膜，因为筋膜可能会增厚。在剥离筋膜和脂肪时，难免会对肌纤维造成一定程度的损伤，并可能破坏神经支配模式。然而，如果该技术操作得当，即使年龄长达至少1年的成年小鼠，仍可获得高质量的染色结果。对于更年幼的小鼠（即. 年龄小于3个月时），无需进行任何肌纤维的分离或撕扯操作。第二：解剖和染色后难以找到神经肌肉接头（NMJs）。这通常是由于解剖范围未延伸至最后一根肋骨下方所致。大多数神经肌肉接头位于最后一根肋骨的正下方，因此必须注意确保该部分肌肉被包含在解剖范围内。第三：腹外斜肌（EO）与腹横肌（TVA）之间的黏连。当操作者试图将解剖范围延伸至腹内斜肌（IO）以下时，常会遇到此问题。在腹内斜肌与腹横肌重叠的区域，由于难以区分不同肌肉，分析起来更为困难。因此，我们通常仅解剖腹横肌最上部区域。在此水平，腹外斜肌与腹横肌之间无黏连，因此不应构成显著问题。

与四肢肌肉相比，使用TVA肌肉的一个显著障碍是其在手术操作或物质注射方面的可及性。这类实验对于研究特定肌肉中神经肌肉接头（NMJ）的生理学特性至关重要。尽管TVA肌肉的可及性确实低于常用的胫骨前肌（tibialis anterior）或腓肠肌（gastrocnemius），但先前的研究已表明，通过手术损伤肋间神经可实现TVA肌肉的去神经化¹⁸。我们近期也在全身麻醉条件下利用该肌肉进行了局部给药实验（未发表数据）。尽管这些实验可能带来一定的技术挑战，但本工作表明其具有可行性，从而拓展了该肌肉在病理和生理干预条件下用于神经肌肉接头分析的应用价值。

腹外斜肌（TVA）是分布于全身的多块薄而扁平的肌肉之一，可用于神经支配模式的整体封片分析。其他可用的肌肉包括由脑干面神经核发出的运动神经元所支配的一组颅部肌肉，涵盖levator auris longus、auricularis superior和adductor auris longus，其解剖方法已有先前报道^14,19。此外，围绕TVA肌肉的其他腹壁肌群，包括腹外斜肌（EO）、腹内斜肌（IO）和rectus abdominis，也可进行标记并用于神经肌肉接头（NMJ）分析。在小鼠模型中对NMJ病理进行综合分析时，应考虑分布于全身的多块肌肉，而不应局限于单一肌肉。这一点在运动神经元疾病的小鼠模型中尤为明显，不同肌肉之间的NMJ病理程度存在显著异质性²⁰。这种肌肉间的差异性在研究运动神经元易损性机制时具有极高的研究价值 ，因此，若将分析局限于单一肌肉，可能会显著削弱研究的潜力。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
16% 甲醛水溶液	电子显微镜科学公司	15700
Dumont #5 镊子	Fine Science Tools	11251-10
斜面弹簧剪	Fine Science Tools	15006-09
精细剪刀 - ToughCut	Fine Science Tools	14058-09
SYLGARD 184 硅酮弹性体试剂盒	道康宁	取决于本地供应商	使用此物制作用于固定肌肉的解剖皿
微型固定针	精细科学工具	26002-20
α-竹叶青蛇毒素，Alexa Fluor 488 标记物	Invitrogen	B-13422
牛血清白蛋白	Sigma Aldrich	A4503
神经丝初级抗体（2H3），上清液	发育研究杂交瘤库
SV2 一抗（SV2），上清液	发育研究杂交瘤库
山羊抗小鼠IgG（H+L）	杰克逊免疫研究实验室	115-166-003
荧光封片剂	Dako	S3023
载玻片（Superfrost Plus；白色）	Fisher	12-550-15
盖玻片	Fisher
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787
CD1/C57Bl6 小鼠	杰克逊实验室