利用生物发光细菌实时观察肺炎链球菌毒力因子在急性小鼠肺炎模型中的影响

摘要

Streptococcus pneumoniae 是导致重症社区获得性肺炎的主要病原体，全球每年因此死亡人数超过2 00万。通过使用生物发光细菌，在急性小鼠肺炎或菌血症模型中可实时监测与细菌适应性或毒力相关的细菌因子的作用。

摘要

肺炎是发展中国家和发达国家的主要医疗保健问题之一，与较高的发病率和死亡率密切相关。尽管对该疾病的认识不断深入，重症监护病房（ICU）日益普及，强效抗菌药物和有效疫苗也已广泛应用，但其死亡率仍然居高不下¹. 肺炎链球菌 是社区获得性肺炎（CAP）的主要病原体，也是人类菌血症最常见的病因之一。该病原体表面表达多种黏附素和毒力因子，参与肺炎及侵袭性肺炎链球菌疾病（IPD）的发生。对这些 体内 细菌适应性或毒力因子的作用对于揭示其机制至关重要 S. pneumoniae 致病机制。目前正利用小鼠肺炎、菌血症和脑膜炎模型，研究肺炎链球菌在感染不同阶段中各因素的影响。本文描述了一种通过成像系统及配套分析软件，实时监测经鼻内或腹腔接种发光细菌后，肺炎链球菌在小鼠体内播散的实验方案。结果显示，可直观观察并评估肺炎链球菌在下呼吸道和血液中的增殖与播散过程。

引言

由病毒或细菌引起的呼吸道感染仍是全球最常见的社区获得性或临床问题之一，导致全球约三分之一的死亡。主要的细菌种类包括 流感嗜血杆菌 和 肺炎链球菌². 然而，这些细菌种类通常是呼吸道正常菌群的常见组成部分。因此，细菌定植对个体也存在一定的侵袭性疾病风险，具体风险取决于个体的免疫状态或易感因素。无症状定植可进而发展为侵袭性感染。 肺炎链球菌 是社区获得性肺炎（CAP）的主要病原体，也是人类菌血症最常见的病因之一。在健康个体中 S. pneumoniae （肺炎球菌）通常是上呼吸道无症状且无害的定植菌，在此环境中它们不仅会遇到正常菌群中的非致病性细菌，还会遇到诸如 嗜血杆菌属 spp或 金黄色葡萄球菌 以及人类免疫防御系统的第一道防线。携带率在幼儿中最高（37%），在拥挤的托儿所中甚至更高（58%）^3-5最年轻的人群和老年人通过气溶胶传播从携带者及鼻咽分泌物中感染肺炎链球菌⁶属于高风险人群，在美国和许多欧洲国家建议接种一种肺炎球菌结合疫苗（儿童接种PCV10或PCV13，成人接种23价多糖疫苗PPSV23）⁴PPSV23 覆盖了在美国和欧洲引起约 90% 菌血症型肺炎链球菌疾病的主要血清型，因此可有效预防成人侵袭性肺炎链球菌病（IPD）；而结合型肺炎链球菌疫苗（PCV）则覆盖儿童中最常见的血清型。因此，疫苗型（VT）导致的 ....

方案

此处所述的动物感染实验必须严格遵守当地和国际（例如 欧洲实验动物科学联合会（FELASA）关于脊椎动物使用指南与法规。所有实验须经当地伦理委员会及机构动物护理委员会批准。涉及脊椎动物的所有实验 S. pneumoniae 在实验室中，动物感染操作应在II级生物安全柜中进行。

1. 发光肺炎链球菌感染性菌种的制备

1. 在Todd-Hewitt肉汤中制备肺炎链球菌的储备培养物，肉汤中添加1% (w/v) 酵母提取物，并含有终浓度为20%的甘油，用于在-80 °C下保存。
2. 将少量深冻保存的肺炎链球菌储备培养物划线接种至血琼脂平板，于37 °C、5% CO₂条件下培养细菌10小时。血琼脂平板中应含有适当的抗生素（如卡那霉素，150 µg/ml），以维持luxABCDE基因盒转座插入基因组后的筛选。
3. 将新鲜菌落转接至新的血琼脂平板，继续培养不超过10小时。
4. 用肺炎链球菌接种THY培养基，该培养基添加10% (v/v) 经热灭活（56 °C下30分钟）的胎牛血清（FBS），初始培养的OD₆₀₀调至0.05–0.07。
5. 将肺炎链球菌在37 °C、5% CO₂条件下静置培养，直至培养物OD₆₀₀达到0.35–0.40，此过程通常需要3–4小时。
....

结果

甲硫氨酸的获取和摄取对肺炎链球菌在其宿主生态位中维持适应性至关重要^32,33。甲硫氨酸ABC转运系统中的脂蛋白由D39菌株中的spd_0151基因（TIGR4： sp_0149）编码，命名为MetQ³²。肺炎链球菌还可产生甲硫氨酸生物合成酶（D39：Spd_0510 – Spd_0511；TIGR4：Sp_0585 – Sp_0586，MetE和MetF）。在化学成分明确的培养基中缺乏甲硫氨酸会影响肺炎链球菌的生长，类似地，缺乏甲硫氨酸结合脂蛋白MetQ也会损害甲硫氨酸的摄取^32,33。该缺陷可通过添加高浓度甲硫氨酸得以恢复。在小鼠定植实验中，MetQ缺陷型突变株在与同基因野生型菌株共感染实验中未表现出毒力减弱；然而，在败血症和肺炎小鼠模型中，缺乏MetQ会导致肺炎链球菌毒力减弱，这一点通过细菌载量的测定得以证实³²。本研究中使用的IVIS Spectrum实时光学生物成像技术，可对单个感染动物在不同时间点的细菌增殖和播散过程进行连续监测。

.......

讨论

所有涉及动物的实验均须获得当地主管部门和伦理委员会的批准。在体内感染实验中，需在感染后的不同时间点测定动物各宿主生态位中的细菌载量。在此类实验条件下，必须在从血液、鼻咽部、支气管肺泡灌洗液或肺、脾、脑等器官中分离细菌之前，将动物处死。为计算每个宿主生态位中的细菌数量，并评估细菌因子对毒力的影响，需分离血液或器官组织，随后进行细菌回收并在固体培养基上接种。细菌载量通过菌落形成单位（CFU）计数进行定量。为获得具有统计学意义的数据，每个时间点均需使用一组小鼠，而在某些实验条件下，由于小鼠数量较多，可能导致实验操作困难。

相比之下，实时生物成像方法耗时较少，可对每只细菌感染的小鼠在一段时间内进行多次监测。该成像技术能够在感染后的不同时间点，甚至在较长时间内，实现对动物体内细菌的可视化观察 时间周期。此外，生物发光 使用光学图像分析软件进行测量可进一步实现量化 由感染动物发射的光子。可限定为小鼠的特定区域，也可考虑整个动物。 在 体内 感染实验中，需以8-12小时为间隔对肺炎链球菌感染小鼠进行监测，因为肺炎链球菌在.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Todd Hewitt 肉汤	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	X936.1
酵母提取物	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	2363.2
血琼脂平板	Oxoid, Wesel, Germany	PB5039A
卡那霉素	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	T832.2
红霉素	Sigma-Aldrich,Taufkirchen, Germany	E6376
胎牛血清（FBS）	PAA Laboratories, Coelbe, Germany	A11-151
CD-1 小鼠，雌性	Charles River, Sulzfeld, Germany	CD1SIFE06W08W	6至8周龄雌性CD-1小鼠
克他命 500 mg，Curamed 注射液	Schwabe-Curamed, Karlsruhe, Germany
隆朋 2%，注射液	Bayer Animal Health, Monheim, Germany
BD Plastipak 1 ml 注射器	Becton Dickinson, Heidelberg, Germany	300015	带针头的无菌鲁尔锁式注射器
Gel Loader 吸头	PeqLab	81-13790	MµltiFlex 吸头
透明质酸酶	Sigma-Aldrich	H3884-100mg	来源于牛睾丸的IV-S型透明质酸酶
氧气	Air Liquide, Düsseldorf, Germany	M1001L50R2A001
异氟烷	Baxter, Unterschleißheim, Germany
pGEM-T Easy	Promega, Mannheim, Germany
寡核苷酸	Eurofins MWG, Ebersberg, Germany
Qiaprep Spin Midiprep 试剂盒	Qiagen, Hilden, Germany	27104
PCR DNA 纯化试剂盒	Qiagen, Hilden, Germany	28106
Living Image 4.1 软件	Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Germany
XGI-8 气体麻醉系统	Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Germany
IVIS Spectrum 成像系统	Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Germany
Biophotometer	Eppendorf AG, Hamburg, Germany