通过荧光基冰平面亲和力确定防冻蛋白的冰结合平面

摘要

防冻蛋白 （AFP） 与特定的冰平面结合，以防止或减缓冰的生长。基于荧光的冰平面亲和力 （FIPA） 分析是对确定 AFP 绑定冰平面的原始冰蚀刻方法的修改。AFP 采用荧光标记，并融入宏观单一冰晶中，并在紫外线下可视化。

摘要

防冻蛋白 （AFP） 表现在各种冷硬生物体中，以防止或减缓内部冰的生长。AFP 通过冰结合表面与特定的冰平面结合。基于荧光的冰平面亲和力 （FIPA） 分析是一种用于确定 AFP 与之结合的冰平面的修改技术。FIPA 基于确定法新社绑定冰平面的原始冰蚀方法。它在缩短的实验时间内产生更清晰的图像。在 FIPA 分析中，AFP 被荧光标记为有幻想标记或共价染料，然后慢慢融入宏观单一冰晶中，该晶体已预制成半球，并定向以确定 a 轴 和 c 轴。法新社的冰半球在紫外线下被成像，使用过滤器来阻挡非特异性光，以可视化法新社的平面。AFP 的荧光标签允许实时监控 AFP 吸附到冰中。已发现这些标签不会影响 AFP 绑定的平面。FIPA 分析还引入了将多个不同标签的 AFP 绑在同一个单一冰晶上的选项，以帮助区分其绑定平面。FIPA的这些应用有助于增进我们对AFP如何与冰结合以阻止其生长的理解，以及为什么许多产生AFF的生物会表达多种AFP等形。

引言

抗冻蛋白（AFPs）的产生是生活在冰层中环境中的一些生物体的重要生存机制。直到最近，人们还认为AFP的唯一功能是防止或减缓内部冰晶的生长，这些冰晶会阻断循环，造成组织损伤和渗透应激。不能容忍任何程度的冰冻的生物，如鱼，表达AFP，以完全抑制冰晶生长^1。其他，如草，是耐冻和表达AFP，以抑制冰的再封装，减少形成大冰晶在他们的组织^2。在低温下稳定膜是另一个功能，建议为AFP³。最近，一个新的角色被建议为法新社的南极细菌， 马里诺莫纳斯原始，从冰覆盖的咸水湖^4。这个AFP是一个更大的粘合蛋白⁵的一部分，被认为是附加细菌到冰上，以更好地获得氧气和营养^物质6。其他微生物已知分泌AFP，这可能改变它们生活⁷的冰的结构。

在一些鱼类、昆虫、植物、藻类、细菌、硅藻和真菌中发现了AFP。它们具有显著不同的序列和结构，与不同祖先在不同场合的进化相一致:然而，它们都与冰结合，并通过吸附抑制机制⁸抑制其生长。AFP各有一个特定的表面，作为其冰结合点（IBS）。这些通常通过^9-11表面残留物的现场定向突变来识别。IBS 假设将水分子排列在与特定冰平面相匹配的冰样图案中。因此，法新社形成其配体之前，绑定到它^5，12。冰飞机可以通过米勒指数来定义，不同的AFP可以与不同的平面结合。因此，I型法新社从冬季比目鱼绑定到20-21金字塔平面^13，III型法新社结合主棱镜和金字塔平面使用复合冰结合表面^11，14，而云杉芽虫法新社，一个过度活跃的法新社，同时结合到主平面和基底平面^15，16。其他过度活跃的AFP，如 MpAFP，与多个冰平面结合，如它们对单个冰晶半球^5，17的完全覆盖所示。据推测，超活性AFP结合基底平面和其他飞机的能力，可能占其活性的10倍，比适度活跃的AFP^18。虽然超活性AFP的效率是有据可查的，但它们与多个冰层结合的能力仍然不为人所知。

确定法新社飞往冰上飞机的最初方法是由查尔斯·奈特^{13，19开发的}。在这种方法中，一个宏观的单一冰晶被安装在一个空心金属棒（冷手指）上，通过将其浸入装满脱气水的半球杯中形成半球。然后，半球被淹没在AFP的稀释溶液中，在几个小时内，由通过冷手指循环的乙二醇温度控制，从法新社溶液中长出一层冰到冰晶半球。冰晶从溶液中取出，从冷手指上分离出来，放置在-10至-15°C的冰柜室中。表面用锋利的刀片刮去防冻蛋白溶液的冷冻表面薄膜，冰晶允许升华至少3小时。升华后，由AFP绑定的冰平面可视为从残余蛋白质中提取的白色蚀刻图案。冰半球可以定向到其 c轴和 斧头，定位冰的基础平面和棱镜平面，并确定蚀刻补丁的米勒指数。

在这里，我们描述了对确定法新社绑定冰平面的原始方法的修改，我们称之为荧光基冰平面亲和力^{（FIPA）11。}AFP 的荧光标记要么带有钟音标签，如绿色荧光蛋白 （GFP）^{11，16，17，20，}要么与荧光染料共价绑定到 AFP^5，21。荧光标记的AFP被吸收到一个冰晶中，并且使用与原始冰蚀实验相同的实验程序过度生长。在整个实验中，可以使用紫外线（UV）灯监测与生长的冰半球结合的AFP的程度。实验完成后，半球可以直接从冷手指上取下并成像，无需升华。然而，如果需要，半球可以留给升华，以可视化传统的冰蚀刻。对FIPA方法的修改将传统的冰蚀协议缩短了几个小时。此外，还有可能同时成像几个具有不同荧光标签的 AFP，以可视化 AFP 绑定冰平面的重叠模式。

方案

1. 生长单一冰晶

1. 拿一个干净的金属锅（直径15厘米，高4.5厘米），适合，可以漂浮在乙烯乙二醇冷却浴。
2. 准备聚氯乙烯 （PVC） 圆柱形模具，直径 4.5 厘米，高 3-4 厘米，厚 4 毫米），从管道锯断面。
   1. 一侧切一个档次（1毫米宽，2毫米高）（图1A）。
   2. 准备尽可能多的模具，可以舒适地放入锅（图1B）。
      注:一项研究表明，聚乙烯醇（PVA）可以影响冰核^22。然而，在我们的开放模具PVC系统中，我们没有遇到非典型冰层的问题。
3. 将真空润滑脂的光膜涂在每个模具的底部表面环上，即切出缺口的表面。将这个涂有油脂的凹面密封在金属平底锅上，凹槽定位于远离平底锅中心的地方。小心不要用油脂填充或阻塞凹槽。
4. 将 0.22 μm 过滤和脱气/除离子水添加到锅的中心，但在模具之外，并允许水通过凹槽慢慢进入模具。小心不要引入任何泡沫。水层应约5毫米深。
5. 将平底锅放入温度控制的乙二醇浴池中，冷却至-0.5 °C。 平底锅应该是完全水平的。如有必要，在平底锅两侧添加压载重量。
6. 锅和水达到 -0.5 °C 后，在锅中间和模具外加入一小块冰。
   1. 这将核化冰在超冷水中的生长，穿过锅和模具。每个模具底部的小缺口只能通过一个冰晶传播，导致每个模具中只有一个冰晶。
   2. 隔夜孵化形成一层冰。
7. 在接下来的三天里，每天向每个模具添加 13 毫升 4 °C 的脱气/除离子水，并在每增加一天后将乙二醇浴池的温度降至 -0.8 °C，第二天降至 -1.1 °C，第三天降至 -1.5 °C。
   1. 在那些温度下孵化过夜。
   2. 到第四天，模具应该完全装满冰。
8. 将模具从平底锅中拉下来，将冰晶从模具中推出，并存放在干净的表面（如称重船）中，在 -20 °C 冰柜中存放约 1 小时，然后再处理。
9. 与其准备许多小的单一冰晶，一个体积几升的大单冰晶可以在一个恒温孵化器中准备，正如骑士²³所描述的。如果将大冰晶保存在 -15 至 -20 °C 的冰柜中，则可储存一年或更长期。单晶部分可根据需要用锯从冰块上切开。

2. 确定冰晶的奇点和方向

1. 通过在冰柜室中观察两个交叉的极性（图1D）来确定从模具中排出的冰是否是单个晶体。
   1. 如果冰晶是单一的，则不应看到任何裂缝或不连续性，冰晶内的光向不应发生变化。
      注意:如果没有冰柜室，可以在所有需要的步骤中使用冷室，谨慎地快速工作并谨慎处理冰。
2. 由于冰的裂口，可以同时确定 c轴的方向。使用以下信息确定方向:
   1. 当 c轴与事件光完全平行时，理论上，没有光会穿过交叉的极性。如果事件光的标题与 c轴平行，则当光在交叉极性之间旋转时，均匀的多色光谱通过晶体传输。这种均匀的发射产生于冰I_h沿其 c轴²⁴的光学不活动。冰晶的基底平面对 c轴是正常的。
   2. 当 c轴与事件光进一步平行，冰晶在交叉极性之间旋转时，传输的光将每旋转 90°，传输的光将交替 0-100% 传输。
   3. 最常见的情况是 ，c轴对圆柱形冰晶的圆形平面是正常的。
3. 通过将冰晶紧紧包裹在铝箔中，用针头将一个小孔戳入基底平面上的冰（对c轴正常），并将其置于真空中 20 分钟，从而确定 a 轴的方向。
   1. 这种治疗将在基底平面上产生六边形对称性的蚀刻，其中A轴穿过六面星的顶点（图2A）。
   2. 如果需要，冰晶可以用锯子平行或垂直于六边形的一侧切割，分别用垂直于冷手指的主棱镜或次要棱镜平面安装它（图3）。

3. 将荧光标签防冻蛋白吸附到单一冰晶中

1. 将单个冰晶安装到冷手指 上（图1C），首先将一个腔钻进水晶顶部。为此，用两根直径稍异但与冷指直径相似的铝棒交替融化冰层，形成冷手指可以容纳的腔。
2. 将冷手指冷却至-0.5 °C，放在冰腔中，并将冰晶保持原位，直到它冻结到金属（图2B）。将晶体连接到手指时避免气泡，因为它们会阻碍热量从手指到棒的有效传输。
3. 用过滤过的除离子水或缓冲器填充一个直径约为冰晶两倍的半球杯，冷却至约 4 °C。 将冰块冰晶浸入杯中，去除多余的水或缓冲液，使冰晶顶部与液层大致水平，冰不会接触杯壁。
   1. 用绝缘材料盖住杯子，将温度降低到-5°C。
   2. 等待大约1小时，冰晶形成一个半球，检查其状态大约每20分钟（图2C）。
   3. 冰会通过融化和生长冰晶来形成半球杯的形状，但触摸杯壁绝不应过度生长。墙壁和半球之间至少应该有1厘米的缝隙，冷手指不应该从冰上伸出来。
4. 从冰晶中取出杯子，将荧光蛋白溶液加入最终体积为 25-30 毫升，并达到所需的分析浓度，小心保持杯中液体总体积不变。典型的 AFP 浓度为 0.1 毫克/毫升。
   1. 将冰晶重新注入杯中，使冰晶顶部与液体处于水平，冰晶不会接触杯壁（图2D）。
   2. 将冷手指温度降至 -8 °C，让蛋白质溶液冻结到冰晶中 2-3 小时，经常搅拌溶液。蛋白质溶液形成的冰在阻止冰生长之前应至少为5毫米。
5. 从杯子中取出冰晶，同时仍然附着在冷手指上。通过将冷却剂通过冷手指加热到略高于 0 °C，将冰从后者分离，并等待冰晶融化。
6. 将水晶平坦的一面放在干净的表面上，如称重盘，小心不要触摸新形成的冰，在交接前至少存放在-20°C。

4. 防冻蛋白冰平面的可视化

1. 荧光的可视化是在较暗的冰柜或冷室进行的，通过将冰晶平坦的一面放在带有波长特定激发滤光片的灯下，以激发荧光标签和相机发射过滤器以阻止任何其他非特定光。根据图案，可以估计受AFP约束的冰平面（图4）。
2. 如果没有波长特定的灯，则可以使用紫外线灯箱。
3. 传统的冰蚀刻也可以简单地通过允许冰半球在-20°C升华至少3小时，之后残留蛋白粉可能会在冰面上可见（图5）。
4. 可以重复第 2.3 步，以确定完成的冰半球 的斧头的方向。

结果

单个冰晶的准备和安装是 FIPA 程序的两个步骤，其中最常出错。确定准备好的冰晶是否为单一的，通过交叉极性体（图1D）检查它，如协议部分的第2.1步所概述。如果用于 FIPA 分析的多晶冰晶，则结果将是非晶体在半球的不连续绑定，而没有连贯的结合模式 （图 6B）。如果冰晶接口位于法新社绑定的冰层周围，最终结果可能无法解释。因此，在进入下一步之前，应仔细检查冰晶的奇点。为了增加单个冰晶用于FIPA分析的概率，应同时进行几个。

另一个常见的错误是在安装过程中将水晶面与冷手指错误地对齐。要安装垂直于冷指的主或次要棱镜面，单个冰晶必须首先以冰坑为导向，然后根据协议部分第 2.3 步中概述的星形蚀刻（图 2A和3）的方向进行切割。如果冰晶安装不对齐，最终结果将产生一个半球，其中半球赤道与冰平面的对称性不一致（图6C）。虽然这是一个可解释的结果，但它的信息量将不如正确对齐的冰晶，因为半球最大的周长在赤道（图4）...

讨论

查尔斯·奈特研制的冰蚀方法，用于确定法新社的冰平面，大大推进了对AFP冰结合机理的研究。虽然AFP的结构可以通过X射线晶体学^26，27 来解决，但没有明显的方法来推断AFP绑定在冰上的互补表面。当I型法新社从冬季比目鱼的最初特征，它被假设绑定到冰²⁸的主要棱镜平面。然而，奈特的破冰实验I型法新社显示，他们与冰¹³金字塔平面结合。这一结果促使法新社研究界重新思考法新社冰结合机制，更准确地确定^AFP9的冰结合面。奈特最初的冰蚀实验是使用从法新社产生的生物体中纯化的本地AFP完成的。随着重组 AFP 的发展和 GFP 标签的日益使用，有机会将这些研究扩展到许多其他 AFP²⁹。

将共价荧光蛋白染料，如四甲基霍胺-5-（和6）异氰酸酯（TRITC）纳入分析的想法，是在GFP融合的法新社FIPA分析¹¹成功之后才得出的。已观察到奇美荧光蛋白标签和共价染料的化学修饰，不会影响AFP的冰结合模式（图5）。与前者一起，GFP 融合到 ...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
NESLAB RTE 冷藏浴/循环器	Thermo Scientific	RTE7
乙二醇，预混防冻液/冷却剂	认证	29-3037-0	普通汽车防冻液
手指	不可用	不可用 黄铜	定制（9 厘米长，1.5 厘米外径）
球形杯	不可用		用树脂定制（外径 8 cm，内径 6 cm）
高双输出照明系统	Lightools Research	LT-99D2， Illumatools DLS 120 伏交流电， LT-9470FX， LT-9549FX	可以从 Lightools Research
Camera	Canon	EOS 50D
发射滤光片	Lightools Research	LT-9EFPVG， LT-9GFPVG， LT-9RFPVG	购买可能需要滤光片环适配器才能将滤光片安装到相机镜头上