通过超性能液相色谱对细菌细胞壁进行隔离和制备，进行组成分析

本文描述的方法的目标是分离完好的细菌细胞壁（sacculi），并消化多肽（PG），以便使用超性能液态色谱（UPLC）提供信息，如多溴肽成分的身份及其浓度，甘油链的平均长度，以及链之间交叉链接所涉及的材料的分数。对于PG生物化学和多溴二苯二甲酸酯物种的详细讨论，有几个优秀的评论，描述了PG结构及其在感染，耐药性，形态形成和生长^1-6的作用。用于PG分析的高性能液态色谱（HPLC）最初由格劳纳和施瓦茨在20世纪80年代开发，最近已在米格尔·德·佩德罗和瓦尔德马尔·沃尔默的实验室中得到改进和广泛应用。以前的方法采用氨基酸分析或纸张色谱法，耗时乏味的技术不能产生准确或完整的细胞壁组件评估。

UPLC 分析可轻松地在任何能够访问超中心和 UPLC 的基础研究实验室中实施。我们下面介绍的 UPLC 方法分离了完整的沙库利，从而提供了关于其所有化学物种的全面、定量信息。这种方法可精确量化细菌群中的所有多菌肽，所有在 20 分钟的 UPLC 运行范围内。这种方法的实施只涉及基本的实验室技能，没有对材料进行重大财政投资。为了执行这种方法的步骤，研究人员只需要熟练地吹笛，准备缓冲器和酶，并调整pH，使其能够进入广泛的科学学科。本协议中使用的酶的选择取决于所分析的细菌种类:这里描述的协议对 大肠杆菌是有用的，并且通常被发现足以将沙丘利与其他格拉姆阴性生物隔离开来。建议在将这种方法应用于革兰阳性细菌时与文献协商:在这些物种中，囊菌净化历来比较困难。特别是，这种方法可能必须改变酶的选择和消化时间的长度，以适应较厚的墙壁和附属聚合物，如革兰氏阳性细菌的铁酸。本协议中的第一种酶将外膜脂蛋白（如布劳恩的脂蛋白或Lpp）附着在肽上，从而从细胞壁中释放除C-终端二（或三）肽外的所有肽。此步骤在检查肠杆菌时是必要的，但许多其他 Gram 阴性细菌没有 Lpp 等价物，因此可以跳过此步骤。第二种酶在多肽的穆拉米酸成分后特别切开，溶解形成木荷肽物种的脱糖亚单位。为了准确评估 PG 的结构，应小心消化沙库利，以防止跨桥或肽茎的任何其他部分的。

虽然HPLC对来自100多个菌株的多肽类的化学成分进行了分析，但与普遍性保护委员会技术没有进行任何分析。此外，先前的工作仅从细菌领域的一小部分对多肽进行描述，部分受 HPLC 的吞吐量的限制。因此，将这种方法传播给尽可能多的研究人员，并在普遍支持下平台上实施，对于推动对大部分尚未分类的细菌物种进行生理研究至关重要。

1. 在 2.5 毫升的媒体过夜中培养细菌文化

后冲稀释培养物 1:100 到 250 毫升新鲜介质，并增长到_{OD 600} 的 0.7-0.8。在水中准备6%的硫酸钠（SDS）溶液。

注意:SDS粉末是危险的 - 避免吸入SDS粉末;在鼻子和嘴上戴口罩。

2. 第1天 - 在一天和一夜之间进行莱辛细菌培养

1. 在稀释文化不断发展的同时，在1升烧嘴的热盘子上设置一个开水浴池。水沸腾后，将6毫升6%SDS放入50毫升聚丙烯管中，在每根管子上加入一个小搅拌棒，将管盖固定在手指紧，将管子放入水浴中，并在热板上搅拌至500转/ 时。
2. 在室温下以 5，000 ×克的速度收获 250 毫升培养物，在室温下 10 分钟，在 3 毫升介质或 1x 磷酸盐缓冲盐水中再补充颗粒。缓慢的移液器细胞悬浮到 50 毫升管中，6% 沸腾 SDS 以解化细胞（最终浓度 4% SDS），而管子则浸入沸水浴中，并将盖子重新封住，以手指紧绷。细胞悬架必须迅速转移到沸腾的SDS一旦恢复。应避免突然的环境变化，因为这可能导致细胞壁结构的错误改变。
3. 盖上开水浴池，让细胞煮沸3小时，定期检查水位，必要时重新灌装水浴。3小时后，关闭热板的加热元件，并在500 rpm下持续搅拌过夜。

3. 第2天 - 酶消化在一天的过程中进行

1. 如果 SDS 在 50 毫升管中沉淀了一夜，则将水浴煮沸 1-2 小时。打开热块至 60 °C。 在 10 mM 特里斯-HCl （pH 7.2） = 0.06% w/v NaCl 中准备 1 毫克/毫升的 Pronase E 库存，并在 60 °C 下激活质氨酶 E 至少 30 分钟。
2. 使用40万×克的超中心燃料在室温下旋转样品20分钟，以颗粒化大型PG聚合物，从而从其他细胞组件中净化样品。小心去除超细剂，然后在室温超纯水中重新填充每个颗粒。注:悬念体积取决于使用的超中注管的体积:使用至少半路填充管子但不超过管的最大体积的体积。重复离心/清洗，直到水在悬念期间不会形成气泡，指示 SDS 已完全移除（通常为三次洗涤）。如果形成白色沉淀物，请停止清洗颗粒，因为这表明圣餐聚集在一起。结块不是灾难性的，但团块与塑料和玻璃器皿紧密结合，造成大量样品损失。在这种情况下，使用团状的萨库利样本继续执行协议。
3. 在最后离心/清洗步骤中，将样品重新放在 900 μl 的 10 mM Tris-HCl （pH 7.2） + 0.06% w/v NaCl 中，并转移到 2 毫升管中，以前用小针戳在顶部的孔。在每个样品中加入 100 微克/毫升激活的 Pronase E（100 微克/毫升最终浓度），在 60 °C 下孵育 2 小时。设置不同的热块至100°C。
4. 通过在每个样品中加入 200μl 的 6% SDS 来阻止 Pronase E 消化，并将样品在 100 °C 热块中煮沸 30 分钟。将不同的热块设置为 37 °C，并在 50 m M 磷酸盐缓冲区 （pH 4.9） 中储存 1 毫克/毫升的穆拉米酶（穆塔诺利辛）。
5. 与步骤 3.2 一样，使用 400，000 ×克的超中心融合组在室温下旋转样品 20 分钟，并用室温超纯水清洗，直到 SDS 完全去除（通常三次洗涤）。悬念体积取决于使用的超中性管的体积:使用至少半路填充管子但不超过管的最大体积的体积。
6. 在最后离心/清洗步骤中，在 200 μl 的 50 mM 磷酸钠缓冲器（pH 4.9）中重新悬念样品。此体积可根据样本中的多肽罐量进行调整，并可能取决于物种。如果以前曾发布过关于感兴趣物种的 HPLC 分析报告，则可以根据这些量值来估计此卷（可以在参考⁷的补充信息中找到 HPLC PG 研究的汇编）。对于其他物种，囊素准备可以执行到此步骤，然后可以添加不同数量的悬念量来复制样本，以确定允许PG留在解决方案中的最小体积（请参阅讨论以进一步估计）。如果样品中含有更多的多肽，增加悬念体积:如果样品几乎没有多肽，则将悬念体积减少到至少 50 μl。
7. 将样品转移到 1.5 毫升管中，加入 1 毫克/毫升穆拉米达塞，最终浓度为 40 μg/ml。孵化 6-8 小时或在 37 °C 过夜。

4. 第3天 - UPLC样品的准备在最后一天进行

1. 打开热块至100°C。 在没有 SDS 的情况下煮样品 5 分钟，以阻止穆拉米酶消化。在室温下，在 16，000 ×克处进行 10 分钟的离心取样，然后将超自然（多发性现在可溶性）转移到 13 mm x 100 mm 玻璃管中。尽量恢复超自然，非常接近颗粒，而不会干扰它。
2. 通过在样品中加入 500 mM 玻酸盐缓冲区 （pH 9） 来调整 pH，最终浓度为 100 mM 玻酸盐缓冲区。玻酸盐缓冲器与减少剂氢化钠兼容。加入1-2粒氢化钠，以减少每个样品，让反应在室温下进行至少30分钟。注意:氢化钠具有高度反应性和危险性 - 避免与皮肤接触（戴手套），避免与眼睛接触（戴安全眼镜）。
3. 将样品调整到 pH 3-4（多肽等电点为 +3.5），使用 20 μl 增量使用 50% v/v 正磷酸，直到 pH 6，用 pH 指示纸测量，然后使用 2 μl 增量。注意:正磷酸具有腐蚀性和危险性 - 避免接触皮肤（戴手套），避免与眼睛接触（戴安全眼镜）。样品应冒泡，以响应添加矫形磷酸:当样品停止冒泡时，这通常表示已达到 6 的 pH。如果样品中未发生冒泡，这可能表明添加的氢氢钠量太小。在这种情况下，停止降低pH，小心地加入一两粒氢化钠，让反应5-10分钟，然后恢复pH调整。
4. 通过 0.22μm 注射器过滤器将样品直接过滤到 UPLC 小瓶中。如果沉淀物已经形成，在过滤前，通过火焰多次加热管子。如果样品不会在一天内注入 UPLC 仪器，请在 -20 °C 处冷冻过夜。样品可储存长达一年-80°C。 样品可以通过多次通过火焰解冻。
5. 将每个样品的 10μl 注入配备 C18 1.7 μm 反向相列的 UPLC 仪器和一个吸收探测器，以监测 202-208 nm。样品按顺序注射，但自动采样器功能允许多达 96 个样品分批处理。使用 50 mM 磷酸钠 （pH 4.35） + 0.4% v/v 钠 azide 溶剂 A， 和 75 mM 磷酸钠 （pH 4.95） + 15% v/v 甲醇溶剂 B. 注: 添加阿齐德钠以补偿甲醇的 205 nm 吸收， 以避免基线漂移。将流量设置为 0.25 毫升/分钟，并在 25 分钟内使用线性梯度，在 30 分钟内实现 100% 溶剂 B 和粘液肽的连续弹性。如果质谱学将用于描述 UPLC 之后的多发性，则收集分数收集器中感兴趣的峰值分数，并使用离心蒸发器干燥分数。

使用 图 1中概述的程序，最终样本应包含至少 200 μl 的清晰溶液，这些溶液已直接过滤到 UPLC 小瓶中（第 4.4 步）。在细菌样本中分离各种多发性肽的 UPLC 取决于它们在液体移动相和柱的静止阶段之间的相对溶解性。反向阶段C18柱提供强烈的疏水基质，根据疏水性和大小8分离多溴二苯甲酸酯物种:极性、低分子量的单体先阐明，后是极性、分子量较高的寡聚物（图2）。典型的 UPLC 结果显示在 图 2中，通过紫外线吸收在 202-208 nm 下检测，作为确定特定粘膜素保留时间的时间函数。这一具有代表性的结果表明，大多数粘膜肽物种之间具有清晰的分辨率，并且光谱上的强信号强度能够分析，并实现甘油链的平均长度。

图1中概述的最后一步包括调整pH和过滤任何可能堵塞 UPLC 中使用的管子小尺寸的细颗粒物。如果样品被超集中，例如，通过在第 3.5 步而不是 200 μ 中重新悬念 100μl 磷酸钠缓冲器，样本可能会变得多云，表明已经达到临界浓度，并且多发性沉淀。这种溶解度的丧失将导致第 4.4 步中使用的注射器过滤器堵塞，防止将多发性沉积到 UPLC 小瓶中，并/或堵塞 UPLC 机器导管和柱子，这些管道和柱子是昂贵的物品。反映这种异常样品处理的色谱图示例显示在图 3 中:没有峰值，导致没有任何PG组成数据。将pH数误判到远低于多兆丙肽等电点（例如，到pH2）的等电点，也可能导致多发性多发性沉淀，因此从 UPLC 分析中缺乏可辨别的峰值。

图1。萨库利准备的原理图。 此方法依赖于迭代的超浓缩，以净化 SDS 远离盆栽的萨库利。

图2。从 大肠杆 菌MG1655细胞中消化的PG的PLC色谱图的例子。 请注意，所有多肽的可比分辨率是在典型 HPLC 运行的 10% 的时间内实现的。木肽标签 - M = 单体， D = 更暗， T = 修剪器;（2，3，4，5） 表示氨基酸茎肽的数量:修改 - G = 甘氨酸取代 L - alanine ， L = 两个额外的氨基酸从普罗纳塞 E ， D = 3 ， 3 - 氨基丙酸（ DAP ） - DAP 跨桥， N = 终止氢 - 多肽。例如， D33DL 是一个具有 3aa 茎肽的更暗器，通过 DAP - DAP 跨桥连接，含有来自 Pronase E 的另外两种氨基酸。

图3。从 大肠杆菌 MG1655细胞消化的萨库利的不成功的PLC分析。 没有峰值，表明样品中不存在多头，是由于在提取到 UPLC 小瓶（第 4.4 步）之前，多发性虫会从溶液中崩溃。这种降水可能是由于多头的过度集中或pH度太低造成的。

本文的生产成本由沃特斯公司赞助。