应激条件下通过多聚核糖体分析检测翻译起始

摘要

本文介绍了一种用于分析真核细胞在应激条件下mRNA翻译起始变化的方法。该方法基于正在翻译的核糖体与非翻译核糖体在蔗糖梯度中沉降速度的差异进行分离。

摘要

mRNA翻译的精确调控对于真核细胞的稳态至关重要，尤其是在应对生理和病理应激时。该调控程序的异常可能导致受损细胞的异常增殖——这是癌症发展的标志，或导致细胞过早死亡，如在神经退行性疾病中所见。目前关于翻译调控分子机制的许多认识均来自利用密度梯度分离系统进行的多聚核糖体（polysome）分析。该技术依赖于将细胞质提取物在蔗糖线性梯度溶液中进行超速离心。离心完成后，可对对应于不同翻译中核糖体群体的区带进行分离和定量，从而获得多聚核糖体图谱（polysome profile）。多聚核糖体图谱的变化提示了在各种应激条件下翻译起始过程发生的变化或缺陷。该技术还可用于评估特定蛋白质在翻译起始中的作用，并测量特定mRNA的翻译活性。本文中，我们描述了用于构建多聚核糖体图谱的实验方案，以评估真核细胞和组织在正常或应激生长条件下的翻译起始情况。

引言

真核细胞 constantly 遭遇多种有害的生理和环境应激条件，需要迅速产生适应性细胞反应。细胞应激反应涉及促生存与抗生存作用因子之间的精确平衡。打破这种平衡可能导致不可逆的后果，引发癌症和神经退行性疾病等人类病理学疾病的发生。在应激反应的第一阶段，细胞会激活促生存通路，该过程涉及在 mRNA 翻译水平上对基因表达变化的协调调控。

真核生物中的mRNA翻译是一个复杂的细胞过程，涉及翻译起始因子（eIFs）、特定的RNA结合蛋白（RBDs）与RNA分子之间的协调相互作用¹。mRNA翻译可分为三个明确的阶段：起始、延伸和终止。尽管这三个阶段均受到调控机制的影响，但翻译调控机制主要靶向翻译的起始阶段，因此该阶段构成了蛋白质合成的限速步骤²。

翻译起始是一个高度有序的过程，首先由eIF2α·GTP·Met-tRNA_i^Met三元复合物的形成开始，该复合物随后与40S核糖体亚基结合，形成翻译前起始复合物。下一步是将前起始复合物招募至mRNA，此过程涉及翻译起始因子如eIF4F和eIF3的参与。由此形成的48S前起始复合物经历特定的构象变化，使该复合物能够沿mRNA的5'非翻译区进行扫描，直至识别起始密码子AUG。随后，大多数翻译起始因子被释放，60S亚基被招募，形成具有翻译活性的80S核糖体复合物，此时蛋白质合成开始（图1）。在同一时间，多个80S单体核糖体可同时翻译同一条mRNA，形成所谓的多聚核糖体（或多核糖体）。mRNA上多聚核糖体的密度反映了翻译的起始、延伸和终止速率，因此可作为特定转录本可翻译性的衡量指标。然而，多聚核糖体图谱主要用于评估mRNA翻译在起始阶段的变化。在本研究中，我们使用了一种蛋白酶体抑制剂作为翻译起始抑制剂。用该药物处理癌细胞会诱导一种应激反应，其特征是应激激酶HRI被激活，进而磷酸化翻译起始因子eIF2α³。eIF2α的磷酸化是导致哺乳动物细胞中翻译起始受到抑制的主要事件之一⁴。

方案

该方案遵循以下指南 经拉瓦尔大学伦理审查委员会批准。

1. 细胞培养与脑组织操作的准备

1. 哺乳动物和 果蝇 细胞
   1. 培养HeLa宫颈癌细胞和Schneider 果蝇 建议使用美国模式培养物集存库（ATCC）推荐的胚胎细胞，并在低代次时进行实验操作。
   2. 以每孔细胞密度适宜的培养板接种细胞，确保实验当天细胞融合度达到80%。为获得最佳结果，请使用 ∼12 x 10⁶ 每种实验条件下细胞的数量。在制备多聚核糖体分析用提取物之前，加入新鲜的完全培养基，至少刺激翻译90分钟。
2. 脑组织分离：从出生后9至16天的小鼠中分离脑组织。安乐死采用CO₂ 麻醉后通过吸入法实施安乐死并进行颈椎脱位。处死后，完整分离全脑，并将其置于-80℃保存 °C 或直接转移至预冷的 1× PBS 中，立即使用。

2. 密度梯度分馏系统的制备

1. 用 0.1% SDS 清洗管路系统 5 分钟。
2. 用 70% 乙醇清洗管路系统 5 分钟，然后用 RNaseZAP 溶液清洗 5 分钟 ，最后用 DEPC 水清洗。
3. 泵入空气以干燥仪器的管路系统。

3. 蔗糖梯度的制备

1. 在 20 mM Tris-HCl pH 7.4、1.25 mM MgCl₂ 中配制 15% 和 55% 的蔗糖溶液₂，150 mM NaCl 和 1 mM DTT。
2. 生成 使用 Isco Model 160 梯度混合仪，按照制造商说明书制备线性 15–55% 蔗糖梯度。然而，必须严格控制 TRIS 蠕动泵的流速，以避免梯度中产生气泡或湍流。将梯度置于 4 °C 保存 °C，直至使用。
3. 在梯度混合仪程序运行期间，将超速离心机冷却至4 °C.

4. 细胞和小鼠脑组织提取物的制备

1. 细胞提取物的制备
   1. 将培养板置于冰上，洗涤细胞3次 用预冷的1× PBS冲洗。
   2. 收获细胞（∼12 × 10⁶) 加入 1 ml 裂解缓冲液（20 mM Tris-HCl，pH 7.4，1.25 mM MgCl₂）中₂，150 mM NaCl，1 mM DTT，1% Nonidet P40，5 U/ml RNase抑制剂，并加入完整的无EDTA蛋白酶抑制剂混合片剂），转移至Eppendorf管中，反复吹打15次以充分混匀 使用1 cc U100胰岛素注射器（28 G 1/2）进行操作。将细胞裂解液置于冰上静置15分钟。
   3. 在载玻片上滴加数滴细胞裂解液，使用10倍物镜在相差显微镜下观察，以评估细胞裂解情况。裂解完全时应仅可见细胞核，无细胞膜残留。作为对照，同时观察未裂解的细胞。
   4. 在4℃下以11,000 × g离心20分钟，澄清细胞裂解液 °C，并保留含有多聚核糖体的可溶性裂解液。
2. 小鼠脑组织提取物的制备
   1. 匀浆化整个分离的脑组织（∼在冰上使用2 ml裂解缓冲液，以Dounce匀浆器匀浆（10次冲压）500 mg组织，随后在4°C下以11,000 × g离心15分钟，澄清匀浆液 °C.
   2. 将所得上清液加载至50%蔗糖垫上，使用超速离心机转子TH-641，在4 ℃、200,000 × g条件下离心沉降2小时 °C.
   3. 将含有多聚核糖体的半透明沉淀重悬于1 ml裂解缓冲液中，通过上下吹打充分混匀。将悬液置于冰上静置30分钟。 在加载到梯度之前。

5. 将提取物上样至蔗糖梯度并进行超速离心

1. 使用分光光度计测定细胞质提取物中RNA的浓度。小心且缓慢地加载 ∼20 OD₂₆₀ 将提取物的单位上样至15%至55%的蔗糖梯度中。确保离心管表面留有2-3毫米的可用空间，以防止离心过程中液体溢出。
2. 使用超速离心机，以 TH-641 转子在 4 °C 条件下于 230,000 x g 离心 2 小时 30 分钟，对梯度样品进行离心 °C. 离心结束后，取出离心管，小心放置于冰上，避免扰动密度梯度。

6. 多聚核糖体分析用细胞质提取物的分级分离

1. 将蔗糖梯度置于自动密度分馏系统中，并按照制造商说明进行自动分馏及组分收集（每份0.5 ml）。
2. 收集每一份馏分（∼500 µl) 分别收集到各个Eppendorf管中，同时持续监测254 nm处的吸光度。在进行梯度组分分离操作的同时，多聚核糖体图谱将被记录在记录纸上。或者，可使用连接至图表记录仪的数据采集装置，以实现多聚核糖体图谱的电子化采集。
3. 每次运行结束后，将收集的Eppendorf管转移至干冰上。此时，可将收集的组分在-80℃保存 °C 或按如下步骤直接沉淀蛋白质-RNA 复合物。

7. 蛋白质提取与分析

1. 向蔗糖梯度中收集的每一份组分加入两倍体积的预冷100%乙醇，于-20 °C孵育过夜，使RNA-蛋白质复合物沉淀。
2. 将每份RNA-蛋白质沉淀物在4 °C下以11,000 × g离心20分钟，随后用70%乙醇洗涤。干燥后，将沉淀重悬于SDS-PAGE上样缓冲液中，再使用特异性抗体进行Western blot分析（见图 2）。

8. RNA 提取与分析

1. 沉淀RNA-蛋白质复合物，步骤同7.1。将每份RNA-蛋白质沉淀物重悬于含有0.1% SDS的裂解缓冲液中。加入终浓度为2 mg/ml的蛋白酶K，消化沉淀物中的蛋白质组分30分钟。 55 毫升 °C 水浴
2. 通过加入1体积的裂解液提取沉淀物中的RNA组分 "苯酚：氯仿"，加入2倍体积的氯仿和0.1倍体积的2 M NaOAc（pH 4），在4℃下以10,000 × g离心 °C 为 20分钟。将各样本所得水相在-20℃沉淀RNA过夜 °C，通过加入1体积的异丙醇和0.2 µ克/µl 的糖原。在 4℃ 下以 10,000 × g 离心沉淀 1 小时 °C. 用70%冷乙醇洗涤RNA沉淀。
3. 将RNA沉淀重悬于少量无RNase的水中。测定其含量 和质量 使用分光光度计测定RNA含量。

结果

如前所述，多聚核糖体图谱可用于分析在应激条件下翻译起始的变化。图1展示了翻译起始的简化示意图，如前所述，该过程为多步骤过程，涉及翻译起始复合物的有序组装。在正常生长条件下，翻译起始复合物转化为多聚核糖体，通过多聚核糖体图谱检测到这些多聚核糖体，表明翻译起始处于活跃状态（图2；未处理组）。然而，在应激条件下，翻译起始受到抑制，导致80S单体核糖体积累，同时多聚核糖体峰减少（图2；蛋白酶体抑制剂处理组）。

讨论

蔗糖梯度中的多聚核糖体图谱分析可通过检测从细胞或组织中分离的多聚核糖体的密度来评估翻译起始效率^9,11-14。该技术是目前测量体内（in vivo）翻译起始的最优（即使不是唯一）方法。它被用于监测细胞周期过程中增殖细胞的翻译状态¹⁵，并评估多种应激因素（包括病毒感染、缺氧^13,16、辐射¹⁷以及治疗中使用的化学药物¹⁸）对翻译起始的影响。然而，尽管该技术在评估细胞培养物及特定组织（如脑和肝）的翻译起始方面效果良好，但其是否可用于比较正常组织与病变组织及肿瘤之间的翻译起始水平，仍有待确定。

在影响翻译延伸或终止的条件下，多核糖体图谱也可能发生变化。在这些情况下，翻译延伸速率受到抑制将导致多核糖体峰增加，而终止过程受到抑制则应导致相对于对照组出现更大的多核糖体。相反，翻译起始抑制剂会阻止多核糖体的重新形成，因为活性翻译起始复合物的形成被阻断。这在多核糖体图谱中表现为多核糖体峰减少，同时伴随80S单体核糖体的增加。由于翻译抑制剂使翻译起始复合物停滞，预期40S和...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
细胞
HeLa 宫颈癌细胞	美国模式培养物集存库（美国弗吉尼亚州马纳萨斯；ATCC）	CCL-2
Schneider Drosophila 胚胎细胞	美国模式培养物集存库（美国弗吉尼亚州马纳萨斯；ATCC）	CRL-1963
培养基与添加剂
Schneider’s Drosophila 培养基	Sigma-Aldrich	SO146-500ml
DMEM	Life technologies	11995-073
FBS	Fisher Scientist Scientist	SH30396-03
青霉素/链霉素	Life technologies	15140122
蔗糖溶液
D-蔗糖	Fisher Scientist	BP220-212
甘油	Sigma-Aldrich	49767
溴酚蓝	Fisher Scientist	B3925
裂解缓冲液
Tris HCl	Fisher Scientist	BP153-500
MgCl2	Sigma-Aldrich	M2670-100G
NaCl	Tekniscience	3624-05
DTT	Sigma-Aldrich	D 9779
Nonidet P40（Igepal CA-630）	MJS Biolynx	19628
SDS	Tekniscience	4095-02
RNase 抑制剂（RnaseOUT 重组核糖核酸酶抑制剂）	Life technologies	10777-019
抗蛋白酶（complete, mini, EDTA free）	Roche	11,836,170,001
RNA 提取
蛋白酶 K	Life technologies	AM2542
苯酚:氯仿	Fisher Scientist	BP1754I-400
氯仿	Fisher Scientist	C298-500
糖原	Life technologies	10814-010
异丙醇	Acros organics	327270010
抗体
抗 FMRP 抗体	Fournier et al., Cancer Cell International, 2010