脑脊液的microRNA分析采用实时定量PCR技术

摘要

我们描述了实时PCR的协议来分析小分子RNA在脑脊液（CSF）。除的RNA提取的协议，该过程可以扩展到从其它体液，细胞培养，或组织标本中提取的RNA。

摘要

微RNA（miRNA）构成由指导RISC到目标位于mRNA的位点，因此，通过调节它们的翻译抑制基因调控的一种有效层。改变的miRNA表达已被证明参与所有主要复杂疾病的发展。此外，最近的研究结果表明，miRNA能够被分泌到细胞外环境，并进入血液和其他体液中，他们可以以高稳定性循环。这种循环miRNA的功能在很大程度上仍然是难以捉摸的，但系统的高通量方法，如miRNA表达谱阵列，已经导致miRNA的签名鉴定的几个病理条件下，包括神经退行性疾病和多种类型的癌症。在此背景下，miRNA的表达谱在脑脊液鉴定，据报道在我们最近的研究，使得miRNA的有吸引力的候选生物标志物分析。 _content">有可用于分析小分子RNA，如微阵列几个工具，定量实时PCR（定量PCR），以及深度测序。在这里，我们描述一个敏感的方法，通过实时定量PCR技术来分析在脑脊髓液的microRNA。我们用Exiqon的microRNA准备使用的PCR人类面板I和II V2.R，它允许检测742独特的人类微小RNA，我们进行的阵列，一式三份运行，我们使用GENEX专业5软件进行处理和分析数据。

使用该协议，我们已经成功地描出的microRNA在各种类型的细胞系和原代细胞，脑脊髓液，血浆和福尔马林固定，石蜡包埋的组织。

引言

小分子RNA属于小型的家庭（21-23核苷酸长）非编码调控基因表达转录后的RNA。微小RNA可分泌在它们似乎是相对稳定的细胞外空间。在确定改变miRNA的表达可以向鉴定生物标志物的一个重要步骤，进行miRNA表达谱和处理大量数据的可吓人。

在这里，我们描述了一种协议，以确定在脑脊液（适用于其他体液）由一个敏感的实时PCR的变化的miRNA表达。我们还描述了使用软件进行数据分析，包括统计分析和结果的图形表示。整个过程是比较容易和简单，并根据样本进行概要分析和实时PCR机器的数量可用，也比较快的数目。实验部分要求精度处理RNA和移液到384孔板，同时采用GENEX数据分析部分要求在信息学和统计学的一些基本知识。

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方案

以下协议描述了标准程序，从使用现成PCR板CSF和轮廓的microRNA分离RNA。需要注意的是，有机相萃取是可选的，并且该提取的RNA以确保最大的恢复过程中的载体RNA被加入到样品中。因此，没有必要进行量化的RNA。

总体而言，平均为6-8板可以在一天之内运行，如果该cDNA之前（约2小时）的天合成。当所有的样品已经成型并加载到软件进行数据分析。取决于样品/组或它们的组合的用于比较的数量，数据分析可能需要从一个到几个小时。

1。 RNA提取

的RNA提取从脑脊液样品上进行，冷冻储存在-80℃下以等分试样直至分析。用于此过程的mirVana巴黎分离试剂盒被使用时，按照制造商的仪器ctions总RNA分离。请注意，虽然富集小RNA种类可以使用该试剂盒，该步骤不进行和RNA的提取步骤的总RNA分离步骤之后结束。此外，虽然mirVana巴黎分离试剂盒（像其他市售的RNA提取试剂盒）不需要有机萃取，协议对本程序可以在下面找到。
的协议，用于RNA提取由两个步骤组成:
1.1。有机萃取（如果没有使用mirVana巴黎RNA提取试剂盒必填）
1.2.2。总RNA的提取

1.1。有机萃取

1.1.1。制备试剂

1. 添加375微升....

结果

从本研究结果先前已公布的^1。 图1显示了使用geNorm应用候选参考microRNA的分析结果。因此，2微小RNA中，miR-622和miR-1266，被确定为参考基因和被用于归一化的miRNA值。

对于脑脊液研究中，我们有三组样品的HIV-（N = 10），HIVE（N = 4）和HIV（+）无脑炎（HIV（+）中，n = 5）。这两个群体，HIVE和HIV阳性，与对照病毒组进行了比较。经统计分析（第2.3.3节）的11微RNA的表达水平，发现统计学显著^1， 图2表示这11 microRNA的箱线图中，miR-1203-1224-3P，-182 *，-19B-2 *， -204，-362-5P，-484，-720，-744 *，-934，-937和。每列显示数据在样本不ENCE分配组（绿色为HIVE和红色内为HIV +phalitis）。晶须表示位数，第¹次（Q1）和^第三 .......

讨论

microRNA是小非编码RNA，通过抑制翻译和/或促进mRNA降解²调节基因表达。由于其高稳定性在无细胞的条件下，微小RNA已在许多体液检测。此外，microRNA的独特表达谱已与相关阶段和/或进展中的各种人类癌症^3-9。

有可用来分析小分子RNA的几种工具，其中包括经典的芯片阵列或最新的深度测序技术。然而，我们选择利用一个高度敏感的qPCR平台^10，11，其具有需要的RNA的最小量的附加 ​​的优点。该miRCURY LNA通用RT microRNA的PCR方法进行了优化，使用20 ng总RNA每20微升cDNA合成反应，40纳克为全双面板阵列。有使用少量的RNA的选项时使用valuabl处理是非常重要的 e和难以取得临床标本如脑脊液或福尔马林固定石蜡包埋组织^1。重要的是，利用少量的RNA减少的样品中存在的可能的抑制剂的浓度。超出范围的Ct值的尖峰在将可能指示某些抑制剂的样品中存在。秒杀式探头可以单独购买，测试样品的前miRNA表达谱抑制剂的存在。对于本试验中，单实时PCR所使.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
表 3.设备列表.
Finnpipette Novus 多通道移液器	Thermo Scientific	HH05279
Finntip 移液器吸头	Thermo Scientific	9400613
热循环仪 C1000	Biorad
0.2 ml 低矮型， 透明 PCR 管	Biorad	TLS0801
平盖条	BioRad	TLS0803
LightCycler 480 实时荧光定量 PCR 系统	Roche
LightCycler 480 密封膜	Roche	04 729 757 001
冷冻离心机 5804R	Eppendorf
水平转子， 4 孔	Eppendorf	A-4-44
台式微型离心机	Fisher	05-090-100
台式涡旋离心机	Fisher
1.5 ml 微量离心管，灭菌	Fisher	02-681-5
基质试剂储液槽，25 ml	Thermo Scientific	8093
Thermomixer Confort	Eppendorf
台式微型离心机 Sigma 1-15	Sigma
台式涡旋	Velp Scientifica	F202A0173
表 4.试剂列表.
Universal c-DNA 合成试剂盒，16-32 次反应	Exiqon	203300
SYBR Green 预混液，通用 RT，25 ml	Exiqon	203400
超纯蒸馏水 dnase， 无 RNA酶	Invitrogen	10977-015
MicroRNA 即用型 PCR 人体检测组合 （I+II） V2.R	Exiqon	203608
mirVana miRNA 分离试剂盒，40 次分离	Ambion	AM1556
MS2 RNA 载体	罗氏应用科学	10165948001
2-巯基乙醇 98%	Sigma Aldrich	M3148-25ml
乙醇 100%	Carlo Erba	64-17-5
无核酸酶水 核酸酶	Qiagen	1039480
RNAse Zap	Ambion	<便>AM9780