通过超性能液相色谱对细菌细胞壁进行隔离和制备，进行组成分析

Summary

细菌细胞壁由多肽组成，多肽交叉连接的糖链大分子网络。超性能液态色谱为多肽类成分的新发现提供了高分辨率和高吞吐量。我们提出了一个隔离细胞壁（sacculi）的程序，以及随后通过 UPLC 进行分析的准备。

Abstract

细菌细胞壁对于确定细胞在生长和分裂过程中的形状至关重要，在面对各种大气中的涡轮压力时保持细胞的机械完整性。在细菌王国的不同形状和大小中，细胞壁由多肽组成，这是一个由短肽交叉连接的糖链的巨分子网络。Peptidoglycan对细菌生理学的核心重要性是其作为抗生素靶点的使用的基础，并促使遗传、结构和细胞生物学研究如何在生长和分裂过程中牢固地组装它。尽管如此，仍需进行广泛的调查，以充分描述多肽合成中的关键酶活动和细菌细胞壁的化学成分。高性能液相色谱 （HPLC） 是量化在各种环境和遗传条件下生长的细菌壁化学成分差异的有力分析方法，但其吞吐量往往有限。在这里，我们提出了一个简单的程序，通过HPLC和超性能液态色谱（UPLC）对多肽菌进行生物分析的细菌细胞壁的隔离和制备，这是HPLC的延伸，利用泵提供高达15，000 psi的超高压，而HPLC的超高压为6，000 psi。结合这里介绍的细菌细胞壁的制备，低容量的样品喷油器、采样率高、样品量小、运行时间短的检测器，将使大多数生物实验室能够获得超中心和 UPLC，实现多肽类成分和基本细菌细胞生物学的新发现。

Introduction

本文描述的方法的目标是分离完好的细菌细胞壁（sacculi），并消化多肽（PG），以便使用超性能液态色谱（UPLC）提供信息，如多溴肽成分的身份及其浓度，甘油链的平均长度，以及链之间交叉链接所涉及的材料的分数。对于PG生物化学和多溴二苯二甲酸酯物种的详细讨论，有几个优秀的评论，描述了PG结构及其在感染，耐药性，形态形成和生长^1-6的作用。用于PG分析的高性能液态色谱（HPLC）最初由格劳纳和施瓦茨在20世纪80年代开发，最近已在米格尔·德·佩德罗和瓦尔德马尔·沃尔默的实验室中得到改进和广泛应用。以前的方法采用氨基酸分析或纸张色谱法，耗时乏味的技术不能产生准确或完整的细胞壁组件评估。

UPLC 分析可轻松地在任何能够访问超中心和 UPLC 的基础研究实验室中实施。我们下面介绍的 UPLC 方法分离了完整的沙库利，从而提供了关于其所有化学物种的全面、定量信息。这种方法可精确量化细菌群中的所有多菌肽，所有在 20 分钟的 UPLC 运行范围内。这种方法的实施只涉及基本的实验室技能，没有对材料进行重大财政投资。为了执行这种方法的步骤，研究人员只需要熟练地吹笛，准备缓冲器和酶，并调整pH，使其能够进入广泛的科学学科。本协议中使用的酶的选择取决于所分析的细菌种类:这里描述的协议对 大肠杆菌是有用的，并且通常被发现足以将沙丘利与其他格拉姆阴性生物隔离开来。建议在将这种方法应用于革兰阳性细菌时与文献协商:在这些物种中，囊菌净化历来比较困难。特别是，这种....

Protocol

1. 在 2.5 毫升的媒体过夜中培养细菌文化

后冲稀释培养物 1:100 到 250 毫升新鲜介质，并增长到_{OD 600} 的 0.7-0.8。在水中准备6%的硫酸钠（SDS）溶液。

注意:SDS粉末是危险的 - 避免吸入SDS粉末;在鼻子和嘴上戴口罩。

2. 第1天 - 在一天和一夜之间进行莱辛细菌培养

1. 在稀释文化不断发展的同时，在1升烧嘴的热盘子上设置一个开水浴池。水沸腾后，将6毫升6%SDS放入50毫升聚丙烯管中，在每根管子上加入一个小搅拌棒，将管盖固定在手指紧，将管子放入水浴中，并在热板上搅拌至500转/ 时。
2. 在室温下以 5，000 ×克的速度收获 250 毫升培养物，在室温下 10 分钟，在 3 毫升介质或 1x 磷酸盐缓冲盐水中再补充颗粒。缓慢的移液器细胞悬浮到 50 毫升管中，6% 沸腾 SDS 以解化细胞（最终浓度 4% SDS），而管子则浸入沸水浴中，并将盖子重新封住，以手指紧绷。细胞悬架必须迅速转移到沸腾的SDS一旦恢复。应避免突然的环境变化，因为这可能导致细胞壁结构的错误改变。
3. 盖上开水浴池，让细胞煮沸3小时，定期检查水位，必要时重新灌装水浴。3小时后，关闭热板的加热元件，并在5....

Results

使用 图 1中概述的程序，最终样本应包含至少 200 μl 的清晰溶液，这些溶液已直接过滤到 UPLC 小瓶中（第 4.4 步）。在细菌样本中分离各种多发性肽的 UPLC 取决于它们在液体移动相和柱的静止阶段之间的相对溶解性。反向阶段C18柱提供强烈的疏水基质，根据疏水性和大小⁸分离多溴二苯甲酸酯物种:极性、低分子量的单体先阐明，后是极性、分子量较高的寡聚物（图2）。典型的 UPLC 结果显示在 图 2中，通过紫外线吸收在 202-208 nm 下检测，作为确定特定粘膜素保留时间的时间函数。这一具有代表性的结果表明，大多数粘膜肽物种之间具有清晰的分辨率，并且光谱上的强信号强度能够分析，并实现甘油链的平均长度。

图1中概述的最后一步包括调整pH和过滤任何可能堵塞 UPLC 中使用的管子小尺寸的细颗粒物。如果样品被超集中，例如，通过在第 3.5 步而不是 200 μ 中重新悬念 100μl 磷酸钠缓冲器，样本可能会变得多云，表明已.......

Discussion

此过程的关键步骤是样品准备第二天的第 3.1 步。如果 SDS 在一夜之间沉淀，或者样品在室温下储存在 4% SDS 中数周，则样品必须重新启动至少 1 小时才能重新溶解 SDS。SDS降水的一个常见原因是使用介质与钾盐，所以钾应避免在媒体，如果可能的话。如代表结果部分所述，将 pH 调整到多兆肽的等电点 （~3.5） 内也至关重要，但不要比 pH 3 低太多，否则材料可能会沉淀。最后，样品的再悬念必须发生在磷酸钠缓冲液（第3.5步）的适当体积中，这必须由研究人员进行判断。在选择磷酸钠缓冲液的悬念量时，重要的是要考虑特定细菌培养物可能产生多少粘液素材料。例如，如果最终培养量为 250 毫升（如上文所述），样品必须至少以 200 μl 磷酸钠缓冲器中重新发送。如果研究人员将方法修改为 50 毫升培养物，样品可以用 100μl 磷酸钠缓冲器或更少的缓冲剂进行再喷销。考虑一个物种中多肽的预测量也很重要:例如， 大肠杆菌 球菌含有的多肽多利坎（大约是野生大 肠杆菌 细胞¹⁰的7%），因此在100微克或更少的磷酸钠缓冲中暂停是适当的。如果难以将某些细菌物种或菌株大量（250毫升）生长，最终.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
	Amresco	E629
变溶菌酶	Sigma-Aldrich	M9901
氢化钠 （NaBH4）	Sigma-Aldrich	452882	氢化钠具有高度反应性且处理正磷酸很危险
	Sigma-Aldrich	79607	正磷酸具有腐蚀性且处理起来很危险
硼酸	Sigma-Aldrich	31146
叠氮化钠	Sigma-Aldrich	S2002	叠氮化钠是一种毒
硼酸钠	Sigma-Aldrich	221732
Millex 0.22 &μ;m 针头过滤器	Fisher	SLGVR04NL
pH 试管（pH 范围 0-6）	Fisher	M95863
50 ml 聚丙烯 Falcon 管	VWR	21008-951
13 mm x 100 mm 玻璃管	Kimble Chase	60CM13
12 mm x 32 mm 螺旋颈玻璃回收瓶	Waters	186000327C
十二烷基硫酸钠	Ambion	AM9820	SDS粉末是危险
仪器
Waters Acquity UPLC H-Class系统，包括：
Acquity UPLC H-Class样品管理器 FTN
Acquity UPLC H-Class四元溶剂管理器
Acquity UPLC BEH C18 1.7 &微量;m 色谱柱
Acquity UPLC PDA 检测器
Waters 馏分收集器 III
Acquity UPLC 30 cm 柱温箱/冷却器