通过超高效液相色谱进行组分分析的细菌细胞壁分离与制备

摘要

细菌细胞壁由肽聚糖构成，肽聚糖是一种由肽交联的糖链组成的高分子网络结构。超高效液相色谱法（UPLC）可实现对肽聚糖组分的高分辨率和高通量分析，有助于新发现。本文介绍了一种分离细胞壁（囊状体）并将其制备用于UPLC分析的实验方法。

摘要

细菌细胞壁在细胞生长和分裂过程中对维持细胞形态至关重要，并能在高达数个大气压的膨压作用下保持细胞的机械完整性。在细菌界多样的形态和大小中，细胞壁均由肽聚糖构成，后者是一种由短肽交联的糖链组成的生物大分子网络。肽聚糖在细菌生理学中的核心重要性使其成为抗生素的作用靶点，也推动了关于其在生长和分裂过程中如何被稳健组装的遗传学、结构生物学和细胞生物学研究。尽管如此，仍需开展大量研究以全面表征肽聚糖合成中的关键酶活性以及细菌细胞壁的化学组成。高效液相色谱法（HPLC）是一种强大的分析方法，可用于量化在不同环境和遗传条件下培养的细菌细胞壁化学组成的差异，但其通量通常受限。本文介绍了一种简便的细菌细胞壁分离与制备流程，用于通过高效液相色谱法（HPLC）和超高效液相色谱法（UPLC）对肽聚糖进行生物学分析。UPLC 是 HPLC 的延伸技术，采用泵送系统提供高达 15,000 psi 的超高压，而 HPLC 通常为 6,000 psi。结合本文所述的细菌细胞壁制备方法，UPLC 所具备的低体积进样器、高采样率检测器、更小的样品体积和更短的运行时间，将使大多数具备超速离心机和 UPLC 设备的生物实验室能够以高分辨率和高通量开展肽聚糖组成及基础细菌细胞生物学的新发现研究。

引言

本文所述方法的目标是分离完整的细菌细胞壁（囊状结构），并消化肽聚糖（PG），以便利用超高效液相色谱（UPLC）分析获得相关信息，例如胞壁肽组分的种类及其浓度、糖链的平均长度，以及参与链间交联的物质比例。关于肽聚糖生物化学及胞壁肽种类的详细讨论，已有若干优秀的综述文献阐述了肽聚糖的结构及其在感染、耐药性、形态发生和生长过程中的作用^1-6。用于肽聚糖分析的高效液相色谱（HPLC）最初由 Glauner 和 Schwarz 于20世纪80年代开发，近年来在 Miguel de Pedro 和 Waldemar Vollmer 实验室中得到了进一步优化并广泛应用。早期方法依赖氨基酸分析或纸层析技术，这些方法耗时且繁琐，无法对细胞壁组分进行准确或完整的评估。

任何具备超速离心机和超高效液相色谱仪（UPLC）的基本研究实验室均可轻松实施UPLC分析。我们下文介绍的UPLC方法可分离完整的囊状结构（sacculi），从而提供其中所有化学组分的全面、定量信息。该方法可在20分钟的UPLC运行时间内，实现对细菌群体中所有肽聚糖片段（muropeptides）的精确定量。该方法的实施仅需基本的实验操作技能，且无需在材料上投入大量资金。研究人员只需掌握移液、缓冲液和酶溶液的配制以及pH调节等基本技能，即可开展该方法，因此适用于广泛的科研领域。本方案中所用酶的选择取决于待分析的细菌种类；此处描述的方案适用于大肠杆菌（Escherichia coli），通常也足....

方案

1. 在2.5 ml培养基中过夜培养细菌

将培养物用新鲜培养基1:100回稀释至250 ml，并培养至OD₆₀₀为0.7–0.8。配制6%的十二烷基硫酸钠（SDS）水溶液。

警告：SDS 粉末具有危险性—— 避免吸入 SDS 粉末；佩戴覆盖口鼻的口罩。

2. 第1天 - 细菌培养物的裂解在一天内开始并过夜进行

1. 在稀释培养物生长的同时，将一个1 L的烧杯置于加热板上，设置沸水浴。当水沸腾后，将6% SDS溶液分装至50 ml 聚丙烯管中，每管6 ml，并向每管中加入一个小型搅拌子，将管盖拧紧至指紧程度，将管子放入沸水浴中，并将加热板的搅拌速度调至500 rpm。
2. 在室温下以5,000 × g离心250 ml培养物10分钟，收集菌体，并将沉淀重悬于3 ml 培养基或1x 磷酸盐缓冲液中。将细胞悬液缓慢移入盛有6%沸SDS的50 ml 管中（最终SDS浓度为4%），此时管子应完全浸没于沸水浴中，随后将管盖重新拧紧至指紧程度。细胞悬液在重悬后必须迅速转移至沸SDS中。 应避免环境条件的剧烈变化，因为这可能导致细胞壁结构发生错误改变。

结果

按照图1中所述步骤操作，最终样品应至少含有200 µl 直接过滤至UPLC小瓶中的澄清溶液（步骤4.4）。细菌样品中各种肽聚糖单体的UPLC分离依赖于它们在液相流动相与色谱柱固定相之间的相对溶解度。反相C18色谱柱提供强疏水性基质，可根据肽聚糖组分的疏水性和分子大小进行分离⁸；极性较强、分子量较低的单体首先洗脱，而非极性、分子量较高的寡聚体随后洗脱（图2）。典型的UPLC结果如图2所示，通过在202–208 nm波长下检测紫外吸收信号随时间的变化，确定特定肽聚糖组分的保留时间。该代表性结果展示了大多数肽聚糖组分之间良好的分辨效果以及全谱范围内较强的信号强度，从而可实现对肽聚糖组成的定量分析及平均糖链长度的计算。

如图1所示的最后一步包括调节pH值，并过滤可能堵塞UPLC所用管路微小通道的任何细小颗粒。如果样品浓度过高，例如在步骤3.5中用100 µl磷酸钠缓冲液而非200 µl重悬样品，则样品可能变得浑浊，表明已达到临界浓度，.......

讨论

该实验流程中的一个关键步骤是样品制备第二天的第3.1步。如果SDS在过夜后发生沉淀，或样品在室温下于4% SDS中储存数周，则必须重新煮沸至少1小时，以重新溶解SDS。SDS沉淀的一个常见原因是使用含钾盐的培养基，因此应尽可能避免在培养基中使用钾。如代表性结果部分所述，另一个关键点是将pH值调节至肽聚糖的等电点附近（约3.5），但不应低于pH 3太多，否则样品可能发生沉淀。最后，样品必须在适当体积的磷酸钠缓冲液中重悬（第3.5步），该体积需由研究人员自行判断。在选择磷酸钠缓冲液的重悬体积时，应考虑特定细菌培养物可能产生的肽聚糖量。例如，若最终培养体积为250 ml（如上所述），则样品必须至少用200 µl 磷酸钠缓冲液重悬。若研究人员将方法修改为使用50 ml 培养物，则样品可用100 µl 或更少的磷酸钠缓冲液重悬。还需考虑不同菌种预计产生的肽聚糖量；例如，E. coli 原生质体所含肽聚糖显著少于野生型E. coli细胞（约为后者的7%¹⁰），因此使用100 µl 或更少的磷酸钠缓冲液重悬是合适的。如果某种细菌菌种或菌株难以大.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
蛋白酶E	Amresco	E629
来自链霉菌的溶菌酶	Sigma-Aldrich	M9901
硼氢化钠 (NaBH4)	Sigma-Aldrich	452882	硼氢化钠具有高反应活性，操作时具有危险性
正磷酸	Sigma-Aldrich	79607	正磷酸具有腐蚀性，操作时具有危险性
硼酸	Sigma-Aldrich	31146
叠氮化钠	Sigma-Aldrich	S2002	叠氮化钠为有毒物质
四硼酸钠	Sigma-Aldrich	221732
Millex 0.22 μm 注射器滤器	Fisher	SLGVR04NL
pH试纸（pH范围0-6）	Fisher	M95863
50 ml 聚丙烯Falcon管	VWR	21008-951
13 mm × 100 mm 玻璃试管	Kimble Chase	60CM13
12 mm × 32 mm 螺口玻璃回收瓶	Waters	186000327C
十二烷基硫酸钠	Ambion	AM9820	SDS粉末具有危害性
仪器设备
Waters Acquity UPLC H-Class系统，包括：
Acquity UPLC H-Class 自动进样器FTN
Acquity UPLC H-Class 四元溶剂管理器
Acquity UPLC BEH C18 1.7 µm 色谱柱
Acquity UPLC PDA 检测器
Waters 馏分收集器III
Acquity UPLC 30 cm 柱温箱/冷却器