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方法文章

通过基于荧光的冰平面亲和法测定抗冻蛋白的冰结合平面

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DOI：

10.3791/51185

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2014年1月15日

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1Department of Biomedical and Molecular Sciences, Queen's University, 2National Institute of Neurological Disorders and Stroke, Porter Neuroscience Research Center, 3Research Institute of Genome-Based Biofactory, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, 4The Robert H. Smith Faculty of Agriculture, Food and Environment, Institute of Biochemistry, Food Science, and Nutrition, The Hebrew University of Jerusalem

本文内容

摘要

抗冻蛋白（AFPs）可结合到冰晶的特定晶面，从而阻止或减缓冰晶的生长。基于荧光的冰晶面亲和性（FIPA）分析法是对原始冰蚀刻方法的一种改进，用于确定与抗冻蛋白结合的冰晶面。该方法将抗冻蛋白进行荧光标记后，使其嵌入宏观单晶冰中，并在紫外光下进行观察。

摘要

抗冻蛋白（AFPs）在多种耐寒生物中表达，以防止或减缓体内冰晶的生长。AFPs通过其冰结合表面与冰的特定晶面结合。基于荧光的冰晶面亲和性（FIPA）分析是一种经过改进的技术，用于确定AFPs结合的冰晶面。FIPA基于最初的冰蚀刻法来确定AFPs结合的冰晶面，可在更短的实验时间内获得更清晰的图像。在FIPA分析中，AFPs通过嵌合标签或共价染料进行荧光标记，然后缓慢地整合到预先形成的半球形单晶冰中，并调整其取向以确定a-轴和c-轴。在紫外光下对结合了AFPs的冰半球进行成像，利用滤光片阻断非特异性光信号，从而可视化AFPs结合的晶面。AFPs的荧光标记可实现对AFPs吸附进入冰晶过程的实时监测。研究发现，这些标记不会影响AFPs结合的晶面。FIPA分析还允许在同一单晶冰上结合多种带有不同标签的AFPs，有助于区分它们各自的结合晶面。FIPA的这些应用正在推动我们深入理解AFPs如何结合冰晶以阻止其生长，以及为何许多产生AFPs的生物会表达多种AFPs异构体。

引言

抗冻蛋白（AFPs）的产生是一些生活在含冰环境中的生物体重要的生存机制。直到最近，人们一直认为抗冻蛋白的唯一功能是阻止或减缓体内冰晶的生长，因为这些冰晶会阻塞循环系统，造成组织损伤和渗透压应激。像鱼类这样无法耐受任何程度冻结的生物，会表达抗冻蛋白以完全抑制冰晶的生长1。而另一些生物，如某些草类，则具有耐冻能力，其表达抗冻蛋白的作用是抑制冰的再结晶，从而减少其组织中大冰晶的形成2。此外，抗冻蛋白还被提出具有在低温下稳定细胞膜的功能3。最近，有研究提出一种来自南极冰封咸水湖中细菌Marinomonas primoryensis的抗冻蛋白具有新的功能4。这种抗冻蛋白是更大分子量的黏附蛋白的一部分5 ，被认为可使细菌附着于冰上，从而更易获取氧气和营养物质6。已知其他一些微生物也会分泌抗冻蛋白，这些蛋白可能改变其生存环境中冰的结构7。

在某些鱼类、昆虫、植物、藻类、细菌、硅藻和真菌中已发现抗冻蛋白（AFPs）。这些蛋白具有显著不同的序列和结构，表明它们在不同时间从不同的祖先蛋白独立进化而来；然而，它们均能通过吸附-抑制机制与冰结合并抑制其生长8。每种AFP都有一个特定的表面区域作为其冰结合位点（IBS）。这些位点通常通过定点突变表面残基的方法得以鉴定9-11。目前假说认为，IBS可将水分子排列成与冰晶特定晶面相匹配的类冰结构，因此AFP在结合之前即已形成其配体5, 12。冰晶晶面可通过其密勒指数（Miller indices）来定义，不同AFP可结合不同的晶面。例如，冬鲽鱼的I型AFP结合于20-21锥面13，III型AFP则利用复合冰结合表面同时结合主棱柱面和锥面11,14，而云杉卷叶蛾的AFP作为一种高效抗冻蛋白，可同时结合主棱柱面和基面15,16。其他高效抗冻蛋白（如MpAFP）可结合多个冰晶晶面，这一点已通过其对单个冰晶半球的完全覆盖得到证实5,17。目前推测，高效AFP能够结合基面以及其他晶面的能力，可能是其活性比中等活性AFP高出10倍的原因18。尽管高效AFP的效能已有充分文献记录，但其结合多个冰晶晶面的机制仍不清楚。

确定抗冻蛋白（AFP）结合冰面的原始方法由Charles Knight开发13,19。该方法中，将一个宏观的单晶冰固定在一根中空金属棒（冷指）上，并通过将其浸入装有脱气水的半球形杯中形成半球形冰晶。随后，将该冰半球浸入稀释的抗冻蛋白（AFP）溶液中，并通过调节流经冷指的乙二醇温度，在数小时内从AFP溶液中在冰晶半球表面生长出一层新的冰。之后将冰晶从溶液中取出，从冷指上取下，并置于-10至-15 °C的冷冻室内。用锋利的刀片刮除冰表面冻结的抗冻蛋白溶液薄膜，然后使冰晶在该环境中升华至少3小时。升华后，结合了抗冻蛋白的冰面会以白色蚀刻图案的形式显现 ，这些图案来源于残留的蛋白质。通过将冰半球定位至其c轴和a轴，可识别冰的基面（basal plane）和柱面（prism plane），并确定蚀刻区域的密勒指数（Miller indices）。

本文介绍了一种对原始方法的改进，用于确定抗冻蛋白（AFP）结合的冰晶晶面，该方法被称为基于荧光的冰晶面亲和性分析法（fluorescence-based ice plane affinity, FIPA）11。抗冻蛋白可通过嵌合标签（如绿色荧光蛋白，GFP）11,16,17,20，或通过共价连接的荧光染料5,21进行荧光标记。将荧光标记的抗冻蛋白吸附至单个冰晶表面，并采用与原始冰蚀刻实验相同的实验程序进行冰晶生长。在实验过程中，可使用紫外（UV）灯实时监测抗冻蛋白在生长中的冰半球表面的结合程度。实验结束后，可直接将冰半球从冷指上取下进行成像，无需经过升华步骤。然而，若需要，也可让冰半球继续升华，以观察传统的冰蚀刻图案。对FIPA方法的改进使传统的冰蚀刻流程缩短了数小时。此外，该方法还具备同时成像多种带有不同荧光标记的抗冻蛋白的潜力，从而可视化不同抗冻蛋白所结合的冰晶面之间的重叠模式。

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方案

1. 生长单个冰晶

  1. 取一个洁净的金属盘（直径 15 cm，高 4.5 cm），该金属盘应能放入乙二醇冷却浴中并漂浮于其上。
  2. 通过将管材切割成段，制备聚氯乙烯（PVC）圆柱形模具（直径 4.5 cm，高 3–4 cm，壁厚 4 mm）。
    1. 在模具一侧切出一个缺口（宽 1 mm，高 2 mm） （图 1A）。
    2. 准备足够数量的模具，使其能够舒适地放入金属盘中 （图 1B）。
      注意：有研究表明聚乙烯醇（PVA）可能影响冰的成核22。然而，在我们这种开放式的 PVC 模具系统中，尚未观察到异常冰形成的问题。 
  3. 在每个模具底部带缺口的环形表面均匀涂抹一层薄薄的真空润滑脂。将涂有润滑脂且带有缺口的一面密封到金属盘上，确保缺口朝向远离盘中心的方向。注意不要用润滑脂填充或堵塞缺口。
  4. 向金属盘中心区域（模具外部）加入经 0.22 μm 滤膜过滤并脱气/去离子的水，使水通过缺口缓慢进入模具内部。操作时注意避免引入气泡。水层深度应约为 5 mm。
  5. 将金属盘放入温度可控的乙二醇浴中，调节浴温至 -0.5 °C。确保金属盘完全水平。如有必要，可在盘的两侧添加配重块以保持平衡。
  6. 待金属盘和水温均达到 -0.5 °C 后，在盘中央区域（模具外部）加入一小块冰。
    1. 这将引发过冷水在整个盘内及模具中的冰晶生长。每个模具底部的小缺口仅允许一个冰晶通过，从而在每个模具中形成单一冰晶。
    2. 静置过夜，以形成一层冰。
  7. 在接下来的三天内，每天向每个模具中加入 13 ml 4 °C 的脱气/去离子水，并在每次加水后将乙二醇浴的温度逐步降低：第一天降至 -0.8 °C，第二天降至 -1.1 °C，第三天降至 -1.5 °C。
    1. 每次调节温度后均静置过夜。
    2. 到第四天时，模具应完全被冰填满。
  8. 将模具从金属盘上取下，将冰晶从模具中推出，并将其置于洁净表面（如称量舟）上，在 -20 °C 冰箱中保存约 1 小时后再进行操作。
  9. 除制备多个小型单晶冰外，还可按照 Knight23 所述方法，在恒温培养箱中制备体积达数升的大型单晶冰。若将大块单晶冰覆盖后保存于 -15 至 -20 °C 冰箱中，可稳定储存一年以上。根据需要，可用锯子从冰块上切割所需部分使用。

2. 确定冰晶的奇异性与取向

  1. 在冷冻室中，通过将冰块置于两个交叉的偏振片之间观察，判断从模具中取出的冰是否为单晶 （图1D）。
    1. 若冰晶为单晶，则不应观察到裂纹或不连续区域，且冰晶内部的光传播方向应保持一致。
      注意：若无冷冻室，可在所有必要步骤中改用低温室，但需注意操作迅速，并尽量减少对冰的接触。
  2. 由于冰具有双折射特性，可同时确定其c轴的取向。请依据以下信息判断取向：
    1. 当c轴与入射光方向完全平行时，理论上无光通过交叉的偏振片。若入射光方向相对于c轴略有倾斜，则在旋转冰晶通过交叉偏振片时，晶体将透射出均匀的多色光谱。这种均匀透射现象源于冰Ih 沿其c轴方向的光学惰性24。冰晶的基面垂直于c轴。
    2. 当c轴与入射光方向的夹角进一步增大时，在旋转冰晶通过交叉偏振片的过程中，透射光强将在每旋转90°时在0%至100%之间交替变化。
    3. 通常情况下，c轴垂直于圆柱形冰晶的圆形端面。
  3. 通过冰坑蚀法（ice pitting）25确定a轴的取向：将冰晶用铝箔紧密包裹，在铝箔上用针于基面（垂直于c轴）处刺一小孔，随后将其置于真空条件下20分钟。
    1. 该处理将在基面上形成具有六重对称性的蚀坑，其中a轴穿过六角星形的六个顶点（图2A）。
    2. 如需要，可使用锯沿六边形的一侧平行或垂直方向切割冰晶，以便将其安装成主棱柱面或次棱柱面分别垂直于冷指（图3）。

3. 荧光标记的抗冻蛋白在单个冰晶上的吸附

  1. 将单个冰晶安装到冷指上(图1C) ，首先在冰晶顶部钻出一个空腔。为此，使用两根直径略有不同但与冷指直径相近的铝棒交替加热融化冰，从而形成可容纳冷指的空腔。
  2. 将冷指冷却至 -0.5 °C，插入冰晶空腔中，并固定冰晶直至其冻结在金属表面 (图2B)。将晶体附着于冷指时应避免产生气泡，因为气泡会阻碍热量从冷指向冰晶的有效传递。
  3. 用过滤后的去离子水或缓冲液填充一个半球形杯，液体体积约为冰晶直径的两倍，并将其冷却至约 4 °C。将附着在冷指上的冰晶浸入杯中，去除多余的水或缓冲液，使冰晶顶部大致与液面齐平，且冰晶不接触杯壁。
    1. 用隔热材料覆盖杯口，并将温度降至 -5 °C。
    2. 等待约 1 小时，使冰晶逐渐形成半球形，期间每隔约 20 分钟检查一次其状态 (图2C)。
    3. 冰晶将通过融化与再生长的方式适应半球形杯的形状，但不得过度生长而接触杯壁。杯壁与半球形冰之间应至少保持 1 cm 的间隙，且冷指不应从冰中突出。
  4. 将杯从冰晶上取下，加入荧光蛋白溶液至终体积为 25–30 ml，并达到所需的分析浓度，注意保持杯内总液体体积不变。典型的抗冻蛋白（AFP）浓度为 0.1 mg/ml。
    1. 重新将冰晶浸入杯中，使冰晶顶部与液面齐平，且冰晶不接触杯壁 (图2D)。
    2. 将冷指温度降至 -8 °C，让蛋白溶液在冰晶中冻结 2–3 小时，期间频繁搅拌溶液。由蛋白溶液形成的冰层厚度应至少达到 5 mm 后方可停止冰的生长。
  5. 将仍附着在冷指上的冰晶从杯中取出。通过向冷指内通入略高于 0 °C 的冷却介质使冰晶升温，待其自然融化脱离冷指。
  6. 将冰晶平面朝下放置于洁净表面（如称量皿）上，注意勿触碰新形成的冰面，并在 -20 °C 下保存至少 20 分钟后再进行后续操作。

4. 冰晶中结合抗冻蛋白的晶面可视化

  1. 在暗化的冷冻室或低温房间中，将冰晶的平面朝下放置于带有波长特异性激发滤光片的光源下，以激发荧光标记，并使用相机发射滤光片阻挡非特异性光线，从而观察荧光信号。根据荧光分布模式，可推断出被抗冻蛋白（AFPs）结合的冰晶面 （图4）。
  2. 若无波长特异性光源，可改用紫外光灯箱进行观察。
  3. 也可通过传统冰蚀法进行观察：将冰半球在 -20 °C 下升华至少 3 小时，之后残留在冰表面的蛋白质粉末可能变得可见 （图5）。
  4. 可重复步骤 2.3，以确定完整冰半球的 a 轴取向。

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结果

制备和安装单晶冰是FIPA实验过程中最容易出错的两个步骤。判断所制备的冰晶是否为单晶的方法是通过交叉偏振片观察冰晶，具体操作如方案部分的步骤2.1所述(图1D)。如果在FIPA分析中使用了多晶冰，则抗冻蛋白（AFP）在半球表面的结合将呈现不连续状态，且缺乏一致的结合模式(图6B)。若冰晶的界面位于AFP结合的冰晶面附近，则最终结果可能无法解读。因此，在进入后续步骤之前，应仔细检查冰晶是否为单晶。为了提高获得可用于FIPA分析的单晶冰的概率，建议同时制备多个冰晶。

另一个常见错误是在安装过程中未将晶体面与冷指正确对齐。为了使主棱镜面或次棱镜面垂直于冷指，必须首先通过冰坑法确定单个冰晶的取向，然后根据星形蚀刻的取向进行切割 （图2A 和 3)，如方案部分第2.3步所述。若冰晶安装时未对准，最终结果将产生一个半球，其半球赤道与冰晶面的对称性不一致 （图6C）尽管这是一个可解释的结果，但其信息量将不如正确对齐的冰晶，因为半...

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讨论

Charles Knight 开发的冰蚀刻法用于确定抗冻蛋白（AFP）结合的冰晶面，极大地推动了抗冻蛋白与冰结合机制的研究。尽管可通过X射线 晶体学26,27解析抗冻蛋白的结构，但此前尚无明确方法推断出与抗冻蛋白结合的冰表面互补结构。当首次表征来自冬鲽鱼的I型抗冻蛋白时，曾假设其结合于冰的主棱柱面28。然而，Knight 具有开创性的I型抗冻蛋白冰蚀刻实验表明，这类蛋白实际上结合于冰的锥面13。这一结果促使抗冻蛋白研究领域重新思考抗冻蛋白与冰结合的机制，并更精确地确定抗冻蛋白的冰结合面9。Knight 最初的冰蚀刻实验使用的是从天然产生抗冻蛋白的生物体中纯化的天然抗冻蛋白。随着重组抗冻蛋白的发展以及GFP标签的广泛应用，这些研究得以拓展至更多种类的抗冻蛋白29。

将共价荧光蛋白染料（如四甲基罗丹明-5-（和6-）异硫氰酸酯（TRITC））引入分析的想法，是在GFP融合AFP的FIPA分析取得成功之后才出现的11。已有观察表明，嵌合荧光蛋白标签...

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致谢

PLD 担任加拿大蛋白质工程研究主席。本工作获得了加拿大卫生研究院向 PLD 提供的资助。本工作还得到了日本学术振兴会（JSPS）科学研究费补助金（编号 23310171）以及日本生物导向技术研究推进机构（BRAIN）的资助。我们感谢 Chris Marshall 博士和 Mike Kuiper 博士在推动 FIPA 发展方面的开创性工作。我们还感谢 Sakae Tsuda 博士为本研究部分工作提供实验设施 ，并感谢 Laurie Graham 博士协助设置荧光激发和发射滤光片。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
NESLAB RTE 制冷浴/循环器Thermo ScientificRTE7
乙二醇，预混防冻液/冷却液Certified29-3037-0常见的汽车防冻液
冷指管不可用不可用定制黄铜材质（长 9 cm，外径 1.5 cm）
半球形杯不可用不可用树脂定制（外径 8 cm，内径 6 cm）
高亮度双输出照明系统Lightools ResearchLT-99D2, Illumatools DLS 120 volts AC, LT-9470FX, LT-9549FX可从 Lightools Research 购买额外或定制的激发滤光片
相机CanonEOS 50D
发射滤光片Lightools ResearchLT-9EFPVG, LT-9GFPVG, LT-9RFPVG可能需要滤光片环适配器以将滤光片安装到相机镜头上

参考文献

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