我们描述了一种实时PCR方案，用于分析脑脊液（CSF）中的microRNA。除RNA提取步骤外，该方法可推广应用于从其他体液、培养细胞或组织样本中提取的RNA。
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本文内容
摘要
摘要
microRNA（miRNA）通过引导RISC复合物结合到mRNA上的靶位点，从而调控翻译抑制，在基因调控中发挥重要作用。miRNA表达水平的改变已被证实参与所有主要复杂性疾病的发生发展。此外，最近的研究发现，miRNA可被分泌至细胞外环境，进入血液及其他体液，并在其中稳定循环。这类循环miRNA的功能目前仍不明确，但系统性的高通量研究方法（如miRNA表达谱芯片）已帮助识别出多种病理状态下的miRNA特征谱，包括神经退行性疾病和多种癌症。在此背景下，我们近期研究报道了脑脊液中miRNA表达谱的鉴定结果，使miRNA成为极具潜力的生物标志物候选分子。
目前有多种可用于微小RNA（microRNA）分析的工具，例如微阵列、实时定量PCR（qPCR）和深度测序。本文中，我们描述了一种利用实时定量PCR技术对脑脊液中的微小RNA进行高灵敏度分析的方法。我们采用了Exiqon公司的人源微小RNA即用型PCR检测试剂盒I和II V2.R版本，可检测742种独特的人源微小RNA。实验中每组样本均进行三次重复检测，并使用GenEx Professional 5软件对数据进行处理与分析。
利用本方案，我们已成功对多种类型的细胞系和原代细胞、脑脊液、血浆以及福尔马林固定石蜡包埋组织中的微小RNA进行了谱型分析。
引言
microRNA 属于小分子非编码 RNA 家族，长度约为 21-23 个核苷酸，可在转录后水平调控基因表达。microRNA 可被分泌到细胞外空间，在其中表现出相对稳定性。尽管检测 miRNA 表达水平的变化对于生物标志物的鉴定具有重要意义，但进行 miRNA 表达谱分析并处理大量数据可能具有挑战性。
本文介绍了一种利用高灵敏度实时PCR检测脑脊液（亦适用于其他体液）中miRNA表达变化的实验方案。同时，我们还描述了数据分析软件的使用方法，包括统计分析和结果的图形化展示。整个流程相对简单直接，所需时间相对较短，具体时长取决于待分析样本的数量以及可用的实时PCR仪数量。实验部分要求对RNA操作和向384孔板加样时具备较高的精确性，而使用GenEx软件进行数据分析则需要具备一定的生物信息学和统计学基础知识。
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方案
以下方案描述了从脑脊液（CSF）中分离RNA并使用预装PCR板进行microRNA分析的标准操作流程。需要注意的是，有机相抽提步骤为可选步骤，在提取过程中向样品添加了载体RNA，以确保RNA的最大回收率。因此，无需对RNA进行定量。
总体而言，如果在前一天完成 cDNA 的合成（约 2 小时），则平均每天可运行 6 至 8 块板。数据分析需在所有样本完成检测并载入软件后进行。根据样本数量/组别或用于比较的组合情况，数据分析可能需要一至数小时。
1. RNA 提取
RNA 提取自脑脊液（CSF）样本，样本以等分试样形式储存于 -80 °C 冰箱中直至分析。本实验采用 mirVana Paris 核酸分离试剂盒，按照制造商提供的总 RNA 分离说明书进行操作。请注意，尽管该试剂盒可实现小 RNA 物种的富集，但本实验未进行此步骤，总 RNA 分离完成后即结束 RNA 提取流程。此外，尽管 mirVana Paris 核酸分离试剂盒（与其他市售 RNA 分离试剂盒类似）无需有机提取步骤，但下文仍提供该操作的实验方案。
RNA 提取方案包括两个步骤：
1.1. 有机提取（使用 mirVana Paris RNA 提取试剂盒时无需此步骤）
1.2.2. 总 RNA 分离
1.1. 有机提取....
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结果
本研究的结果此前已发表1。图1展示了使用geNorm软件对候选参考微小RNA（microRNA）进行分析的结果。据此，筛选出两个微小RNA，即miR-622和miR-1266，作为参考基因，用于标准化微小RNA的表达值。
对于脑脊液研究，我们设置了三组样本：HIV-（n=10），HIVE（n=4），以及无脑炎的HIV感染者（HIV+， n=5）。HIVE组与HIV+组分别与对照组HIV-组进行比较。经统计分析（2.3.3节），发现11种microRNA的表达水平差异具有统计学意义。1. 图2 表示这11个microRNA（miR-1203、-1224-3p、-182*、-19b-2*、-204、-362-5p、-484、-720、-744*、-934 和 -937）的箱线图。每列显示各组样本中数据的分布情况（绿色代表HIVE组，红色代表无脑炎的HIV+组）。须线表示中位数、1st (Q1) 和 3.......
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讨论
microRNA是一类小分子非编码RNA，通过抑制翻译和/或促进mRNA降解来调控基因表达2。由于在无细胞环境中具有高度稳定性，microRNA已在多种体液中被检测到。此外，microRNA的特异性表达谱与多种人类癌症的发生阶段和/或进展密切相关3-9。
目前有多种可用于微小RNA（microRNA）分析的工具，包括经典的芯片阵列或最新的深度测序技术。然而，我们选择采用一种高灵敏度的qPCR平台10,11，其额外优势在于所需RNA量极少。miRCURY LNA Universal RT microRNA PCR方案经过优化，每20 µl cDNA合成反应仅需20 ng总RNA，完整双板阵列则需40 ng。在处理脑脊液（CSF）或福尔马林固定石蜡包埋组织等珍贵且难以获取的临床样本时，能够使用少量RNA显得尤为重要1。重要的是，使用低量RNA可最大限度降低样本中潜在抑制物的浓度。内参（spike-in）出现超出范围的Ct值，很可能表明样本中存在某些抑制物。.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本项目由美国国家心理健康研究所资助，资助编号为 R01MH079751（项目负责人：F. Peruzzi）。本内容仅由作者负责，不一定代表美国国家心理健康研究所或美国国立卫生研究院的官方观点。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
表3. 设备清单 | |||
| Finnpipette Novus 多通道移液器 | 赛默飞世尔科技 | HH05279 | |
| 芬尼特移液器吸头 | 赛默飞世尔科技 | 9400613 | |
| Thermal Cycler C1000 | 伯乐（Biorad） | ||
| 0.2 ml 低矮透明 PCR 管 | 伯乐（Biorad） | TLS0801 | |
| 平盖条 | 伯乐（Biorad） | TLS0803 | |
LightCycler 480 实时荧光定量 PCR 系统 | 罗氏 | ||
LightCycler 480 密封膜 | 罗氏 | 04 729 757 001 | |
| 冷藏离心机 5804R | Eppendorf | ||
| 摆动转头转子，4 位 | Eppendorf | A-4-44 | |
| 台式迷你离心机 | Fisher | 05-090-100 | |
| 台式涡旋混合器 | Fisher | ||
| 1.5 ml 微型离心管，已灭菌 | Fisher | 02-681-5 | |
| 25 ml 矩阵试剂储液槽 | 赛默飞世尔科技 | 8093 | |
| Thermomixer Confort | Eppendorf | ||
台式小型离心机 Sigma 1-15 | Sigma | ||
| 台式涡旋混合器 | Velp Scientifica | F202A0173 | |
表4. 试剂列表 | |||
| 通用 cDNA 合成试剂盒，16-32 次反应 | Exiqon | 203300 | |
| SYBR Green预混液，通用反转录酶，25 ml | Exiqon | 203400 | |
| 超纯去离子水，无DNase、无RNase | Invitrogen | 10977-015 | |
| microRNA 即用型 PCR 人类芯片（I+II）V2.R | Exiqon | 203608 | |
mirVana miRNA 提取试剂盒，可进行 40 次提取 | Ambion | AM1556 | |
| MS2 RNA 载体 | 罗氏应用科学 | 10165948001 | |
2-巯基乙醇 98% | Sigma Aldrich | M3148-25ml | |
| 乙醇 100% | Carlo Erba | 64-17-5 | |
| 无核酸酶水 | Qiagen | 1039480 | |
RNA酶清除剂 | Ambion | AM9780 |
参考文献
- Pacifici, M., et al. Cerebrospinal fluid miRNA profile in HIV-encephalitis. J. Cell. Physiol. 10, (2012).
- Krol, J., Loedige, I., Filipowicz, W. The widespread regulation of microRNA biogenesis, function and decay. Nat. Rev. Genet.. 11, 597-610 (20....
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