我们描述了一种实时PCR方案，用于分析脑脊液（CSF）中的microRNA。除RNA提取步骤外，该方法可推广应用于从其他体液、培养细胞或组织样本中提取的RNA。
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摘要
摘要
microRNA（miRNA）通过引导RISC复合物结合到mRNA上的靶位点，从而调控翻译抑制，在基因调控中发挥重要作用。miRNA表达水平的改变已被证实参与所有主要复杂性疾病的发生发展。此外，最近的研究发现，miRNA可被分泌至细胞外环境，进入血液及其他体液，并在其中稳定循环。这类循环miRNA的功能目前仍不明确，但系统性的高通量研究方法（如miRNA表达谱芯片）已帮助识别出多种病理状态下的miRNA特征谱，包括神经退行性疾病和多种癌症。在此背景下，我们近期研究报道了脑脊液中miRNA表达谱的鉴定结果，使miRNA成为极具潜力的生物标志物候选分子。
目前有多种可用于微小RNA（microRNA）分析的工具，例如微阵列、实时定量PCR（qPCR）和深度测序。本文中，我们描述了一种利用实时定量PCR技术对脑脊液中的微小RNA进行高灵敏度分析的方法。我们采用了Exiqon公司的人源微小RNA即用型PCR检测试剂盒I和II V2.R版本，可检测742种独特的人源微小RNA。实验中每组样本均进行三次重复检测，并使用GenEx Professional 5软件对数据进行处理与分析。
利用本方案，我们已成功对多种类型的细胞系和原代细胞、脑脊液、血浆以及福尔马林固定石蜡包埋组织中的微小RNA进行了谱型分析。
引言
microRNA 属于小分子非编码 RNA 家族，长度约为 21-23 个核苷酸，可在转录后水平调控基因表达。microRNA 可被分泌到细胞外空间，在其中表现出相对稳定性。尽管检测 miRNA 表达水平的变化对于生物标志物的鉴定具有重要意义，但进行 miRNA 表达谱分析并处理大量数据可能具有挑战性。
本文介绍了一种利用高灵敏度实时PCR检测脑脊液（亦适用于其他体液）中miRNA表达变化的实验方案。同时，我们还描述了数据分析软件的使用方法，包括统计分析和结果的图形化展示。整个流程相对简单直接，所需时间相对较短，具体时长取决于待分析样本的数量以及可用的实时PCR仪数量。实验部分要求对RNA操作和向384孔板加样时具备较高的精确性，而使用GenEx软件进行数据分析则需要具备一定的生物信息学和统计学基础知识。
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方案
以下方案描述了从脑脊液（CSF）中分离RNA并使用预装PCR板进行microRNA分析的标准操作流程。需要注意的是，有机相抽提步骤为可选步骤，在提取过程中向样品添加了载体RNA，以确保RNA的最大回收率。因此，无需对RNA进行定量。
总体而言，如果在前一天完成 cDNA 的合成（约 2 小时），则平均每天可运行 6 至 8 块板。数据分析需在所有样本完成检测并载入软件后进行。根据样本数量/组别或用于比较的组合情况，数据分析可能需要一至数小时。
1. RNA 提取
RNA 提取自脑脊液（CSF）样本，样本以等分试样形式储存于 -80 °C 冰箱中直至分析。本实验采用 mirVana Paris 核酸分离试剂盒，按照制造商提供的总 RNA 分离说明书进行操作。请注意，尽管该试剂盒可实现小 RNA 物种的富集，但本实验未进行此步骤，总 RNA 分离完成后即结束 RNA 提取流程。此外，尽管 mirVana Paris 核酸分离试剂盒（与其他市售 RNA 分离试剂盒类似）无需有机提取步骤，但下文仍提供该操作的实验方案。
RNA 提取方案包括两个步骤：
1.1. 有机提取（使用 mirVana Paris RNA 提取试剂盒时无需此步骤）
1.2.2. 总 RNA 分离
1.1. 有机提取
1.1.1. 准备试剂
- 向2倍变性液中加入375 μl的2-巯基乙醇，并在4 °C下保存。
1.1.2. 准备脑脊液
- 在进行RNA提取前，将每份脑脊液（CSF）样品置于冰上解冻。向0.5 ml解冻后的CSF中加入1 µg MS2 RNA载体，并轻轻混匀。注意：如果省略有机相提取步骤，则MS2载体将在下文1.2.2.1所述RNA分离前直接加入样品中。
- 将0.5 ml室温的2倍变性液加入CSF中，混匀。
- 向CSF与2倍变性液的混合物中加入1 ml酸性酚:氯仿：务必吸取含有酸性酚:氯仿的下层相，而不是位于混合物上层的水相缓冲液。此外，请注意酸性酚:氯仿含有苯酚，具有毒性和刺激性，操作该试剂时应佩戴手套及其他个人防护装备。
- 涡旋振荡30–60秒以充分混匀。为操作方便，可将2 ml的样品/变性液/酸性酚:氯仿混合物分装至两个1.5 ml离心管中。
- 室温下以最大速度（10,000 × g）离心5分钟。
- 小心移取水相（上层），避免扰动下层有机相或中间相，并将其转移至新的离心管中。记录所回收的液体体积。
1.2. RNA 提取
建议使用专用的实验台、移液器和试管架来处理RNA样品。每次实验前，需使用RNase Zap喷雾和擦拭纸对工作区域和工具进行去污染处理。
1.2.1. 准备试剂：
- 向miRNA Wash Solution 1中加入21 ml的100%乙醇，向Wash Solution 2/3中加入40 ml的100%乙醇。请注意，miRNA Wash Solution 1含有硫氰酸胍，该物质可能具有危害性。
1.2.2. 总RNA提取
- 向有机萃取后的水相中加入1.25倍体积的室温100%乙醇，并充分混匀。
- 将过滤柱放入一个收集管中。
- 用移液器将不超过700 μl的裂解液/乙醇混合物加至过滤柱上。
- 以最大转速离心30秒。若混合物体积超过700 μl，需分多次依次加入同一过滤柱。每次离心后弃去穿滤液，并保留收集管用于后续洗涤步骤。
- 向过滤柱中加入700 μl miRNA洗涤液1，以最大转速离心15秒。弃去收集管中的穿滤液，将过滤柱放回同一收集管中。
- 加入500 μl洗涤液2/3，以最大转速离心15秒。弃去穿滤液，将过滤柱放回同一收集管中。再次加入500 μl洗涤液2/3，以最大转速离心15秒。弃去穿滤液，将过滤柱放回同一收集管中。将整个装置以最大转速离心1分钟，以去除滤膜中残留液体。
- 将过滤柱转移至新的收集管中。在滤膜中央加入100 μl预热至95 °C的无核酸酶水，盖紧管盖。以最大转速离心30秒，以回收RNA。
- 收集含有RNA的洗脱液，并于-80 °C保存以用于后续实验。
- 使用NanoDrop 2000c分光光度计对1 µl RNA进行定量。如果在RNA提取过程中向样品中添加了RNA载体，则可省略RNA定量步骤。在此情况下，直接取8 µl RNA进行后续所述的cDNA合成。
2. miRNA 表达谱：qRT-PCR 实验方案
miRNA 表达谱分析的实验方案包括两个步骤：
- 第一链 cDNA 合成
- 实时 PCR 扩增
2.1. 第一链 cDNA 合成
2.1.1. 稀释模板 RNA
- 使用无核酸酶水将每种模板RNA样本调整至5 ng/µl的浓度。如果RNA尚未定量（参见步骤1.2.2.9），则使用8 µl RNA进行cDNA合成
2.1.2. 准备试剂
- 轻轻解冻5×反应缓冲液和无核酸酶水，并立即置于冰上。
- 通过涡旋混合。向RNA外参管中加入40 µl无核酸酶水，涡旋混匀以重悬RNA外参；置于冰上15–20分钟。使用前立即从冷冻箱中取出酶混合液，轻轻弹动管子混匀后置于冰上。将所有试剂短暂离心。
2.1.3. 逆转录反应体系的建立
- 在1.5 ml Eppendorf管或同等容器中，按所需量配制逆转录（RT）工作液（配制比例见表1，RNA模板除外），涡旋混匀（最大速度下1-2秒），短暂离心（我们使用固定转速的迷你Eppendorf离心机，离心10秒），然后置于冰上。请注意，UniSp6 RNA内参标准品需在逆转录反应前加入样品中（见表1）。
- 将RT工作液分装至无核酸酶的PCR管中。
- 向每根PCR管中加入模板RNA。
注意：请记得为每种试剂额外计算10%的过量体积，以补偿移液或机器人操作中的死体积。试剂 Panel I 体积 (µl) Panel I + II 体积 (µl) 5x 反应缓冲液 4.4 8.8 无核酸酶水 9.9 19.8 酶混合液 2.2 4.4 UniSp6 RNA 内参标准品模板 1.1 2.2 模板总RNA (5 ng/µl) 4.4 8.8 总体积 22 44
表1. 逆转录反应体系配置。
2.1.4. 混合并离心试剂
- 轻轻涡旋混合反应液（1-2 秒），确保所有试剂充分混匀。混匀后，离心沉降（使用微型 Eppendorf 离心机，固定转速，10 秒）。
2.1.5. 孵育并热灭活
- 按下述设置PCR仪程序：
- 在42 °C下孵育60分钟
- 在95 °C下加热5分钟以灭活逆转录酶
- 立即冷却至4 °C
- 在4 °C下保存或冷冻
注意：本步骤可暂停。未稀释的cDNA可在-20 °C下保存长达5周（也可选择在4 °C下保存最多4天）。
2.2. 实时 PCR 扩增
2.2.1. 准备实时荧光定量 PCR 的试剂
- 将cDNA（来自步骤2.1.5）置于冰上。
- 将无核酸酶水和PCR预混液在冰上解冻。用铝箔包裹PCR预混液管，避免光照。使用前立即在微型离心机中涡旋震荡1-2秒混匀PCR预混液，并于1,500 × g离心1分钟。
2.2.2. 混合 SYBR Green 预混液、水和 cDNA，并加入 PCR 板中
建议采用以下步骤，以避免低浓度cDNA黏附于离心管表面：
- 在移除封板膜之前，将板子在预冷的离心机中以1,500 × g离心1分钟。
- 在15 ml锥形管中，混合2× PCR预混液与水。Panel I：2,000 µl 2×预混液和1,980 µl水；Panel I+II：4,000 µl 2×预混液和3,960 µl水。
- 加入20 µl cDNA（Panel I）或40 µl cDNA（Panel I+II），混匀。
- 轻轻涡旋震荡1–2秒以混匀，并在预冷的离心机中以1,500 × g离心1分钟。
- 将PCR预混液/cDNA混合液置于多通道移液器储液槽中。需选择与多通道移液器长度匹配的储液槽，以保持液面足够高，确保在整个多通道移液过程中各通道分装体积一致。这对最后几个分装步骤尤为关键。
- 使用16通道移液器，将10 µl PCR预混液/cDNA混合液分配至384孔板的每个孔中。
- 使用光学封膜密封板子。
- 将板子在预冷的离心机中短暂离心（1,500 × g，1分钟），以混匀溶液并去除气泡。
注意：实验可在此处暂停。将反应体系避光保存于4 °C，最长可保存24小时。
2.2.3. 实时荧光定量 PCR
按照表2中详述的参数进行实时PCR扩增和熔解曲线分析。
| 步骤 | 设置，Roche LC480 |
| 聚合酶激活/变性 | 95 °C，10 分钟 |
| 扩增 | 45 个扩增循环，包括 95 °C，10 秒 60 °C，1 分钟 升温速率 1.6 °C/秒 光学读取 |
| 熔解曲线分析 | 是 |
表2. 使用Roche LightCycler 480进行实时PCR的循环条件。
2.3. 实时荧光定量 PCR 数据分析
实时荧光定量PCR数据分析采用Exiqon GenEx Professional 5.0软件，按照推荐的操作说明进行。GenEx分步操作手册可从以下网址下载：http://www.exiqon.com/ls/Documents/Scientific/Exiqon-data-analysis-guide.pdf
数据分析包括以下三个步骤：
- 数据导入
- 数据预处理
- 统计分析
2.3.1. 数据导入
- 在 Roche LightCycler 480 中选择 2nd 采用衍生分析法并计算Cq值。数据以表格形式导出，并保存为文本文件。
- 导入数据时，打开 GenEx，点击 Exiqon 导入向导按钮，然后点击“开始”。按照提示选择格式、仪器和板型布局文件。请注意，板型布局文件（Excel 文件）需从 Exiqon 网站下载http://www.exiqon.com/plate-layout-files).
- 导入面板 I 和 II，然后点击“下一步”。
- 文件导入后生成的表格包含预定义的列。在此步骤中，可编辑样本名称，并可添加或删除分类列。完成后点击“下一步”。
- 保存数据并加载到数据编辑器。
2.3.2. 数据预处理
- 根据 Exiqon 和 GenEx 的建议，在比较多个孔板时，首先应通过预处理菜单选择板间校准，对各孔板之间的数据进行校准。
- 建议进行三次重复的miRNA芯片实验。如果某miRNA在三次重复中至少两次未检出，则判定为不表达。
- 在预处理的下一步中，设定一个截断值。定义截断值表示将阈值循环（Ct）高于此值的样本将被舍弃。在本实验中，使用脑脊液标本时，阈值设定为39。因此，所有Ct 三个重复中高于39的将被舍弃。如果一个miRNA具有Ct > 39，对于一个探针（三个重复中的一个），该读数将被该探针三个重复的C值平均值所替代t 对于另外两个探针，只要它们的值均低于39。
- 定义参考基因。GenEx Professional 软件可选择使用 geNorm 和/或 NormFinder 来鉴定参考基因。选择一组在所有样本中具有相似 Cq 值的 miRNA，并运行 geNorm 和/或 NormFinder。根据本分析，在此处提供的示例中，miR-622 和 miR-1266 在各样本间的表达最为稳定，因此被选为参考基因图1).
- 接下来，使用参考基因对数据进行归一化处理，所得数值对应于 ΔCt
- 若cDNA合成反应设置了三份重复，则此时应将数值取平均值。
- 验证工作表以删除空白和几乎空白的列。在预处理窗口中选择“验证工作表”，然后在“删除空白列”行上应用。在下一行中，选择所需的有效数据百分比，然后点击应用。例如，若希望仅比较在所有样本中均存在的miRNA，则选择100%。
- 处理缺失数据。
从预处理菜单中选择“缺失数据”，并选择一种处理缺失数据的选项。此步骤为必需。请注意，如果尝试加载包含未处理缺失数据的文件，GenEx 将报错。 - 确定样本组间的相对定量即实验组与对照组）。各组间的相对定量通过 ΔΔCt 方法。在 GenEx 中，点击预处理选项卡并选择相对定量。在窗口中选择参考组，然后点击应用。请注意，为了图形化展示和/或进一步的统计分析，表达数据应转换为对数尺度。在预处理菜单中，选择 Log2。
2.3.3. 统计学分析
GenEx 软件支持多种统计分析方法，包括 T 检验和方差分析（ANOVA）。
- 将最终的 mdf 文件载入 GenEx 并打开数据管理器。必须为统计分析正确选择相应的样本或样本组。
- 选择“统计”功能，并点击对应所需检验方法的图标。
- 在控制面板窗口中点击“运行”。将结果保存为 excel 或 mdf 文件。
2.3.4. 表达谱分析
microRNA 和样本可通过热图和树状图进行分类、聚类和可视化，如下所示
- 将最终的 mdf 文件载入 GenEx 并打开数据管理器。使用此窗口选择并创建样本或 miRNA 的分组。完成后点击“Apply”。
- 在左上角选择 cluster，然后点击热图图标
- 在控制面板窗口中点击“Run”。热图可保存为多种格式，如 tiff 或 bmp；也可根据需要进行复制和修改。
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结果
本研究的结果此前已发表1。图1展示了使用geNorm软件对候选参考微小RNA（microRNA）进行分析的结果。据此，筛选出两个微小RNA，即miR-622和miR-1266，作为参考基因，用于标准化微小RNA的表达值。
对于脑脊液研究，我们设置了三组样本：HIV-（n=10），HIVE（n=4），以及无脑炎的HIV感染者（HIV+， n=5）。HIVE组与HIV+组分别与对照组HIV-组进行比较。经统计分析（2.3.3节），发现11种microRNA的表达水平差异具有统计学意义。1. 图2 表示这11个microRNA（miR-1203、-1224-3p、-182*、-19b-2*、-204、-362-5p、-484、-720、-744*、-934 和 -937）的箱线图。每列显示各组样本中数据的分布情况（绿色代表HIVE组，红色代表无脑炎的HIV+组）。须线表示中位数、1st (Q1) 和 3...
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讨论
microRNA是一类小分子非编码RNA，通过抑制翻译和/或促进mRNA降解来调控基因表达2。由于在无细胞环境中具有高度稳定性，microRNA已在多种体液中被检测到。此外，microRNA的特异性表达谱与多种人类癌症的发生阶段和/或进展密切相关3-9。
目前有多种可用于微小RNA（microRNA）分析的工具，包括经典的芯片阵列或最新的深度测序技术。然而，我们选择采用一种高灵敏度的qPCR平台10,11，其额外优势在于所需RNA量极少。miRCURY LNA Universal RT microRNA PCR方案经过优化，每20 µl cDNA合成反应仅需20 ng总RNA，完整双板阵列则需40 ng。在处理脑脊液（CSF）或福尔马林固定石蜡包埋组织等珍贵且难以获取的临床样本时，能够使用少量RNA显得尤为重要1。重要的是，使用低量RNA可最大限度降低样本中潜在抑制物的浓度。内参（spike-in）出现超出范围的Ct值，很可能表明样本中存在某些抑制物。...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本项目由美国国家心理健康研究所资助，资助编号为 R01MH079751（项目负责人：F. Peruzzi）。本内容仅由作者负责，不一定代表美国国家心理健康研究所或美国国立卫生研究院的官方观点。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
表3. 设备清单 | |||
| Finnpipette Novus 多通道移液器 | 赛默飞世尔科技 | HH05279 | |
| 芬尼特移液器吸头 | 赛默飞世尔科技 | 9400613 | |
| Thermal Cycler C1000 | 伯乐（Biorad） | ||
| 0.2 ml 低矮透明 PCR 管 | 伯乐（Biorad） | TLS0801 | |
| 平盖条 | 伯乐（Biorad） | TLS0803 | |
LightCycler 480 实时荧光定量 PCR 系统 | 罗氏 | ||
LightCycler 480 密封膜 | 罗氏 | 04 729 757 001 | |
| 冷藏离心机 5804R | Eppendorf | ||
| 摆动转头转子，4 位 | Eppendorf | A-4-44 | |
| 台式迷你离心机 | Fisher | 05-090-100 | |
| 台式涡旋混合器 | Fisher | ||
| 1.5 ml 微型离心管，已灭菌 | Fisher | 02-681-5 | |
| 25 ml 矩阵试剂储液槽 | 赛默飞世尔科技 | 8093 | |
| Thermomixer Confort | Eppendorf | ||
台式小型离心机 Sigma 1-15 | Sigma | ||
| 台式涡旋混合器 | Velp Scientifica | F202A0173 | |
表4. 试剂列表 | |||
| 通用 cDNA 合成试剂盒，16-32 次反应 | Exiqon | 203300 | |
| SYBR Green预混液，通用反转录酶，25 ml | Exiqon | 203400 | |
| 超纯去离子水，无DNase、无RNase | Invitrogen | 10977-015 | |
| microRNA 即用型 PCR 人类芯片（I+II）V2.R | Exiqon | 203608 | |
mirVana miRNA 提取试剂盒，可进行 40 次提取 | Ambion | AM1556 | |
| MS2 RNA 载体 | 罗氏应用科学 | 10165948001 | |
2-巯基乙醇 98% | Sigma Aldrich | M3148-25ml | |
| 乙醇 100% | Carlo Erba | 64-17-5 | |
| 无核酸酶水 | Qiagen | 1039480 | |
RNA酶清除剂 | Ambion | AM9780 |
参考文献
- Pacifici, M., et al. Cerebrospinal fluid miRNA profile in HIV-encephalitis. J. Cell. Physiol. 10, (2012).
- Krol, J., Loedige, I., Filipowicz, W. The widespread regulation of microRNA biogenesis, function and decay. Nat. Rev. Genet.. 11, 597-610 (2010).
- Calin, G. A., Croce, C. M. MicroRNA signatures in human cancers. Nat. Rev. Cancer. 6, 857-866 (2006).
- Chen, X., et al. Characterization of microRNAs in serum: a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases. Cell Res. 18, 997-1006 (2008).
- De Smaele, E., Ferretti, E., Gulino, A. MicroRNAs as biomarkers for CNS cancer and other disorders. Brain Res. 1338, 100-111 (2010).
- Heneghan, H. M., Miller, N., Kerin, M. J. MiRNAs as biomarkers and therapeutic targets in cancer. Curr. Opin. Pharmacol. 10, 543-550 (2010).
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- Blondal, T., et al. Assessing sample and miRNA profile quality in serum and plasma or other biofluids. Methods. 59, 1-6 (2013).
- Jensen, S. G., et al. Evaluation of two commercial global miRNA expression profiling platforms for detection of less abundant miRNAs. BMC Genomics. 12, 435 (2011).
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