本文介绍了一种用于分析真核细胞在应激条件下mRNA翻译起始变化的方法。该方法基于正在翻译的核糖体与非翻译核糖体在蔗糖梯度中沉降速度的差异进行分离。
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本文内容
摘要
摘要
mRNA翻译的精确调控对于真核细胞的稳态至关重要，尤其是在应对生理和病理应激时。该调控程序的异常可能导致受损细胞的异常增殖——这是癌症发展的标志，或导致细胞过早死亡，如在神经退行性疾病中所见。目前关于翻译调控分子机制的许多认识均来自利用密度梯度分离系统进行的多聚核糖体（polysome）分析。该技术依赖于将细胞质提取物在蔗糖线性梯度溶液中进行超速离心。离心完成后，可对对应于不同翻译中核糖体群体的区带进行分离和定量，从而获得多聚核糖体图谱（polysome profile）。多聚核糖体图谱的变化提示了在各种应激条件下翻译起始过程发生的变化或缺陷。该技术还可用于评估特定蛋白质在翻译起始中的作用，并测量特定mRNA的翻译活性。本文中，我们描述了用于构建多聚核糖体图谱的实验方案，以评估真核细胞和组织在正常或应激生长条件下的翻译起始情况。
引言
真核细胞 constantly 遭遇多种有害的生理和环境应激条件，需要迅速产生适应性细胞反应。细胞应激反应涉及促生存与抗生存作用因子之间的精确平衡。打破这种平衡可能导致不可逆的后果，引发癌症和神经退行性疾病等人类病理学疾病的发生。在应激反应的第一阶段，细胞会激活促生存通路，该过程涉及在 mRNA 翻译水平上对基因表达变化的协调调控。
真核生物中的mRNA翻译是一个复杂的细胞过程，涉及翻译起始因子（eIFs）、特定的RNA结合蛋白（RBDs）与RNA分子之间的协调相互作用1。mRNA翻译可分为三个明确的阶段：起始、延伸和终止。尽管这三个阶段均受到调控机制的影响，但翻译调控机制主要靶向翻译的起始阶段，因此该阶段构成了蛋白质合成的限速步骤2。
翻译起始是一个高度有序的过程，首先由eIF2α·GTP·Met-tRNAiMet三元复合物的形成开始，该复合物随后与40S核糖体亚基结合，形成翻译前起始复合物。下一步是将前起始复合物招募至mRNA，此过程涉及翻译起始因子如eIF4F和eIF3的参与。由此形成的48S前起始复合物经历特定的构象变化，使该复合物能够沿mRNA的5'非翻译区进行扫描，直至识别起始密码子AUG。随后，大多数翻译起始因子被释放，60S亚基被招募，形成具有翻译活性的80S核糖体复合物，此时蛋白质合成开始（图1
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方案
该方案遵循以下指南 经拉瓦尔大学伦理审查委员会批准。
1. 细胞培养与脑组织操作的准备
- 哺乳动物和 果蝇 细胞
- 培养HeLa宫颈癌细胞和Schneider 果蝇 建议使用美国模式培养物集存库（ATCC）推荐的胚胎细胞，并在低代次时进行实验操作。
- 以每孔细胞密度适宜的培养板接种细胞，确保实验当天细胞融合度达到80%。为获得最佳结果，请使用 ∼12 x 106 每种实验条件下细胞的数量。在制备多聚核糖体分析用提取物之前，加入新鲜的完全培养基，至少刺激翻译90分钟。
- 脑组织分离：从出生后9至16天的小鼠中分离脑组织。安乐死采用CO2 麻醉后通过吸入法实施安乐死并进行颈椎脱位。处死后，完整分离全脑，并将其置于-80℃保存 °C 或直接转移至预冷的 1× PBS 中，立即使用。
2. 密度梯度分馏系统的制备
- 用 0.1% SDS 清洗管路系统 5 分钟。
- 用 70% 乙醇清洗管路系统 5 分钟，然后用 RNaseZAP 溶液清洗 5 分钟 ，最后用 DEPC 水清洗。
- 泵入空气以干燥仪....
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结果
如前所述，多聚核糖体图谱可用于分析在应激条件下翻译起始的变化。图1展示了翻译起始的简化示意图，如前所述，该过程为多步骤过程，涉及翻译起始复合物的有序组装。在正常生长条件下，翻译起始复合物转化为多聚核糖体，通过多聚核糖体图谱检测到这些多聚核糖体，表明翻译起始处于活跃状态（图2；未处理组）。然而，在应激条件下，翻译起始受到抑制，导致80S单体核糖体积累，同时多聚核糖体峰减少（图2；蛋白酶体抑制剂处理组）。
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讨论
蔗糖梯度中的多聚核糖体图谱分析可通过检测从细胞或组织中分离的多聚核糖体的密度来评估翻译起始效率9,11-14。该技术是目前测量体内（in vivo）翻译起始的最优（即使不是唯一）方法。它被用于监测细胞周期过程中增殖细胞的翻译状态15，并评估多种应激因素（包括病毒感染、缺氧13,16、辐射17以及治疗中使用的化学药物18）对翻译起始的影响。然而，尽管该技术在评估细胞培养物及特定组织（如脑和肝）的翻译起始方面效果良好，但其是否可用于比较正常组织与病变组织及肿瘤之间的翻译起始水平，仍有待确定。
在影响翻译延伸或终止的条件下，多核糖体图谱也可能发生变化。在这些情况下，翻译延伸速率受到抑制将导致多核糖体峰增加，而终止过程受到抑制则应导致相对于对照组出现更大的多核糖体。相反，翻译起始抑制剂会阻止多核糖体的重新形成，因为活性翻译起始复合物的形成被阻断。这在多核糖体图谱中表现为多核糖体峰减少，同时伴随80S单体核糖体的增加。由于翻译抑制剂使翻译起始复合物停滞，预期40S和.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
P. A. 是某项奖学金的获得者 "Pierre Durand" 来自拉瓦尔大学医学院。本研究由加拿大自然科学与工程研究委员会资助（项目编号：MOP-CG095386），授予 R. M.；多核糖体分级分离仪通过加拿大创新基金会资助（项目编号：MOP-GF091050）购得，授予 R. M.。R. M. 获得加拿大卫生研究院（CIHR）新研究者薪金奖。
我们感谢 E. Khandjian、I. Gallouzi、S. Di-Marco 和 A. Cammas 博士提供的有益建议。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 细胞 | |||
| HeLa 宫颈癌细胞 | 美国模式培养物集存库（美国弗吉尼亚州马纳萨斯；ATCC） | CCL-2 | |
| Schneider Drosophila 胚胎细胞 | 美国模式培养物集存库（美国弗吉尼亚州马纳萨斯；ATCC） | CRL-1963 | |
| 培养基与添加剂 | |||
| Schneider’s Drosophila 培养基 | Sigma-Aldrich | SO146-500ml | |
| DMEM | Life technologies | 11995-073 | |
| FBS | Fisher Scientist Scientist | SH30396-03 | |
| 青霉素/链霉素 | Life technologies | 15140122 | |
| 蔗糖溶液 | |||
| D-蔗糖 | Fisher Scientist | BP220-212 | |
| 甘油 | Sigma-Aldrich | 49767 | |
| 溴酚蓝 | Fisher Scientist | B3925 | |
| 裂解缓冲液 | |||
| Tris HCl | Fisher Scientist | BP153-500 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2670-100G | |
| NaCl | Tekniscience | 3624-05 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D 9779 | |
| Nonidet P40（Igepal CA-630） | MJS Biolynx | 19628 | |
| SDS | Tekniscience | 4095-02 | |
| RNase 抑制剂（RnaseOUT 重组核糖核酸酶抑制剂） | Life technologies | 10777-019 | |
| 抗蛋白酶（complete, mini, EDTA free） | Roche | 11,836,170,001 | |
| RNA 提取 | |||
| 蛋白酶 K | Life technologies | AM2542 | |
| 苯酚:氯仿 | Fisher Scientist | BP1754I-400 | |
| 氯仿 | Fisher Scientist | C298-500 | |
| 糖原 | Life technologies | 10814-010 | |
| 异丙醇 | Acros organics | 327270010 | |
| 抗体 | |||
| 抗 FMRP 抗体 | Fournier et al., Cancer Cell International, 2010 |
参考文献
- Gebauer, F., Hentze, M. W. Molecular mechanisms of translational control. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 5 (10), 827-835 (2004).
- Jackson, R. J., Hellen, C. U. T., Pestova, T. V. The mechanism of eukaryotic translation initiation....
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重印与许可
