通过超高效液相色谱进行组分分析的细菌细胞壁分离与制备

摘要

细菌细胞壁由肽聚糖构成，肽聚糖是一种由肽交联的糖链组成的高分子网络结构。超高效液相色谱法（UPLC）可实现对肽聚糖组分的高分辨率和高通量分析，有助于新发现。本文介绍了一种分离细胞壁（囊状体）并将其制备用于UPLC分析的实验方法。

摘要

细菌细胞壁在细胞生长和分裂过程中对维持细胞形态至关重要，并能在高达数个大气压的膨压作用下保持细胞的机械完整性。在细菌界多样的形态和大小中，细胞壁均由肽聚糖构成，后者是一种由短肽交联的糖链组成的生物大分子网络。肽聚糖在细菌生理学中的核心重要性使其成为抗生素的作用靶点，也推动了关于其在生长和分裂过程中如何被稳健组装的遗传学、结构生物学和细胞生物学研究。尽管如此，仍需开展大量研究以全面表征肽聚糖合成中的关键酶活性以及细菌细胞壁的化学组成。高效液相色谱法（HPLC）是一种强大的分析方法，可用于量化在不同环境和遗传条件下培养的细菌细胞壁化学组成的差异，但其通量通常受限。本文介绍了一种简便的细菌细胞壁分离与制备流程，用于通过高效液相色谱法（HPLC）和超高效液相色谱法（UPLC）对肽聚糖进行生物学分析。UPLC 是 HPLC 的延伸技术，采用泵送系统提供高达 15,000 psi 的超高压，而 HPLC 通常为 6,000 psi。结合本文所述的细菌细胞壁制备方法，UPLC 所具备的低体积进样器、高采样率检测器、更小的样品体积和更短的运行时间，将使大多数具备超速离心机和 UPLC 设备的生物实验室能够以高分辨率和高通量开展肽聚糖组成及基础细菌细胞生物学的新发现研究。

引言

本文所述方法的目标是分离完整的细菌细胞壁（囊状结构），并消化肽聚糖（PG），以便利用超高效液相色谱（UPLC）分析获得相关信息，例如胞壁肽组分的种类及其浓度、糖链的平均长度，以及参与链间交联的物质比例。关于肽聚糖生物化学及胞壁肽种类的详细讨论，已有若干优秀的综述文献阐述了肽聚糖的结构及其在感染、耐药性、形态发生和生长过程中的作用^1-6。用于肽聚糖分析的高效液相色谱（HPLC）最初由 Glauner 和 Schwarz 于20世纪80年代开发，近年来在 Miguel de Pedro 和 Waldemar Vollmer 实验室中得到了进一步优化并广泛应用。早期方法依赖氨基酸分析或纸层析技术，这些方法耗时且繁琐，无法对细胞壁组分进行准确或完整的评估。

任何具备超速离心机和超高效液相色谱仪（UPLC）的基本研究实验室均可轻松实施UPLC分析。我们下文介绍的UPLC方法可分离完整的囊状结构（sacculi），从而提供其中所有化学组分的全面、定量信息。该方法可在20分钟的UPLC运行时间内，实现对细菌群体中所有肽聚糖片段（muropeptides）的精确定量。该方法的实施仅需基本的实验操作技能，且无需在材料上投入大量资金。研究人员只需掌握移液、缓冲液和酶溶液的配制以及pH调节等基本技能，即可开展该方法，因此适用于广泛的科研领域。本方案中所用酶的选择取决于待分析的细菌种类；此处描述的方案适用于大肠杆菌（Escherichia coli），通常也足以用于分离其他革兰氏阴性菌的囊状结构。当将该方法应用于革兰氏阳性菌时，建议查阅相关文献；在这些菌种中，囊状结构的纯化传统上更具挑战性。特别是，可能需要根据革兰氏阳性菌更厚的细胞壁以及壁磷壁酸（teichoic acids）等辅助多聚物的存在，调整所用酶的种类和消化时间。本方案中的第一种酶可特异性切割外膜脂蛋白（如Braun脂蛋白，Lpp）与肽聚糖之间的连接，从而将Lpp的C末端二肽（或三肽）以外的部分从细胞壁上释放。此步骤在研究肠杆菌科细菌时是必要的，但许多其他革兰氏阴性菌并无Lpp类似物，因此该步骤可省略。第二种酶则特异性作用于肽聚糖中的胞壁酸组分，使构成肽聚糖片段的双糖亚基溶解。为了准确评估肽聚糖（PG）的结构，消化囊状结构时需格外小心，以避免交联桥或肽链其他部分的断裂。

尽管已有超过100个菌株、约40种细菌的肽聚糖化学组成通过HPLC进行了分析，但尚未有研究采用UPLC技术进行分析。此外，以往的研究仅表征了细菌域中极小一部分物种的肽聚糖，部分原因在于HPLC通量有限。因此，将该方法尽可能广泛地传播给研究人员，并在UPLC平台上加以实施，对于推动大量尚未分类肽聚糖细菌物种的生理学研究至关重要。

方案

1. 在2.5 ml培养基中过夜培养细菌

将培养物用新鲜培养基1:100回稀释至250 ml，并培养至OD₆₀₀为0.7–0.8。配制6%的十二烷基硫酸钠（SDS）水溶液。

警告：SDS 粉末具有危险性—— 避免吸入 SDS 粉末；佩戴覆盖口鼻的口罩。

2. 第1天 - 细菌培养物的裂解在一天内开始并过夜进行

1. 在稀释培养物生长的同时，将一个1 L的烧杯置于加热板上，设置沸水浴。当水沸腾后，将6% SDS溶液分装至50 ml 聚丙烯管中，每管6 ml，并向每管中加入一个小型搅拌子，将管盖拧紧至指紧程度，将管子放入沸水浴中，并将加热板的搅拌速度调至500 rpm。
2. 在室温下以5,000 × g离心250 ml培养物10分钟，收集菌体，并将沉淀重悬于3 ml 培养基或1x 磷酸盐缓冲液中。将细胞悬液缓慢移入盛有6%沸SDS的50 ml 管中（最终SDS浓度为4%），此时管子应完全浸没于沸水浴中，随后将管盖重新拧紧至指紧程度。细胞悬液在重悬后必须迅速转移至沸SDS中。 应避免环境条件的剧烈变化，因为这可能导致细胞壁结构发生错误改变。
3. 盖上沸水浴容器，使细胞在沸水中加热3小时，期间定期检查水位，并在需要时补充水。3小时后，关闭加热板的加热功能，继续在500 rpm下搅拌过夜。

3. 第2天 - 酶解反应在一天内完成

1. 如果SDS在50 ml 离心管中过夜后出现沉淀，将水浴锅加热煮沸额外1-2小时。开启恒温金属浴至60 °C。用10 mM Tris-HCl（pH 7.2）+ 0.06% w/v NaCl配制1 mg/ml的Pronase E储存液，并在60 °C下活化Pronase E至少30分钟。
2. 使用超速离心机在室温下以400,000 × g离心20分钟，使大分子PG聚合物沉淀，从而与其他细胞组分分离。小心移除上清液，然后将每份沉淀用室温超纯水重悬。注意：重悬体积取决于所用超速离心管的容量；应使用足以填充离心管至少一半但不超过其最大容量的体积。重复离心/洗涤步骤，直至重悬时水不再产生气泡，表明SDS已完全去除（通常需洗涤三次）。若出现白色沉淀，则停止洗涤，因为这表明囊状物正在聚集。聚集虽非严重问题，但聚集物会强烈吸附于塑料和玻璃器皿，导致样品大量损失。在此情况下，可直接使用聚集的囊状物样品继续后续操作。
3. 在最后一次离心/洗涤步骤中，将样品重悬于900 µl的10 mM Tris-HCl（pH 7.2）+ 0.06% w/v NaCl中，并转移至预先用细针在管盖上刺孔的2 ml离心管中。向每份样品中加入100 µl的1 mg/ml活化Pronase E（终浓度为100 µg/ml），在60 °C下孵育2小时。另设置一个恒温金属浴至100 °C。
4. 通过向每份样品中加入200 µl的6% SDS终止Pronase E消化反应，并将样品置于100 °C恒温金属浴中煮沸30分钟。另设置一个恒温金属浴至37 °C，并用50 mM磷酸盐缓冲液（pH 4.9）配制1 mg/ml的溶菌酶（mutanolysin）储存液。
5. 同步骤3.2，使用超速离心机在室温下以400,000 × g离心20分钟，并用室温超纯水洗涤，直至完全去除SDS（通常需洗涤三次）。重悬体积取决于所用超速离心管的容量；应使用足以填充离心管至少一半但不超过其最大容量的体积。
6. 在最后一次离心/洗涤步骤中，将样品重悬于200 µl的50 mM磷酸钠缓冲液（pH 4.9）中。该体积可根据样品中肽聚糖的含量进行调整，且可能因物种而异。若目标物种已有发表的HPLC分析报告，可依据这些定量结果估算体积（HPLC分析PG的研究汇编见参考文献⁷的补充信息）。对于其他物种，可先完成至本步骤的囊状物制备，然后向重复样品中加入不同体积的重悬液，以确定能使PG保持溶解状态的最小体积（详见讨论部分的进一步估算）。若样品中肽聚糖含量较高，则增加重悬体积；若含量较低，则将重悬体积减少至最低50 µl。
7. 将样品转移至1.5 ml离心管中，并加入溶菌酶至终浓度为40 µg/ml（即加入1 mg/ml溶菌酶）。在37 °C下孵育6-8小时或过夜。

4. 第3天 - 超高效液相色谱样品的制备在最后一天进行

1. 将加热块调至 100 °C。将不含 SDS 的样品煮沸 5 分钟，以终止溶菌酶消化反应。在室温下以 16,000 × g 离心 10 分钟，然后将上清液（此时胞壁肽已溶解）转移至 13 mm × 100 mm 玻璃管中。尽量回收尽可能多的上清液，接近沉淀物时需格外小心，避免扰动沉淀。
2. 通过向样品中加入 500 mM 硼酸盐缓冲液（pH 9），使最终硼酸盐缓冲液浓度为 100 mM，以调节 pH。硼酸盐缓冲液与还原剂硼氢化钠相容。向每个样品中加入 1–2 粒硼氢化钠进行还原，并在室温下反应至少 30 分钟。注意：硼氢化钠具有高度反应性且操作危险—— 避免接触皮肤（佩戴手套）并避免接触眼睛（佩戴护目镜）。
3. 使用 50% v/v 正磷酸逐次加入 20 µl 调节样品 pH 至 3–4（胞壁肽的等电点约为 3.5），直至 pH 指示试纸测得 pH 为 6，随后改用 2 µl 增量添加。注意：正磷酸具有腐蚀性且操作危险—— 避免接触皮肤（佩戴手套）并避免接触眼睛（佩戴护目镜）。样品在加入正磷酸后应产生气泡；当样品不再冒泡时，通常表明 pH 已达 6。若样品无气泡产生，可能表明所加硼氢化钠量不足。此时应停止降低 pH，小心加入一至两粒硼氢化钠，反应 5–10 分钟后，再继续调节 pH。
4. 将样品通过 0.22 µm 注射器滤器直接过滤至 UPLC 进样瓶中。若出现沉淀，可在过滤前将管子在火焰上多次快速通过加热。若样品当天不进行 UPLC 进样，需在 -20 °C 冷冻过夜。样品可在 -80 °C 下保存长达一年。解冻时可通过在火焰上多次快速通过实现。
5. 将每份样品取 10 µl 注入配备 C18 1.7 µm 反相柱和吸光度检测器（设定为监测 202–208 nm）的 UPLC 仪器中。样品可依次进样，自动进样器支持最多 96 个样品批量处理。流动相 A 使用 50 mM 磷酸钠（pH 4.35）+ 0.4% v/v 叠氮化钠，流动相 B 使用 75 mM 磷酸钠（pH 4.95）+ 15% v/v 甲醇。注意：添加叠氮化钠用于补偿甲醇在 205 nm 处的吸收，以避免基线漂移。设定流速为 0.25 ml/min，采用线性梯度在 25 分钟内达到 100% 流动相 B，并在 30 分钟内实现胞壁肽的连续洗脱。若计划在 UPLC 后使用质谱法对胞壁肽进行表征，可使用馏分收集器收集目标峰的馏分，并用离心浓缩仪干燥各馏分。

结果

根据图 1中所述步骤，最终样品应至少含有200 µl 经直接过滤至UPLC小瓶中的澄清溶液（步骤4.4）。细菌样品中各种肽聚糖单体的UPLC分离依赖于它们在液相流动相与色谱柱固定相之间的相对溶解度。反相C18色谱柱提供强疏水性基质，可根据肽聚糖组分的疏水性和分子大小进行分离⁸；极性小、分子量低的单体最先洗脱，而非极性、分子量较高的寡聚体随后洗脱（图 2）。图 2展示了一次典型的UPLC结果，通过202–208 nm波长下的紫外吸光度检测，得到各肽聚糖组分的保留时间。该代表性结果显示出大多数肽聚糖组分之间清晰的分离度以及全谱范围内较强的信号强度，从而可实现对肽聚糖组成的定量分析及平均糖链长度的计算。

文中概述的最后一步 图 1 涉及调节pH值并过滤可能堵塞UPLC所用管路微小通道的任何细小颗粒。如果样品浓度过高，例如通过重悬于100中 µl 步骤3.5中使用磷...

讨论

该实验流程中的一个关键步骤是样品制备第二天的第3.1步。如果SDS在过夜后发生沉淀，或样品在室温下于4% SDS中储存数周，则必须重新煮沸至少1小时，以重新溶解SDS。SDS沉淀的一个常见原因是使用含钾盐的培养基，因此应尽可能避免在培养基中使用钾。如代表性结果部分所述，另一个关键点是将pH值调节至肽聚糖的等电点附近（约3.5），但不应低于pH 3太多，否则样品可能发生沉淀。最后，样品必须在适当体积的磷酸钠缓冲液中重悬（第3.5步），该体积需由研究人员自行判断。在选择磷酸钠缓冲液的重悬体积时，应考虑特定细菌培养物可能产生的肽聚糖量。例如，若最终培养体积为250 ml（如上所述），则样品必须至少用200 µl 磷酸钠缓冲液重悬。若研究人员将方法修改为使用50 ml 培养物，则样品可用100 µl 或更少的磷酸钠缓冲液重悬。还需考虑不同菌种预计产生的肽聚糖量；例如，E. coli 原生质体所含肽聚糖显著少于野生型E. coli细胞（约为后者的7%¹⁰），因此使用100 µl 或更少的磷酸钠缓冲液重悬是合适的。如果某种细菌菌种或菌株难以大...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
蛋白酶E	Amresco	E629
来自链霉菌的溶菌酶	Sigma-Aldrich	M9901
硼氢化钠 (NaBH4)	Sigma-Aldrich	452882	硼氢化钠具有高反应活性，操作时具有危险性
正磷酸	Sigma-Aldrich	79607	正磷酸具有腐蚀性，操作时具有危险性
硼酸	Sigma-Aldrich	31146
叠氮化钠	Sigma-Aldrich	S2002	叠氮化钠为有毒物质
四硼酸钠	Sigma-Aldrich	221732
Millex 0.22 μm 注射器滤器	Fisher	SLGVR04NL
pH试纸（pH范围0-6）	Fisher	M95863
50 ml 聚丙烯Falcon管	VWR	21008-951
13 mm × 100 mm 玻璃试管	Kimble Chase	60CM13
12 mm × 32 mm 螺口玻璃回收瓶	Waters	186000327C
十二烷基硫酸钠	Ambion	AM9820	SDS粉末具有危害性
仪器设备
Waters Acquity UPLC H-Class系统，包括：
Acquity UPLC H-Class 自动进样器FTN
Acquity UPLC H-Class 四元溶剂管理器
Acquity UPLC BEH C18 1.7 µm 色谱柱
Acquity UPLC PDA 检测器
Waters 馏分收集器III
Acquity UPLC 30 cm 柱温箱/冷却器