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方法文章

小鼠痕迹性恐惧条件反射实验

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DOI：

10.3791/51180

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2014年3月20日

 ,  , 
1Department of Psychology and Neuroscience, Baylor University, 2Institute of Biomedical Studies, Baylor University

本文内容

摘要

在以下实验中，我们描述了一种小鼠痕迹性恐惧条件反射的实验方案。这种类型的联想记忆包含一个将中性刺激与非条件刺激分隔开的痕迹间隔期。

摘要

在本实验中，我们介绍一种用于测量学习与记忆的技术。此处展示的痕迹恐惧 conditioning 方案中，中性刺激与非条件刺激之间共进行五次配对。每次 conditioning 试验之间设有 20 秒的痕迹间隔。在次日，测量条件刺激（CS）呈现及痕迹间隔期间小鼠的僵立反应。第三天进行持续 8 分钟的测试，以评估情境记忆。代表性结果来自接受厌恶性非条件刺激（电击）的小鼠，与仅接受声音刺激但未接受非条件刺激的小鼠进行比较。痕迹恐惧 conditioning 已被成功用于检测其他恐惧 conditioning 方法无法发现的小鼠细微学习与记忆缺陷及增强现象。此类恐惧 conditioning 被认为依赖于内侧前额叶皮层与海马之间的神经连接。目前存在一个争议：该方法是否独立于杏仁核。因此，需要采用其他恐惧 conditioning 测试来考察依赖于杏仁核的学习与记忆效应，例如通过延迟恐惧 conditioning 方法。

引言

在恐惧条件反射中，一个中性刺激（NS）与一个厌恶的非条件刺激（US）配对。该中性刺激通常为一种音调，通过与非条件刺激反复配对后，转变为条件刺激（CS）。随后，条件刺激可在没有厌恶的非条件刺激出现的情况下，引发条件反应（CR），例如僵直反应。一种常用的恐惧条件反射方案是延迟条件反射。在此方案中，中性刺激与非条件刺激的起始时间是连续的，或在刺激呈现上存在部分重叠。尽管延迟恐惧条件反射是最常用的时序性联想条件反射类型之一，但还存在其他几种联想条件反射的时间安排方式：同时条件反射、逆向条件反射和痕迹条件反射1。在痕迹恐惧条件反射中，中性刺激与非条件刺激之间存在数秒的无刺激间隔，从而形成一段"痕迹"期。

多项研究报道，当对输入海马体的脑区造成神经毒性损伤时2-5，或使用药理学手段阻断海马体内受体功能时，痕迹性恐惧条件反射会出现缺陷。对海马体的损伤会导致痕迹性条件反射和情境性条件反射受损，但不会影响延迟性恐惧条件反射8。使用痕迹性恐惧条件反射具有多种优势：该恐惧条件反射实验可在为期三天的测试期内完成，且能够检测不依赖于空间认知的海马体依赖性记忆。在研究海马体依赖性记忆时，痕迹性恐惧条件反射可作为莫里斯水迷宫、新物体识别实验或其他迷宫类测试的补充检测方法。

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方案

以下实验所用小鼠在贝勒大学（Baylor University）培育并饲养，环境温度为 22 °C，光照周期为 14 小时光照和10 hr 暗期（20:00 至 6:00）昼夜循环。小鼠被给予 随意摄取 可自由获取食物和水。所有对小鼠的操作均符合美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》的要求，并经贝勒大学动物护理与使用委员会批准动物实验方案。

概述

痕迹条件化恐惧任务基于Wiltgen及其同事所描述的方法9。

1. 仪器设备的准备

恐惧条件反射装置的实验箱（26 cm × 22 cm × 18 cm）由两侧丙烯酸材质、两侧金属材质以及格栅式地板底部组成，格栅地板用于传递轻微足底电击。测试箱置于隔音箱内，且完全避光，以防止外界光线干扰运动检测软件的运行。

  1. 校准测试箱的电击强度、光照强度和声音强度水平。测量测试箱的背景水平。该箱内的背景噪音为 65 dB。使用声级计测量此数值。声级计应设置为 70 dB，加权方式设为 C，检测模式设为慢速响应。
    1. 将电击强度校准至 0.5 mA。使用外部校准装置准确校准电击强度（参见材料表）。电击发生器的内部测量值不准确。该电击发生器输出的是随机电击，无法通过标准电流表准确测量。
    2. 将一根导线接在其中一个栅格棒上，另一根导线接在相隔 3 至 4 根栅格棒的位置。使用电击发生器施加电击。调节电击强度直至达到正确水平。对每个恐惧条件化箱均执行此操作。
    3. 测量箱内光照强度时应关闭箱门。将光照强度校准至约 1.0。此数值是本实验所用 FreezeFrame 软件特有的单位，外部照度计测得该值对应为 2 lux。可通过调整室内灯位置或调节镜头聚光镜来调节光照强度。调节后务必拧紧镜头调节螺丝。
    4. 将声音分贝水平校准至 85 dB。使用测试笼内的外部分贝计校准分贝水平（参见材料表）。所呈现的声音为 2,700 Hz 的纯音。注意：若使用年龄超过 6 个月的小鼠，建议改用白噪声，因为年长小鼠可能存在听力缺陷。
  2. 设备准备就绪后，将实验动物转移至单独的暂养室。注意：切勿将小鼠饲养在与测试室同一房间内。
  3. 按照测试顺序标记待测小鼠的尾巴。测试前应尽量减少不必要的抓取操作。也可选择在实验前一天标记尾巴，以减少操作应激。标记完成后，让小鼠在测试房间内适应环境 30 分钟。准备额外的清洁笼具，用于测试结束后的小鼠饲养。

2. 痕迹条件反射 第1天

  1. 将每只小鼠从笼中取出，并分别放入单独的运输笼中，运送到恐惧条件反射实验箱。每个笼子使用干净的垫料。在转运笼上贴上粘性标签，以确保小鼠测试顺序正确。注意：如果小鼠原本是单只饲养的，则可直接使用其原居住笼进行运输。
  2. 将小鼠放入测试箱中并关闭门，启动软件程序。
  3. 在训练当天，让小鼠在箱内自由探索3分钟。随后软件向动物呈现一个持续20秒的音调（85 dB，2,700 Hz）。经过20秒的间隔期后，给予动物一次轻度电击（2秒，0.5 mA）。
  4. 通过回看视频记录受试动物的反应，以确认其已接收到厌恶刺激。每次试验之间设有200秒的间隔期，共进行5次条件化训练。每次试验均包括一个20秒的音调，随后是20秒的延迟，接着给予电击。
  5. 测试完成后，让动物在测试箱中再停留1分钟，然后再将其从测试笼中移出。
  6. 将动物放回转运笼，并送回其原居住笼。如果原笼中还有其他小鼠，则应将该小鼠单独饲养，直至所有小鼠完成测试，以减少对未测试小鼠的应激影响。另一种方案是在测试前一周即对所有小鼠进行单笼饲养，以降低因反复从同一笼中移出小鼠所带来的干扰。
  7. 每只动物测试结束后，使用30%异丙醇清洁测试箱。
  8. 对测试队列中的所有小鼠重复步骤2.2–2.7。
  9. 当队列中最后一只小鼠完成测试后，将所有小鼠送回动物饲养室。

3. 恐惧痕迹条件反射第2天：痕迹记忆测试

  1. 痕迹记忆测试将在第2天进行。本方案中包含3次纯音呈现。将小鼠放入一个新的环境中进行痕迹条件化测试。
  2. 准备软件程序，运行一个包含2分钟基线期的实验，随后进行3次20 秒的纯音刺激，每次纯音之间设有220 秒的刺激间间隔（ITI）。
  3. 对于新环境条件，在条件化箱的底部放置透明亚克力插板，以改变箱体的形状、质地和颜色。
  4. 通过在地板插板下方放置盛有香草精的小称量舟，改变箱内的气味。
  5. 使用70%乙醇而非30%异丙醇清洁箱体。注意：这有助于构建一个新颖的环境。
  6. 将小鼠转移至饲养室，并在必要时重新标记其尾部以便测试。
  7. 通过将转移笼内的垫料更换为碎纸，准备用于新环境转移的小鼠笼具。注意：这有助于构建一个新颖的环境。
  8. 将小鼠放入测试箱后启动程序。测试结束后，使用70%乙醇清洁箱体。
  9. 痕迹条件化测试完成后，将小鼠放回其原饲养笼。当所有小鼠测试结束后，将其全部送回动物饲养室。

4. 痕迹恐惧条件反射 第3天：情境记忆测试

  1. 在第三天进行情境条件化实验。准备软件以运行程序，记录8分钟的僵直行为。
  2. 在测试每只小鼠之前和之后，用30%异丙醇清洁实验箱。实验环境应与第一天保持一致。转移笼具应与第一天相同。
  3. 将小鼠带至饲养室，并标记其尾巴以便测试。
  4. 将每只小鼠放入测试箱后启动程序。测试完成后，用30%异丙醇清洁实验箱。
  5. 测试结束后，将所有小鼠送回饲养室。

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结果

在代表性结果中，我们展示了对照组C57BL/6J成年小鼠的数据，其中一组小鼠接受了中性刺激与非条件刺激（电击条件）的配对，另一组小鼠仅接受中性刺激而未接受非条件刺激（无电击条件）。在首次建立该行为学实验时，必须设置此对照条件，以确定实验方案是否正确执行。

图1中的数据代表了C57BL/6J小鼠在痕迹恐惧条件反射测试中的训练日表现。通常没有必要在训练日对所有条件下的各组进行比较。然而，检查基线期有助于评估基线水平是否存在初始差异。我们在基线条件中未观察到僵直水平的差异，t(1,10) = 0.6，p = 0.56。这表明僵直水平在初始阶段无显著差异。通常情况下，在早期学习试验中僵直水平较低，但在条件配对试验过程中僵直行为逐渐增加。当我们对16个时间段内“电击”与“无电击”条件之间的差异进行混合模型方差分析时，发现组间主效应显著，F(1,10) = 60.3，p < 0.001；同时存在显著的组别主效应 F(1,10) = 215.9，p < 0.001，以及组别与时间的交互效应 F(1,10) = 133.9，p < 0.001。该...

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讨论

已有若干研究阐明了痕量恐惧条件反射背后的神经回路。痕量恐惧条件反射被认为涉及海马体的 CA1 区域12-14。也有证据表明，内侧前额叶皮层（mPFC）在痕量眨眼条件反射中起重要作用15，并且研究发现 mPFC 也参与了痕量恐惧条件反射。一项研究发现，mPFC 神经元在痕量期间提供持续性活动，从而形成一种可在痕量间隔期间维持记忆的神经结构17。

通过研究内侧前额叶皮层（mPFC）的作用，可以考察形成联想记忆过程中分子事件的时间进程。Runyan 等16 发现，在 mPFC 中抑制细胞外信号调节激酶（ERK）会影响记忆的保持，但不影响记忆的编码。此外，前额叶皮层中磷酸化 ERK 的增加早于海马体中的变化。由于 ERK 被认为参与了长时程记忆的形成，mPFC 可能是长时程记忆保持中的一个关键脑区。其他研究可进一步探讨其他信号通路在长时程记忆中的作用，以及 mPFC 与海马体之间的相互作用。

痕迹性恐惧条件反射的另一个用...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由贝勒大学研究委员会资助项目以及癫痫基金会的研究资助支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
FreezeFrameCoulbourn
30% 异丙醇购买 90% 异丙醇并将其稀释至 30%
70% 乙醇
电流表Med-AssociatesENV-420兼容 Windows XP、Vista 和 7（仅限 32 位）
数字声级计33-2055
香草精McCormick Pure Vanilla Extract
便利贴Post-it3 英寸 × 3 英寸

参考文献

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